Curcumine-geladen nanodeeltjes met lage intensiteit gefocuste ultrageluid-geïnduceerde fasetransformatie als tumorgerichte en pH-gevoelige theranostische nanoplatform van eierstokkanker

Resultaten en discussie

Voorbereiding en karakterisering van FA-FCP

Schema 1 illustreert de synthese van FA-FCP en de toepassing ervan in tumor-echografie (US) beeldvorming en combinatorische Amerikaanse chemotherapie in vitro en in vivo. Het multifunctionele theranostische middel FA-FCP werd bereid via een eenvoudige en biocompatibele zelfassemblagemethode. De TEM- en AFM-afbeeldingen van FA-FCP tonen een bolvormige structuur (Fig. 1a, inzet en aanvullend bestand 1:Figuur S1). DLS-analyse toonde aan dat FA-FCP een gemiddelde diameter van ongeveer 47 nm en een gemiddelde zeta-potentiaal van -37 mV in water had (Fig. 1a en b). Na 4  weken in water, fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), zoutoplossing en FBS, vertoonde FA-FCP stabiliteit in grootte (Fig. 1c), wat aangeeft dat de bereide FA-FCP een gunstige fysiologische stabiliteit had, waarschijnlijk als gevolg van PEG-coating en de aard van FRT [32]. Het UV-vis-NIR-spectrum van FA-FCP vertoonde de absorptiepiek van Cur, wat het bestaan ​​van Cur in FA-FCP aantoont. De Cur-laadverhouding was 125,8 ± 2,1%.

Schematische weergave van de assemblagemethode, het syntheseproces en de theranostische toepassing van de FA-FCP.

De karakterisering van FA-FCP. een Grootteverdeling van FA-FCP. Inzet is het TEM-beeld van FA-FCP. b Zeta-potentieel van FA-FCP. c Grootteverandering van FA-FCP in water, fosfaatbufferzoutoplossing (PBS), zoutoplossing en foetaal runderserum (FBS) in 28 dagen. d De UV–Vis-NIR absorptiecurve van vrije Cur (50 μg/ml) en FA-FCP (40 μg/ml).

Figuur 2 toont het Cur-afgifteprofiel van FA-FCP onder verschillende pH-omstandigheden met of zonder LIFU. Zonder LIFU-bestraling was Cur vrijgekomen bij pH =5,0 ongeveer 30% over 24 h, wat significant hoger was dan die bij pH =7,4 (5,3%). Onder LIFU (7 W, 4 min) vertoonde Cur, afgegeven bij zowel pH =5,0 als pH =7,4, echter een sterke toename. Echter, vergeleken met de Cur die vrijkwam bij pH =7,4, was de Cur die vrijkwam bij pH =5,0 (50%) duidelijk hoger dan 24 h. Deze functie maakt FA-FCP zeer nuttig in de micro-omgeving van tumoren. De uitstekende medicijnafgifte wordt toegeschreven aan (1) FRT onder zure omstandigheden zou de nanokooi kunnen demonteren en openen om de geladen Cur vrij te maken; (2) LIFU veroorzaakte de onmiddellijke faseovergang waardoor Cur gestaag uit de geëxpandeerde poreuze schaal kon ontsnappen.

Geneesmiddel cumulatieve afgifte van FA-FCP in PBS (pH =5,0/7,4) bij 37 ° C met of zonder LIFU na 3 uur. **p <0,01, vergeleken met de andere groepen

In vitro ADV-effect van FA-FCP

De FA-FCP werd blootgesteld aan LIFU met een vermogen van respectievelijk 5, 6 en 7 W en een duur van 3-5 min bij pH =7,4 of 5,0 om de beste conditie van vermogen en duur van LIFU en pH-waarde te evalueren . De Amerikaanse intensiteit vertegenwoordigt het ADV-effect. Volgens Amerikaanse afbeeldingen (Fig. 3a en b) en gemiddelde grijswaarden in Amerikaanse afbeeldingen (Fig. 3c en d), vertoonde het ADV-effect een tijd-/vermogensafhankelijke trend bij pH =7,4, met een piek bij een parameter van 7 W gedurende 5 min. Bij pH =5,0 piekte het ADV-effect echter bij een parameter van 7 W gedurende 4 min. Wanneer de parameter gedurende 3 min lager was dan 5 W, waren er onvoldoende getriggerde bubbels om Amerikaanse afbeeldingen te optimaliseren; zodra de parameter echter 7 W gedurende 4 min overschreed, stortten de meeste gegenereerde bellen in en verdwenen geleidelijk. De resultaten hierboven gaven aan dat een bepaalde stimulatie essentieel was om het ADV-effect van FA-FCP op te wekken, namelijk een vermogen van 7 W en een duur van 4 minuten bij pH =5,0.

een en b Amerikaanse afbeeldingen van FA-FCP gemengd met agarosegel bij verschillende duur en kracht van LIFU bij pH  5.0/7,4. c en d De overeenkomstige statistische gegevens van het US-signaal in Fig. 3a en b

Het targetingvermogen van FA-FCP

Een klassieke kleurstof met kleine moleculen, FITC, werd gebruikt om de nanodeeltjes te labelen. Zoals weergegeven in aanvullend bestand 1:figuur S2, vertoonde de fluorescentie-intensiteit van FITC-gelabelde FCP en FA-FCP bij dezelfde concentratie geen significant verschil, wat aangeeft dat het gelabelde FITC-hoeveelheidsverschil op FCP en FA-FCP niet van invloed kan zijn op de cel opname experiment. Fluorescentiebeelden en FCM-analyse toonden aan dat sommige FCP cellen kunnen binnendringen met een opnameverhouding van 19,5% (Fig. 4a en b), mogelijk omdat het celoppervlak enkele ferritinereceptoren heeft die de internalisatie van FCP bevorderen. Na conjugatie met FA vertoonde FA-FCP een hoog fluorescentiesignaal in cellen met een opnameverhouding van 44, 3% en een ineenstorting van de opnameverhouding (13, 8%) wanneer de cellen werden voorbehandeld met vrij FA (Fig. 4a en b). De resultaten hierboven gaven aan dat FA-conjugatie de opnameverhouding van FA-FCP grotendeels verhoogde via het FA-receptor-gemedieerde endocytose-effect.

een De confocale fluorescentiebeelden van cellen behandeld met vrije FITC en FITC gelabelde FCP, FA-FCP + FA en FA-FCP. Groene en blauwe kleuren vertegenwoordigden respectievelijk FITC- en DAPI-fluorescentie. Schaalbalk =60 um. b De FITC-fluorescentiesignaal statistische gegevens binnen cellen die zijn behandeld met gratis FITC en FITC-gelabelde FCP, FA-FCP + FA en FA-FCP door FCM. **p <0,01, vergeleken met de andere groepen. c De confocale fluorescentiebeelden van cellen die zijn behandeld met FITC-gelabelde FA-FCP en lyso-tracker rood. Groene, blauwe en gele kleuren vertegenwoordigden respectievelijk FITC, DAPI en groen/blauw samengevoegde fluorescentie. Schaalbalk =60 um

Verder werd de organellokalisatie van FA-FCP onderzocht met behulp van een lysosoom-specifieke kleurstof (Lyso-Tracker Red). Zoals getoond in Fig. 4c vertoonden FA-FCP- en Lyso-Tracker Red-behandelde cellen respectievelijk sterke groene en rode fluorescentie in het cytoplasma. Na het samensmelten van groen en rood was intense gele fluorescentie zichtbaar in het cytoplasma, wat aangeeft dat FA-FCP kon verhuizen naar lysosomen (pH ≈ 5,0), wat gunstig was voor het op gang brengen van de geneesmiddelafgifte in de cellen.

Bloedcirculatie en tumoraccumulatie van FA-FCP

Zoals getoond in Fig. 5a, was de halfwaardetijd van FA-FCP ongeveer 7,31 h (een 8-voudige toename), vergeleken met die van vrije Cur, waarschijnlijk als gevolg van de PEG-coating en FRT-inkapseling. Deze verlengde halfwaardetijd van FA-FCP in de bloedbaan is gunstig voor het verbeteren van de retentie van geneesmiddelen in de systemische circulatie, waardoor de accumulatie van geneesmiddelen op tumorplaatsen wordt vergemakkelijkt [32, 33]. Verder wordt de dynamische accumulatie van vrij Cur en FA-FCP in de tumor van 0 uur tot 24 uur na injectie van het nanodeeltje getoond in figuur 5b. Zoals te zien is, vertoonde FA-FCP de hoogste accumulatie van 18 h en vrij Cur vertoonde de hoogste accumulatie van ongeveer 1 h na injectie. Deze resultaten geven aan dat in vergelijking met vrij Cur, FA-FCP een significant hogere accumulatieprestatie in het tumorweefsel had, mogelijk vanwege de verbeterde permeabiliteit en retentie (EPR) en het FA-receptor-gemedieerde actieve targeting-effect [34, 35].

een De bloedcirculatie van vrij Cur en FA-FCP na injectie in muizen. b Het gehalte aan vrij Cur en FA-FCP in tumorweefsel na injectie in tumordragende muizen. **p <0,01, vergeleken met de andere groepen

In vivo Amerikaanse beeldvorming

De tumor van naakte muizen behandeld in vier groepen (blanco controle + LIFU, FCP + LIFU, FA-FCP + LIFU, FA-FCP zonder LIFU) werd waargenomen met of zonder blootstelling aan LIFU (7 W, 4 min) om verder te onderzoeken het ADV-potentieel van FA-FCP in vivo. Zoals getoond in Fig. 6a, werd er geen duidelijk US-signaal waargenomen in de tumor onder LIFU-bestraling in de controlegroep. 18  h na injecties werd een significant sterker US-signaal gezien in de tumor in de FA-FCP + LIFU-groep vergeleken met de groepen met FCP + LIFU en FA-FCP zonder LIFU (Fig. 6a en b). De resultaten toonden aan dat FA-FCP + LIFU het Amerikaanse beeldvormingscontrast van de tumor zou kunnen verbeteren.

een Amerikaanse beelden van respectievelijk tumor in controle + LIFU, FCP + LIFU, FA-FCP + LIFU en FA-FCP zonder LIFU-groepen. b De kwantitatieve gemiddelde grijswaarden van Amerikaanse afbeeldingen van de tumorplaats in verschillende groepen. **p <0,01, vergeleken met de andere groepen

In vitro en in vivo antikankertherapie

In vitro cytotoxiciteit van FA-FCP werd onderzocht met CCK-8-assay. Zoals getoond in Fig. 7a, vertoonde de cellevensvatbaarheid van alle groepen een Cur-concentratie-afhankelijk patroon. Zonder LIFU, vergeleken met vrij Cur, vertoonde FA-FCP een hogere remming van de levensvatbaarheid van de cellen bij alle concentraties, mogelijk als gevolg van het FA-targeting-effect. De remming van de levensvatbaarheid van de cellen van FA-FCP + LIFU was echter significant hoger dan die van FP + LIFU, FCP + LIFU en FA-FCP zonder LIFU, wat aangeeft dat FA-FCP in combinatie met LIFU-bestraling een betere anti-tumor efficiëntie bood. Dit resultaat was voornamelijk te wijten aan de aanwezigheid van LIFU en de zure omgeving van het lysosoom, die beide de geneesmiddelafgifte en het cavitatie-effect zouden kunnen induceren, en het FA-gemedieerde doeleffect van tumorcellen [36,37,38].

een Levensvatbaarheid van de cellen van SK-OV-3-cellen geïncubeerd met verschillende concentraties van Cur, FP + LIFU, FA-FCP, FCP + LIFU en FA-FCP + LIFU. b Relatief tumorvolume van tumordragende naakte muizen in respectievelijk de groepen Cur, FP + LIFU, FA-FCP, FCP + LIFU en FA-FCP + LIFU. **p <0,01, vergeleken met de andere groepen. c Tumorgewicht na behandeling van tumordragende naakte muizen in respectievelijk de groepen Cur, FP + LIFU, FA-FCP, FCP + LIFU en FA-FCP + LIFU. **p <0,01, vergeleken met de andere groepen. d Lichaamsgewicht van tumordragende naakte muizen in controle, respectievelijk Cur, FP + LIFU, FA-FCP, FCP + LIFU en FA-FCP + LIFU-groepen.

In vivo antikanker effect van de FA-FCP werd verder onderzocht met tumordragende naakte muizen. Volgens het resultaat van tumoraccumulatie van FA-FCP, werd LIFU 18 uur na intraveneuze injectie van monsters elke 2 dagen gedurende in totaal drie keer vanaf dag één uitgevoerd. Zoals getoond in Fig. 7b en c, nam het relatieve tumorvolume in de FA-FCP + LIFU-groep significant af, vergeleken met de controle-, Cur-, FA-FCP-, FP + LIFU- en FCP + LIFU-groepen na 24 dagen behandeling. Het tumorgewicht in de FA-FCP- en FCP + LIFU-groepen was significant lager dan dat in de controle- en Cur-groepen, terwijl het zelfs meer werd geremd in de FA-FCP + LIFU-groep. Tijdens de behandeling was er geen significant verlies van lichaamsgewicht in deze groepen (Fig. 7d). Het briljante antitumoreffect van FA-FCP in combinatie met LIFU was voornamelijk te wijten aan de doelgerichte aggregatie van FA-FCP in tumor en akoestiek/pH-responsief medicijnafgiftevermogen [39,40,41]. Bovendien kan deze verbeterde anti-tumor therapeutische werkzaamheid van de FA-FCP + LIFU worden verklaard door de vertraagde klaring van de nanodeeltjes op de plaats van de tumor als gevolg van de verlengde halfwaardetijd van FA-FCP in de bloedbaan [42].

In vitro en in vivo biocompatibiliteit

In vitro en in vivo biocompatibiliteit van FA-FCP werden geëvalueerd door CCK-8-assay en H&E-kleuringsanalyse. Zoals getoond in Fig. 8a en b, waren de cellevensvatbaarheid van de medicijndragende FA-FP en het vermogen van LIFU van 0 tot 8 W allemaal> 90%, wat aangeeft dat er geen significante cytotoxiciteit van het FA-FP en de kracht van LIFU gebruikt is in dit werk in vitro. Figuur 8c toont de H&E-kleuringsbeelden van de belangrijkste organen van de muizen die zijn behandeld met FA-FCP + LIFU, die geen histologische veranderingen vertonen in vergelijking met de controlegroep. Deze resultaten toonden de hoge biocompatibiliteit van FA-FCP in vitro en in vivo aan.

een Levensvatbaarheid van de cellen van SK-OV-3-cellen na 24 h geïncubeerd met FA-FP. b Cellevensvatbaarheid van SK-OV-3-cellen na behandeling door verschillende kracht van LIFU. c H&E-kleuring van de belangrijkste organen van de controlegroep en de FA-FCP-groep 24 dagen na intraveneuze injectie met nanodeeltjes (×200)