Goudnanodeeltjes-gemodificeerde 6-mercaptopurine en rabies-afgeleide peptide verhogen SH-SY5Y neurale celproliferatie en neurietuitgroei

Samenvatting

Neuroregeneratie vereist biomaterialen die neurale proliferatie en axale uitgroei kunnen stimuleren. Hier presenteren we een nieuw neurophisch platform: goudnanodeeltjes (AuNPs) gefunctionaliseerd met 6-mercaptopurine (6MP) en een neuron-penetrerend peptide (RDP). Wanneer SH-SY5Y neuroblastomacellen werden blootgesteld aan 6MP-AuNPs-RDP conjuugaten, namen metabolische activiteit en neurietlengte merkbaar toe ten opzichte van controles. Belangrijk is dat cellen die uit cryoconservatie herstelden, deze groeivoordelen behielden, wat robuuste tolerantie voor het nanomateriaal aangeeft. Deze bevindingen ondersteunen de ontwikkeling van 6MP-AuNPs-RDP als een veilig en effectief neurophisch nanomateriaal.

Achtergrond

Effectieve bevordering van neurale proliferatie en neurietuitgroei is een hoeksteen van regeneratieve strategieën voor neurodegenerative ziekten zoals Alzheimer, Parkinson en beroerte (1–4). Oppervlaktechemie van biomaterialen kan celmorfologie, proliferatie en differentiatie moduleren, wat een veelbelovende route biedt naar neurophische agentia (5,6). Goudnanodeeltjes (AuNPs) zijn aantrekkelijk geworden in biomedische toepassingen door hun eenvoudige synthese, oppervlakteversatiliteit, lage toxiciteit en biocompatibiliteit (7,8). Eerder werk toonde aan dat goudnanostaven gecombineerd met lage-vermogen laserblootstelling neurieten van NG108-15 cellen tot 25 µm konden verlengen (9).

6-Mercaptopurine (6MP) is een anti-inflammatoir geneesmiddel dat aan AuNPs bindt via Au–S-bindingen, wat functionalisatie mogelijk maakt (10). Hoewel 6MP-AuNPs gebruikt zijn voor kwantitatieve medicijnsensing (11), blijven hun cellulaire effecten ononderzocht. We onderzochten daarom 6MP-AuNPs en een neuron-gericht peptide (RDP) in het humane neuroblastoma SH-SY5Y model, gekozen voor zijn hoge omgevingsgevoeligheid en relevantie voor neurale biomateriaalstudies.

Methoden / Experimenteel

Synthese van 6MP-AuNPs-RDP Conjugaat

20 nm citraat-gecoate AuNPs werden bereid door de klassieke Turkevich-reductie van HAuCl₄·3H₂O (0,01 %) met natriumcitraat (38,8 mM). 6MP (0,046 nM) en AuNPs (0,33 mM) werden 5 u bij kamertemperatuur geïnculeerd, gecentrifugeerd bij 17.000 g gedurende 30 min. Het pellet werd driemaal gewassen met gedioniseerd water. Voor RDP-modificatie werd het peptide (0,023 nM) gecoïncubeerd met het AuNP/6MP-mengsel onder identieke omstandigheden. Een gescrambled FAM-gelabeld peptide (FAM-SP) diende als controle. Deeltjes werden heropgelost in 0,1 M NaOH (pH 9,0), gefiltreerd (0,22 µm) en opgeslagen bij 4 °C.

Deeltjeskarakterisatie

UV/Vis-spectra werden opgenomen met een Shimadzu UV-2450. Grootteverdeling en zeta-potentiaal werden gemeten met Malvern Zetasizer Nano ZS na verdunning. Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM, Shimadzu) bevestigde sferische morfologie.

Celkweek

SH-SY5Y cellen werden onderhouden in DMEM/F-12 (1:1) aangevuld met 10 % FCS, 100 U/mL penicilline en 100 µg/mL streptomycine bij 37 °C, 5 % CO₂.

Celopname-assay

Cellen (5 × 10⁴ cellen/put) werden geïnculeerd met 0,25 µg/mL FAM-gelabelde 6MP-AuNPs-RDP of 6MP-AuNPs-SP gedurende 2 u. Fluorescentiemicroscopie (Olympus) en spectrofluorometrie (Hitachi) kwantificeerden internalisatie.

Invloed op neurale groei

Voor proliferatie werden cellen gezaaid bij 5 × 10⁵ cellen/put en behandeld met 0–1,0 µg/mL 6MP-AuNPs-RDP gedurende 24 u. Celtaantallen (Bio-Rad geautomatiseerde teller) en MTT-metabolische activiteit (490 nm) werden beoordeeld. Neurietlengte werd gemeten na 3 dagen van dagelijkse 0,25 µg/mL behandeling met ImageJ. Oppervlakte-gecoate schalen (3,5 cm) werden ook bereid om neurietuitbreiding op een nanodeeltjeslaag te evalueren.

Statistische analyse

Data (n = 4) worden uitgedrukt als gemiddelde ± SEM en geanalyseerd met one-way ANOVA met Dunnett's toets (SPSS 13.0). p < 0,05 duidt significantie aan.

Resultaten

Nanodeeltjes uiterlijk en fysicochemische eigenschappen

AuNPs vertoonden een rode kleur; na 6MP-toevoeging werd de oplossing donker, vormend een blauwzwart neerslag na 5 u. Oplossen bij pH 9,0 leverde een rooskleurige oplossing op, die bij pH 7,4 opnieuw neersloeg. DLS onthulde een gemiddelde diameter van 20,5 nm voor 6MP-AuNPs en 24,6 nm voor 6MP-AuNPs-RDP; zeta-potentialen waren −37,2 mV en −25,8 mV respectievelijk (figuur 2c,d). TEM bevestigde sferische morfologie.

Verbeterde celopname via RDP

Bij pH 7,4 aggregeerde 6MP-AuNPs-RDP minder en vertoonde een prominente pericellulaire plaak, terwijl 6MP-AuNPs uitgebreide aggregaten vormden (figuur 3a). Fluorescentiebeeldvorming toonde een sterk intracellulair signaal voor 6MP-AuNPs-RDP vergeleken met zwak signaal voor 6MP-AuNPs-SP (figuur 3b-d), wat aangeeft dat RDP de nanodeeltjesinternalisatie aanzienlijk verhoogt.

Bevordering van proliferatie en metabolische activiteit

Zowel 6MP-AuNPs als 6MP-AuNPs-RDP verhoogden celtaantallen en MTT-absorbantie in een dosis-afhankelijke manier; effecten waren sterker voor de RDP-geconjugeerde deeltjes (figuur 4a,b). RDP alleen veranderde groei niet.

Neurietuitgroei verbetering

Na 24 u blootstelling aan 1,0 µg/mL deeltjes, vertoonden cellen behandeld met 6MP-AuNPs-RDP significant langere neurieten dan controles en 6MP-AuNPs (figuur 5a,b). RDP alleen had geen effect. Toegepast als oppervlaktecoating, versnelde 6MP-AuNPs-RDP neurietuitbreiding en vergemakkelijkte internalisatie doorheen het cytoplasma en kern (figuur 6d,e).

Effect van cryoconservatie

Cellen voorbehandeld met 1,0 µg/mL 6MP-AuNPs-RDP behielden verbeterde proliferatie en neurietlengte na ontdooiing, wat robuuste tolerantie voor cryogene opslag aantoont (figuur 7a-c).

Discussie

Conclusies

Goudnanodeeltjes gefunctionaliseerd met 6-mercaptopurine en het rabies-afgeleide peptide RDP vormen een krachtig neurophisch nanomateriaal dat neurale proliferatie en neurietuitbreiding bevordert terwijl biocompatibiliteit behouden blijft. Deze bevindingen ondersteunen verdere ontwikkeling van 6MP-AuNPs-RDP voor therapeutische strategieën in neuroregeneratie.

Afkortingen

6MP

6-Mercaptopurine

AD

Alzheimer ziekte

AuNPs

Goudnanodeeltjes

DLS

Dynamische lichtverstrooiing

DMEM

Dulbecco's modified Eagle's medium

DMSO

Dimethylsulfoxide

FCS

Fetale kalverseerum

MTT

3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromide

PD

Parkinson ziekte

RDP

Rabiesvirus-afgeleide peptide

TEM

Transmissie-elektronenmicroscopie