Efficiënte Een-Staps Groene Synthese van Multifunctionele Goud Nanodeeltjes voor Gerichte Tumor Imaging en Therapie

Samenvatting

Goud nanodeeltjes (GNPs) zijn altijd gebruikt als doxorrubicine (DOX) transportvectoren voor tumor diagnostiek en therapie; echter, het syntheseproces van deze vectoren is om GNPs te bereiden via chemische reductiemethode eerst, gevolgd door conjugatie met DOX of specifieke peptiden, dus deze methoden verwijderen enkele gemeenschappelijke problemen met inbegrip van meerdere stappen, hoge kosten, tijdrovend, gecompliceerde bereiding, en na-verwerking. Hier presenteren we een een-staps strategie om de DOX-geconjugeerde GNPs te bereiden op basis van DOX's chemische constitutie voor de eerste keer. Bovendien bereiden we een multifunctionele GNPs (DRN-GNPs) met een een-staps methode met de hulp van de reductieve functionele groepen bezit door DOX, RGD peptiden, en kernlokalisatie peptiden (NLS), wat slechts 30 min nodig heeft. De resultaten van verstrooiingsafbeeldingen en cel TEM studies gaven aan dat de DRN-GNPs de Hela cellen' kern kunnen targeten. De tumorinhibitiepercentages van DRN-GNPs via tumor en staartadertjes injectie van naakte muizen waren 66,7% en 57,7%, respectievelijk, wat significant verbeterd was vergeleken met controlegroepen. Eén stap synthese van multifunctionele GNPs bespaart niet alleen tijd, materialen, maar is ook in lijn met de ontwikkelingsrichting van groene chemie, en het zou de basis leggen voor grootschalige toepassingen in de nabije toekomst. Onze resultaten suggereerden dat de fabricagestrategie efficiënt is, en onze bereide DRN-GNPs bezitten goede colloidale stabiliteit in het fysiologische systeem; ze zijn een potentieel contrastmiddel en een efficiënte DOX transportvector voor baarmoederhalskanker diagnostiek en therapie.

Inleiding

Doxorrubicine (DOX) is een veelgebruikte antikankermedicijn die breed is gebruikt in een verscheidenheid aan kankerchemotherapieën, zoals bloedmaligne tumor [1], een verscheidenheid aan adenocarcinomen [2,3,4,5], zachte weefsel sarcoom [6], en zo verder. Echter, langdurige en hoge doseringen van DOX zullen leiden tot medicijnresistentie [7], misselijkheid [8], haaruitval [9], en acute en chronische toxiciteit [10], wat kan leiden tot congestieve hartfalen [11]. Daarom is het zeer noodzakelijk om een medicijndrager te ontwikkelen met goede biocompatibiliteit en hoge medicijnladingscapaciteit. In recente jaren zijn veel nanomaterialen, zoals kwantumdots [12, 13], chitosaan [14, 15] silicium nanomaterialen [16, 17], polymere nanomaterialen [18,19,20], fluorescente nanodeeltjes [21,22,23,24], en metaal nanomaterialen [25,26,27,28,29,30] ontwikkeld als DOX transportvectoren voor tumor diagnostiek en therapie. Goud nanomaterialen zijn breed gebruikt vanwege hun unieke chemische en optische eigenschappen, lage toxiciteit, goede biocompatibiliteit, en oppervlaktemodificatie controleerbaarheid [31, 32] onder deze nanomaterialen. Tot nu toe zijn er drie soorten benaderingen voor de conjugatie van DOX op GNPs. De eerste is om DOX te conjugeren op het oppervlak van GNPs met de hulp van hydrazine [25], 1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride (EDC) [26], pH-gevoelig agent [27], DCC/NHS systeem [28]. De tweede is om GNPs te incuberen met DOX voor ten minste 24 uur [29]. De derde is om citraat geconjugeerd op het oppervlak van goud nanodeeltjes (GNPs) te vervangen door DOX [30]. Hoewel deze DOX-geconjugeerde GNPs zijn gebruikt in tumortherapie, is de toepassing nog steeds beperkt door het gebrek aan voldoende specificiteit. Recentelijk functionnaliseerde El-sayed's [27] groep GNPs met DOX, RGD peptiden, en nucleaire lokalisatie signaal (NLS) peptiden. Het hoogtepunt van hun werk is dat de GNPs tumorcellen binnenkomen via receptor-gemedieerde endocytose van RGD peptiden en dan de kern binnenkomen met de hulp van NLS peptiden, wat DOX effectief laat interfereren met DNA synthese. Helaas had het ten minste 120 uur nodig door peptiden of geneesmiddelen laag voor laag op de GNPs te koppelen, en elk proces had ten minste 24 uur nodig. Op dezelfde manier confronteerden alle bovengenoemde methoden enkele gemeenschappelijke problemen zoals meerdere stappen, hoge kosten, gecompliceerde bereiding, en na-verwerking. Dus is het noodzakelijk om een eenvoudige en snelle methode te ontwikkelen voor de synthese van multifunctionele goud nanomaterialen.

In dit papier presenteren we een een-staps strategie om de DOX-geconjugeerde GNPs te bereiden op basis van DOX's chemische constitutie voor de eerste keer. Bovendien presenteren we een handige synthetische methode om een multifunctionele DOX transportvector te bereiden om DOX beter te laten werken, wat kan worden gebruikt in tumor diagnostiek en therapie. Het belangrijkste verschil tussen ons werk en anderen is dat we de DOX, RGD peptiden, en NLS peptiden gebruiken als reductiemiddelen en stabiliserende middelen om de GNPs te fabriceren en al deze drie stoffen tegelijkertijd op het oppervlak van de GNPs te conjugeren om DRN-GNPs te vormen. Onze eerdere werken [33,34,35] hadden bewogen dat de RGD en andere peptiden kunnen worden gebruikt om goudionten te reduceren om goud nanomaterialen te fabriceren. De N-terminaal van de NLS kan gemodificeerd worden door gebruik te maken van cysteine cysteine tyrosine (CCY) sequentie om CCYNLS te construeren, wat goudionten kan reduceren terwijl nog steeds NLS's targeting effect behoudt [36]. We vonden ook dat DOX twee fenolische hydroxylgroepen bezit met sterke reduceerbaarheid onder basische conditie [37, 38], dus het kan goudionten reduceren om de GNPs te vormen ook. Tegelijkertijd kan het antikankereffect van DOX niet beïnvloed worden omdat het in DNA inbeddt door de aminogroep van koolstof 7 en de hydroxylgroep van koolstof 9 [39]. In de tussentijd kunnen de zwavel, zuurstof, en stikstof op de peptiden en DOX gecombineerd worden met de GNPs om de colloidale stabiliteit te bewaren [33]. De resultaten tonen aan dat de DRN-GNPs succesvol waren gefabriceerd en goed werkten in tumor imaging, diagnostiek, en therapie (Schema 1). Onze kennis naar is dit het eerste rapport voor synthese van DOX, RGD, en NLS peptiden geconjugeerde multifunctionele GNPs met een een-staps methode, en hun toepassing in tumor diagnostiek en therapie.

Schematische illustratie van de synthese van DRN-GNPs, de opname door Hela cellen en de tumor diagnostiek van DRN-GNPs

Materialen en Methodes

Materialen

HAuCl₄ 4H₂O werd gekocht van Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd, cyclische RGD peptiden (de aminozuur sequentie is arginine-glycine-aspartaat-tyrosine-glutaminezuur (c(RGDyE))) en natriumhydroxide waren hetzelfde als ref. [35]. Doxorrubicine werd gekocht van Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. CCYNLS peptiden (de aminozuur sequentie is cysteine-cysteine-tyrosine-proline-proline-lysine-lysine-lysine-arginine-lysine-valine, CCYPPKKKRKV) werden geleverd door China Peptides Co., Ltd (Shanghai, China). De Hela cellijn en de MCF-7 cellijn werden verstrekt door Guangzhou Youdi Biological Technology Co. Ltd. Foetaal kalfserum (FBS) en Dulbecco modified Eagle's medium (DMEM) werden gekocht van GibcoBRL Life Technologies. De Proliferatie en Cytotoxiciteit Assay Kit (MTT) werd gekocht van Beijing Dingguo Changsheng Biotechnology Co. Ltd.

Synthese van DOX-GNPs, NLS-GNPs, DR-GNPs, DN-GNPs, DRN-GNPs

Voor de bereiding van de DOX-GNPs, werd DOX oplossing (0,2 mg/mL, 1,0 mL) toegevoegd aan de chloraurinezuur oplossing (0,86 mM, 1,0 mL) onder magnetische roering, toen NaOH (2 M, 5 μL) werd toegevoegd om pH aan te passen. Voor de bereiding van NLS-GNPs, werd CCYNLS peptiden oplossing (0,5 mM, 1,0 mL) toegevoegd aan de chloraurinezuur oplossing (3,44 mM, 1,0 mL) onder magnetische roering, toen NaOH (2 M, 20 μL) werd toegevoegd om pH aan te passen. Voor de bereiding van DR-GNPs, werd DOX oplossing (0,2 mg/mL, 1,0 mL) en RGD peptiden oplossing (1,0 mM, 1,0 mL) toegevoegd aan de chloraurinezuur oplossing (1,72 mM, 2,0 mL) onder magnetische roering, toen NaOH (2 M, 15 μL) werd toegevoegd om pH aan te passen. Voor de bereiding van DN-GNPs, werd DOX oplossing (0,2 mg/mL, 1,0 mL) en CCYNLS peptiden oplossing (0,5 mM, 1,0 mL) toegevoegd aan de chloraurinezuur oplossing (1,72 mM, 2,0 mL) onder magnetische roering, toen NaOH (2 M, 20 μL) werd toegevoegd om pH aan te passen. Voor de bereiding van DRN-GNPs, werden oplossingen van DOX (0,2 mg/mL, 1,0 mL), CCYNLS peptiden (0,5 mM, 1,0 mL), en RGD peptiden (1,0 mM, 1,0 mL) toegevoegd aan de chloraurinezuur oplossing (1,72 mM, 3,0 mL) onder magnetische roering, toen NaOH (2 M, 35 μL) werd toegevoegd om pH aan te passen. Alle reacties gingen door voor 30 min bij 100 °C in een reflux systeem en de pH waarde was 10–12. Alle GNPs werden gezuiverd door centrifugatie bij 55.000 toer/min voor 30 min (Optima MAX-TL, Beckman Coulter). Na het wegnemen van het supernatans, werden de GNPs hergedispergeerd in ultrazuiver water.

Karakterisering

De karakteriseringen van de GNPs' spectra werden geïmplementeerd door gebruik te maken van een UV 3150 Spectrofotometer (Shimadzu, Japan), een Nicolet Avatar FTIR model 330 spectrometer (Thermo, Amerika), en een ESCALab250 Röntgenfotoelektronenspectroscopie (XPS) met dezelfde analytische condities als ref. [35]. De transmissie elektronenmicroscopie (TEM) afbeeldingen van de GNPs werden verkregen van een TEM (JEM-2100F, JEOL, Japan) bediend bij een versnellingsvoltage van 200 kV.

Dynamische Lichtverstrooiing en Zeta-Potentiaal Metingen

Een Zeta PALS Zeta Potentiaal Analyzer (Brookhaven Instrument Corporation) werd gebruikt om de dynamische lichtverstrooiingen (DLS) van de DOX–GNPs, NLS-GNPs, DR-GNPs, DN-GNPs, en DRN-GNPs te meten, wat werkte bij 90° hoek met een vastestat laser (λ = 670 nm) bij kamertemperatuur. Wanneer uitgerust met een AQ-827 elektrode, werd de analyzer gebruikt om de GNPs' zeta-potentialen te meten.

ICP Analyse

De kwantitatieve analyse van Au in de GNPs was hetzelfde als ref. [35].

De Stabiliteit van DR-GNPs, DN-GNPs, en DRN-GNPs Gedispergeerd in PBS, HCl, NaOH, NaCl Oplossing

We mengden 100 μL van de uitgezakte GNPs en 500 μL van hoge concentratie van 0,2 M PBS, 0,5 M HCl, 0,5 M NaOH, en 1,0 M NaCl oplossing, respectievelijk. Twaalf uur later namen we hun foto's en testten hun UV absorptiespectra.

Celcultuur

De Hela en MCF-7 cellen werden gekweekt in een broeikast (vervochtigd met 5% CO₂ gebalanceerde lucht) bij 37 °C voor 24 uur. Het cultuurmedium was DMEM met 10% FBS. Het aantal levende cellen werd geteld door een cel-telbord.

Cytotoxiciteit Assay van Vrije DOX en DRN-GNPs

De Hela en MCF-7 cellen in de exponentiële fase werden toegevoegd aan de putten van 96-put platen (ongeveer 5 × 10³ cellen/put) en geïncubeerd voor 24 uur, respectievelijk. Vervolgens werden de DRN-GNPs van concentraties 0, 20, 40, 60, 80, en 100 μg/mL (de corresponderende DOX's concentratie was 0,0, 7,8, 15,6, 23,4, 31,2, en 39,0 μg/mL) geïncubeerd met elke put en geïncubeerd voor 24 uur bij 37 °C, respectievelijk. De controlegroep werd ingesteld door alleen PBS bufferoplossing toe te voegen, en de viabiliteit werd ingesteld als 100%. De MTT (20 μL, 5 mg/mL) werd toegevoegd aan elke put en geïncubeerd bij 37 °C voor ongeveer 4 uur. Vervolgens werd het cultuurmedium voorzichtig weggezogen, en 150 μL van twee dimethylsulfoxide werd toegevoegd aan per put voor 10 min totdat het kristal volledig was opgelost. Een microplaatlezer (Thermo Multiskan Mk3) werd gebruikt om elke put's OD waarde bij 490 nm te meten. Drie putten voor elke groep werden voorbereid en de berekende waarden werden uitgedrukt als gemiddelde ± S.D.

Stroomcytometrie Experiment

De Hela en MCF-7 cellen in de exponentiële fase werden toegevoegd aan elke put van twee 12-put platen (ongeveer 5 × 10⁴ cellen/put) en geïncubeerd voor 24 uur, respectievelijk. Vervolgens werd de DRN-GNPs oplossing toegevoegd aan elke van de putten (eindconcentraties met 0, 20, 40, 60, 80, en 100 μg/mL) en geïncubeerd bij 37 °C voor 24 uur, respectievelijk. Het cultuurmedium verwijderen en Trypsine (bevattend EDTA) oplossing toevoegen aan de putten om de cellen te digesteren. Vervolgens de Trypsine oplossing uit de putten verwijderen, het cultuurmedium in de putten toevoegen, en de cellen in centrifugebuizen overbrengen. Na centrifugeren bij 1000 g voor 5 min, werd het supernatans verwijderd en de cellen in elke buis verzameld en geteld in PBS oplossing. Ongeveer 5–10 × 10⁴ van de cellen werden in een andere centrifugebuizen genomen en weer gecentrifugeerd bij 1000 g voor 5 min. Het supernatans verwijderen en 100 μL AnnexineV bufferoplossing in de buizen toevoegen. 5 μL van AnnexineV-FITC en 5 μL van propidium iodide in de buizen toevoegen en ze met de cellen zachte mengen. De buizen werden geïncubeerd bij kamertemperatuur (20–25 °C) voor 15 min in het donker en daarna getest door een stroomcytometer (BD Accuri C6).

Optische Donker-Veld Verstrooiing Imaging en Transmissie Elektronenmicroscopie Studies op Celcultuur

De Hela en MCF-7 cellen werden geïmplanteerd op de 8-gat celcultuur dia ongeveer 7 × 10³ cellen voor elke put, respectievelijk. De DRN-GNPs werden toegevoegd aan elke put met de eindconcentratie van 35 μg/mL. Na 24 uur incubatie, verwijderden we fysiek en vrij geadsorbeerde GNPs door deze cellen te spoelen met PBS oplossing voor drie keer. Vervolgens fixerden we ze met 4% paraformaldehyde voor 20 min, bestreken met een paar druppels glycerine, en verzegelden deze 8-gat celcultuur dia's met een andere deksel. Een donker-veldmicroscoop (Zeiss Imager Z1) werd gebruikt om de cellen te beoordelen in × 200 vergroting en reflectieve modus. De bloottijd voor helder-veld en donker-veld afbeeldingen bij een spanning van 5 V was 1 ms en 400 ms, respectievelijk.

Voor TEM studies, werden Hela en MCF-7 cellen geïncubeerd met de DRN-GNPs (35 μg/mL) voor 24 uur in een celcultuur fles, respectievelijk. Na incuberen en het wegsugen van de gemengde oplossing van medium en DRN-GNPs, spoelden we de cellen met PBS oplossing voor drie keer en digesteerden ze dan met trypsin. De cellen werden overgebracht in een centrifugebuis met een klein volume van het DMEM medium. De cellen werden gecentrifugeerd (1500 toer/min) voor 10 min, het DMEM medium werd voorzichtig weggezogen, en de 3% glutaraldehyde oplossing (meestal 40 keer het volume van materialen) werd voorzichtig in de buis toegevoegd om de cellen in de bodem van de buis te fixeren voor meer dan 1 uur. De cellen werden verder gefixeerd door 1% osmium tetroxide toe te voegen voor 1 uur, gedeshydrateerd met ethanol, en daarna ingesloten in Spurr (Sigma-Aldrich Co., VS). De cellen werden uit de buis genomen, in secties gesneden, gekleurd met waterige uranyl acetaat en lood citraat, en daarna gemonteerd op een koperen rooster (300 mesh). De monsters werden gemeten met behulp van een FEI TECNAI-12 transmissie elektronenmicroscoop (werkspanning 120 kV).

Dier Experimenten

Dier Proefpersonen

Athymische vrouwelijke naakte muizen werden gekocht van Dierproefcentrum van Southern Medical University (Guangzhou, China) voor in vivo tumortherapie test. Alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de Dierbeheer Regels van het Ministerie van Gezondheid van de Volksrepubliek China (Document NO. 55, 2001) en de richtlijnen voor de Zorg en Gebruik van Laboratorium Dieren van China Pharmaceutical University.

Therapeutische Effectiviteit van Vrije DOX en Zijn Conjugaten in Tumor-Dragende Muizen

Kortom, 36 naakte muizen (leeftijd 5–6 weken, gewicht 16–18 g) werden willekeurig verdeeld in zes groepen. Ze werden subcutane geïnjecteerd met Hela cellen (5 × 10⁶ cellen in PBS) in de rechter oksel. Vijf dagen later, werden muizen in de controlegroep geïnjecteerd door staartadertjes met zoutoplossing (0,154 mol/L, 0,2 mL). Muizen van vrije DOX, DR-GNPs, DN-GNPs, en DRN-GNPs groepen werden ook door staartadertjes geïnjecteerd. Om de DRN-GNPs' anti-tumor effectiviteit te vergelijken tussen de intraveneuze injectie en tumorinjectie, stelden we een groep in om geïnjecteerd te worden met gelijke hoeveelheid DRN-GNPs op de tumorplek. Deze vijf groepen handhaafden een dosis van 0,3 mg/kg equivalent vrije of geconjugeerde DOX in elke muis. Elke muis onderging staartadertjes of tumorinjectie één keer per dag. Het lichaamsgewicht en het tumorvolume van elke muis werd elke dag gemonitord over 14 dagen. Om de therapeutische effecten van DOX, DR-GNPs, DN-GNPs, en DRN-GNPs verder te onderzoeken, werden de tumoren van de zes groepen uitgesneden voor pathologische analyse na 14 dagen behandeling. Tumor en de inwendige organen van hart, lever, milt, long, en nier van de muizen werden geïsoleerd van de muizen, gefixeerd met 10% neutraal-gebufferde formaline, en in paraffin ingesloten. De gesneden tumorweefsels werden gekleurd met Hematoxyline en Eosine (H&E) en onderzocht door Olympus optische microscoop.

Resultaten en Discussie

Synthese en Karakterisering van DOX-GNPs, NLS-GNPs, DN-GNPs, DR-GNPs, DRN-GNPs

In de synthese van de DOX-GNPs, toen de NaOH oplossing werd toegevoegd aan het gemengde oplossing van DOX en chloraurinezuur oplossing, veranderde de kleur van de oplossing onmiddellijk van oranje tot lichtpaars, het werd dan wijnrood bij 100 °C in een reflux systeem onder magnetische roering in één minuut, wat de vorming van de DOX-GNPs aangeeft. Het resultaat gaf aan dat de reductiecapaciteit van DOX heel sterk is omdat DOX twee fenolische hydroxylgroepen bezit (de Nr. 6 en Nr. 11 koolstof) met sterke reduceerbaarheid onder basische conditie. De reactie ging door voor 30 min tot de kleur niet meer veranderde.

Om de verwarring van DOX's oranjerood kleur en de GNPs' wijnrode kleur te vermijden, hebben we meer bewijs voorgelegd door hun UV absorptiespectra te karakteriseren (zoals getoond in Fig. 1a). DOX heeft een karakteristieke absorptiepiek bij 485 nm en een piek bij 530 nm; echter, de piek bij 480 nm verdween in het spectrum van de productoplossing en een karakteristieke piek bij 520 nm karakteristieke oppervlakteplasmonresonantie (SPR) absorptiepiek van de GNPs ontstond.zelfs, de vorming van GNPs is nog steeds niet volledig bepaald tussen de 520 nm van de GNPs en 530 nm van de piek van DOX. Rekening houdend met de GNPs zullen worden uitgezaakt met hoge-snelheid centrifugatie, en DOX moleculen zullen niet, kunnen we paarse neerslag zien in het product van de bodem van de centrifugebuis (inset van Fig. 1a(3-4)) en DOX heeft geen (inset van Fig. 1a (1-2)).

a UV-Zichtbare absorptiespectra van DOX en de als-bereide DOX–GNPs, de inset van (a) is de afbeeldingen van DOX (1, 2) en DOX-GNPs (3, 4) voor (1, 3) en na centrifugatie (2, 4). b TEM afbeelding van DOX–GNPs. c FTIR spectra van DOX en de als-bereide DOX–GNPs. d XPS spectrum van DOX–GNPs

DOX heeft rode fluorescente onder de bestraling van 365 nm ultraviolette licht; echter, de fluorescente van DOX verdween na de synthese van GNPs. Er zijn twee mogelijke redenen; de eerste is dat de GNPs' extinctiecoëfficiënt heel sterk is, ze neigen om de fluorescente van moleculen te kwetsen wanneer ze nauw gelegen zijn aan het oppervlak van de GNPs (< 5 nm) [40]. Als de afstand toeneemt tot 20 nm of meer, is de nanodeeltjes' plasmonveld te ver om hun fluorescente signaal te kwetsen [41]. De andere reden is dat de fluorescente groep van DOX vernietigd werd na het spelen van de rol van reductiemiddel. Zoals getoond in Fig. 1c, hoewel het aantal van de DOX-GNPs' infrarood absorptiepieken aanzienlijk minder is dan die van de DOX, zijn veel van de kenmerken van de DOX nog bewaard gebleven, zoals de karakteristieke IR absorptiepieken bij 2910 cm⁻¹ (C-H, rektrilling) [42], 1631 cm⁻¹ (carbonyl rektrilling) [43], 1114 cm⁻¹ (C-O, C-N rektrilling) [44], en 867 cm⁻¹ (N-H, C-H, uit-vlak buigtrilling) [45], respectievelijk. Die representatieve pieken van DOX werden ook getoond in de spectra van de DOX-GNPs, wat aangeeft dat de DOX succesvol gebonden was aan de DOX-GNPs. Interessant, de piek bij 1214 cm⁻¹ karakteristieke piek voor C-O rektrilling van de fenolische hydroxylgroep [46] verdween in de spectra van DOX-GNPs. De fenolische groep kan Au ionen reduceren tot GNPs, en toen werd het getransporteerd naar carbonylgroep. We speculeren dat het effect van DOX niet beïnvloed is, omdat het in DNA inbeddt door de aminogroep van koolstof 7 en de hydroxylgroep van koolstof 9 [39].

We kunnen waarnemen dat de DOX-GNPs' deeltjesgrootte ongeveer 6 nm is uit de TEM resultaten (Fig. 1b). De berekende verhouding van Au (I) was 31,93% uit het XPS spectrum van de DOX-GNPs (Fig. 1d), wat hoog genoeg is om de stabiliteit van het colloïde te behouden. Echter, wanneer de depositie van DOX-GNPs gedispergeerd in 0,2 M PBS bufferoplossing met hoge-snelheid centrifugatie na het wegnemen van supernatans, werd de kleur van deze oplossing paarszwart, en er was zichtbaar onoplosbare vlok. Het gaf aan dat de DOX-GNPs' stabiliteit niet heel goed was in de omgeving van de hoge zoutconcentratie. Het kan worden verklaard dat DOX slechts één aminogroep bezit maar geen sulfhydrylgroep bezit, wat niet genoeg is voor DOX om het oppervlak van GNPs via Au-S en Au-N binding te verbinden. Dus meer inspanningen zijn nodig als DOX-GNPs gebruikt wordt als contrastmiddel en anti-tumor materiaal voor tumor imaging en therapie.

We synthetiseerden DRN-GNPs met DOX, de RGD peptiden, en NLS peptiden als reducerende en stabiliserende agenten. De RGD peptiden kunnen specifiek sommige tumorcellen targeten die de α_vβ₃ integraal overexprimeren, en de NLS peptiden kunnen specifiek de kern targeten. Figuur 2a toont de UV-Vis spectra van de gefabriceerde DOX-GNPs, NLS-GNPs, DRN-GNPs; de kenmerken van hun oppervlakteplasmonabsorptiepiek was 520–530 nm [33]. Men kan ook uit de inset zien dat de GNPs een helder wijnrode kleur toonden. TEM afbeeldingen (Bijlage 1: Figuur S1) tonen aan dat de deeltjesgrootte van NLS-GNPs en DRN-GNPs ongeveer 10 nm en 5 nm was, en de GNPs uniform verdeeld waren, geen duidelijke coagulatie werd gevonden.

a UV-Zichtbare absorptiespectra en de foto afbeeldingen van DOX–GNPs (a), NLS-GNPs (b), en DRN-GNPs (c). b UV-Zichtbare absorptiespectra van basale DOX, RGD peptiden, NLS peptiden, en het supernatans van DRN-GNPs. c FTIR spectra van NLS peptiden, NLS-GNPs, en DRN-GNPs. De afstand tussen de GNPs' spectrum en NLS peptiden' spectrum is vergroot voor het contrast duidelijk

Om de synthese van NLS-GNPs en DRN-GNPs te valideren, karakteriseerden we de FTIR spectra van NLS peptiden en de GNPs in Fig. 2c. Enkele FTIR pieken van NLS peptiden werden gevonden in de spectra van NLS-GNPs en DRN-GNPs, zoals C-H rektrilling absorptiepiek (2840–2972 cm⁻¹) [47], C=O rektrilling absorptiepiek (1630–1700 cm⁻¹) [48], en =C-H in-vlak buigtrilling piek (1300–1475 cm⁻¹) [49]; het gaf aan dat de CCYNLS peptiden succesvol geconjugeerd waren op het oppervlak van GNPs. We vonden ook dat de benzeenskelet trillingspiek van tyrosine terminal in het NLS peptiden bij 1529 cm⁻¹ en de fenolische hydroxyl C-O rektrilling piek bij 1193 cm⁻¹ [49] verdwenen in de infrarood spectra van NLS-GNPs en DRN-GNPs, wat betekent dat het benzeenskelet van tyrosine terminal getransporteerd was in een chinonstructuur na het spelen van zijn rol als reductiemiddel.

We centrifugeerden de DRN-GNPs met hoge snelheid, verzamelden het supernatansvloeistof, dat bijna kleurloos was, en testten dan of er overgebleven reactanten waren via UV-Vis spectra in Fig. 2b. De UV absorptiepieken van RGD en NLS peptiden zijn afgeleid van tyrosine residuen, de absorptiepiek was gelegen bij 275 nm. Echter, de fenolische hydroxylgroep werd negatieve zuurstofionten onder alkalische condities, wat de elektrondichtheid van benzeenring verhoogde, de piek was rood verschoven tot 292 nm. We zagen de karakteristieke piek niet in het UV-Vis spectrum van het DRN-GNPs' supernatans, wat betekent dat beide peptiden meededen aan de reactie. DOX bezit drie absorptiepieken in het bereik van 450–600 nm, maar het DRN-GNPs' supernatans heeft die pieken niet. Naast dat, werd geen DOX gevonden in het DRN-GNPs' supernatans omdat de kleur lichtbruin was maar de kleur van DOX onder basische conditie was transparant lichtpaars. Het kan worden geconcludeerd dat de drie materialen bijna volledig reageerden. Op dezelfde manier worden de DR-GNPs en DN-GNPs ook op deze manier uitgelegd, zie Bijlage 1: Figuur S2.

We gebruikten XPS spectroscopie om de valentie van Au voor de NLS-GNPs en DRN-GNPs te onderzoeken. Zoals getoond in Fig. 3a, b, twee pieken met bindingsenergieën van ongeveer 83,6 eV en 87,0 eV zijn consistent met de emissie van Au 4f7/2 en 4f 5/2 foto-elektronen [33]. Hun Au 4f7/2 bindingsenergiepositie van beide GNPs is bijna 84,0 eV. Voor de NLS-GNPs, kan het ontbonden worden in Au (0) (83,5 eV) en Au (I) (84,1 eV), hun piekoppervlakte verhouding is 57% en 43%, respectievelijk. Op dezelfde manier, voor de DRN-GNPs, kan het ontbonden worden in Au (0) (83,6 eV) en Au (I) (84,4 eV), de piekoppervlakte verhoudingen zijn 62% en 38%, respectievelijk, dus hebben ze een hogere proportie van Au (I). De lading kan Au (I)-S complexen vormen, wat helpt om de GNPs' colloidale stabiliteit te behouden. Interessant, identificeerden we drie typen S in de XPS spectra van NLS-GNPs, DN-GNPs, en DRN-GNPs in Bijlage 1: Figuur S3. De blauwe en zwarte curven vertegenwoordigen de oxidatietoestanden van zwavel, paarse curven vertegenwoordigen de S-H binding, en de groene curve vertegenwoordigt de Au-S binding. De vorming van Au-S binding illustreerde dat de NLS peptiden succesvol geconjugeerd waren op het oppervlak van deze drie GNPs.

XPS spectrum van de Au 4f van de (a) NLS-GNPs, (b) DRN-GNPs. De Au 4f7/2 bindingsenergie van de originele spectra (zwart) en gefitte resultaten (rood) kunnen ontbonden worden in twee componenten, Au(0)-blauwe curve en Au(I)-paarse curve. UV-Zichtbare absorptiespectra en afbeeldingen van DRN-GNPs gedispergeerd in PBS, NaCl, NaOH, en HCl, respectievelijk (c).

Bovendien toonden de pieken van N 1s, C 1s, en O 1s van XPS spectra aan dat de peptiden en DOX aan GNPs gehecht waren (Bijlage 1: Figuur S4).

De XRD spectra (Bijlage 1: Figuur S5) toonden aan dat de kristalstructuur van deze GNPs gezichts-gecentreerde kubieke kristallijne structuur is, omdat al hun XRD spectra vier pieken bevatten bij 38,2°, 44,5°, 64,7°, en 77,8° corresponderend met de (111), (200), (220), en (311) vlakken [33].

Stabiliteit van DRN-GNPs

Dynamische lichtverstrooiing (DLS) en zeta-potentiaal gegevens van deze vijf GNPs werden weergegeven in Tabel 1; hun hydrodynamische grootte is groter dan die gekarakteriseerd door TEM, wat kan worden toegeschreven aan een zeker hoeveelheid gehydrateerde moleculen rond de kern van de wateroplosbare GNPs. Hun zeta-potentialen waren negatief vanwege de carboxylgroep geconjugeerd op het oppervlak van GNPs. De GNPs oplossing toont goede colloidale stabiliteit wanneer de absolute waarde van zeta-potentiaal groter is dan 30 mV; hoe groter de absolute waarde, hoe beter de stabiliteit. Men kan zien dat ze allemaal goede colloidale stabiliteit bezitten uit Tabel 1. In vergelijking, was de NLS-GNPs' waarde van zeta-potentiaal de hoogste, dat kan zijn omdat hun oppervlak vol zit met NLS peptiden die sterke Au-S binding kunnen vormen via de thiolgroep. De absolute waarde van DOX-GNPs' zeta-potentiaal was dichtbij 30 mV; het was consistent met de eerder genoemde dat de DOX-GNPs niet heel stabiel waren wanneer ze gedispergeerd waren in PBS bufferoplossing. De spectra data werden weergegeven in Bijlage 1: Figuur S6.

De veranderingen van de GNPs' karakteristieke oppervlakteplasmonresonantie (SPR) banden kunnen worden gebruikt om de aggregatie van GNPs te bepalen door gebruik te maken van UV-Vis spectrometrie [49]. We maatten hun UV-Vis spectra en namen de foto's van de DRN-GNPs (Fig. 3c) toen ze gedispergeerd waren in hoge zout (1 M NaCl en 0,2 M PBS), sterke zuur (0,5 M HCl), en sterke base (0,5 M NaOH) oplossingen. Noch oplossingskleurverandering noch UV-vis spectra verschuiving werd waargenomen onder verschillende harde condities behalve in de HCl oplossing, waarin hun kleur veranderde tot lichtpaars en de ultraviolet absorptiepiek rood verschoven ongeveer 20 nm, wat betekent dat GNPs licht coaguleerden onder sterke zuur conditie. De reden kan zijn dat de negatief geladen GNPs colloidale stabiliteit beïnvloed werd onder sterke zuur conditie, maar het werd niet beïnvloed in de neutrale PBS buffer en alkalische omgeving. We kunnen concluderen dat de DRN-GNPs hoogstabiel zijn onder hoge zout en alkalische condities, wat aangeeft dat onze gesynthetiseerde DRN-GNPs verwacht worden te worden gebruikt voor in vitro cel imaging en in vivo anti-tumor therapie.

Plasmonische Donker-Veld Verstrooiing Imaging van Tumor Cellen en Cel TEM Microscopie

Voor de specifieke gerichte imaging van tumorcellen met DRN-GNPs, selecteerden we de Hela cellen als testgroep en de MCF-7 cellen als de controlegroep. De reden is dat de Hela cellen de integraal α_vβ₃ overexprimeren [50] maar de MCF-7 cellen niet, dus het heeft geen specifieke binding van RGD; het is een goede controlegroep [51]. De opname van DRN-GNPs door deze twee cellijnen na incubatie voor 24 uur met een eindconcentratie van 35 μg/mL werd beoordeeld door een uprechte fluorescentiemicroscopie in de donker-veldmodus. De cellen die behandeld werden zonder GNPs tonen geen plasmatische lichtverstrooiing (Fig. 4 A-Hela cellen, 5C-MCF-7 cellen). Afbeeldingen van Hela cellen die behandeld werden met de DRN-GNPs tonen aan dat verstrooiingssignalen van de GNPs zwaar gelokaliseerd zijn op de kern (Fig. 4b en 5e). Echter, we konden nauwelijks de verstrooiing licht van de MCF-7 cellen zien nadat ze geïncubeerd waren met de DRN-GNPs, zelfs als een klein bedrag GNPs de tumorcellen binnen mochten zijn gekomen door de tumorcellen' passieve verhoogde permeabiliteit en retentie effect (EPR effect) (Fig. 4d en 5f), het verhoogde permeabiliteit en retentie (EPR) effect is een uniek fenomeen van solide tumoren gerelateerd aan hun anatomische en pathophysiologische verschillen van normale weefsels. Bijvoorbeeld, angiogenese leidt tot hoge vaatdichtheid in solide tumoren, grote gaten bestaan tussen endotheelecellen in tumorbloedvaten, en tumorweefsels tonen selectieve extravasatie en retentie van macromoleculaire geneesmiddelen [52]. Dus ze zouden niet duidelijk gedetecteerd kunnen worden onder dezelfde experimentele conditie. De resultaten toonden aan dat de endocytose van Hela cellen via receptor-gemedieerde endocytose werd vergemakkelijkt door de RGD peptiden op de GNPs' oppervlak. De NLS peptiden konden ook hun activiteit behouden om specifiek de kern te targeten. Dus onze gesynthetiseerde DRN-GNPs kunnen een heel potentiëel contrastmiddel zijn voor tumor gerichte imaging.

De inhoud van de rijen worden als volgt vermeld: "PBS buffer" vertegenwoordigt de cellen incuberen met PBS buffer, "DRN-GNPs" vertegenwoordigt de cellen incuberen met DRN-GNPs. De subscript van "1" vertegenwoordigt de helder-veld afbeeldingen van cellen, "2" vertegenwoordigt de donker-veld afbeeldingen van cellen, en "3" vertegenwoordigt de overlappende afbeeldingen (helder-veld en donker-veld) van cellen. Alle schaalbalken zijn 20 μm. De afbeelding van E is een klein gebied gekozen uit B₃ in Fig. 4, de afbeelding van F is een klein gebied gekozen uit D₃ in Fig. 4, de schaalbalken zijn 10 μm

TEM afbeeldingen van DRN-GNPs geïncubeerd in Hela en MCF-7 cellen voor 24 uur. A₁, A₂, en A₃ zijn corresponderend met HeLa cellen terwijl B₁ en B₂ zijn voor MCF-7 cellen

Tabel 2 toont de verhoudingswaarden tussen de cellen' densitometrische gemiddelde grijswaarde en de achtergrond in dezelfde afbeelding, wat een positieve correlatie heeft met de opgenomen hoeveelheden DRN-GNPs door deze twee cellijnen. De verhoudingen van de cellen geïncubeerd met PBS buffer en de MCF-7 cellen waren bijna 1,0, de helderheid van cellen was bijna dicht bij de achtergrond. De verhouding van Hela cellen geïncubeerd met DRN-GNPs was 4,80, wat betekent dat de gesynthetiseerde DRN-GNPs specifiek gericht kon worden en de tumorcellen die de integraal α_vβ₃ overexprimeren, kon binnengaan.

Om receptor-specifieke internalisatie van de DRN-GNPs te bevestigen, onderzochten we de cellulaire opname van de DRN-GNPs door Hela en MCF-7 cellen met behulp van de TEM techniek (zie Fig. 5). Er was een grote hoeveelheid DRN-GNPs gelokaliseerd in de kern- en cytoplasmaregio's van α_vβ₃-positieve Hela cellen (Fig. 5(A₁- A₃)). Aan de andere kant, werd slechts een verwaarloosbaar hoeveelheid deeltjes gevonden binnen de cytoplasmaregio's van α_vβ₃-negatieve MCF-7 cellen (Fig. 5(B₁-B₂)), ze kunnen geaccumuleerd zijn in de MCF-7 cellen door middel van het passieve targeterende EPR effect. We vonden dat er hoge contrast zwarte continue regio's waren in de MCF-7 cellen' kern; ze waren uranyl acetaat, wat de kern kleurde, en ze waren anders dan de korrelvormige deeltjes in de kern van Hela cellen. De TEM afbeeldingen zijn consistent met de donker-veld imaging resultaten, wat aangeeft dat de RGD en NLS peptiden op het oppervlak van GNPs de DRN-GNPs faciliteren om Hela cellen' kern te targeten. Dus onze gesynthetiseerde DRN-GNPs kunnen worden gebruikt als een perfect contrastmiddel voor tumor gerichte imaging en diagnostiek.

Cellulaire Therapeutische Effectiviteit Evaluatie

Om de therapeutische effectiviteit van DOX en DRN-GNPs op celniveau te evalueren, werd MTT assay eerst uitgevoerd om celviabiliteit van Hela en MCF-7 cellen onder de behandeling van deze twee monsters voor 24 uur te bestuderen. DRN-GNPs demonstreerde bijna dezelfde inhibitie-effect door bijna 70% van cellen te doden bij dezelfde DOX's concentratie (39,0 μg/mL, Fig. 6(A, B)). In lijn met de MTT resultaten, toen de concentratie van DRN-GNPs 40 μg/mL was, waren het aantal en de toestand van de Hela en MCF-7 cellen relatief goed, dus de concentratie van 35 μg/mL was de geschikte concentratie voor imaging. We observeerden dat toen de DRN-GNPs' concentratie hoog was tot 60 μg/mL (Fig. 6(C₃)), de Hela cellen duidelijk necrose vertoonden. Toen de concentratie van DRN-GNPs hoog ging tot 100 μg/mL, werd een opvallende reductie van het aantal cellen waargenomen en duidelijke cellulaire morfologische verandering als het kenmerk van necrose waargenomen. Dezelfde concentratie van geconjugeerde DOX vertoonde nog steeds bijna dezelfde anti-tumor effectiviteit vergeleken met de vrije DOX. Deze resultaten gaven aan dat onze gesynthetiseerde DRN-GNPs niet alleen als een contrastmiddel maar ook als een goed medicijnleveringssysteem kunnen worden gebruikt.

MTT assay werd gebruikt om kwalitatief in vitro anti-tumor activiteit van DOX en DRN-GNPs op Hela (a) en MCF-7 cellen (b) voor 24 uur (100%) weer te geven. De concentraties van C₀-C₅ zijn 0, 20, 40, 60, 80, 100 μg/mL voor DRN-GNPs; de corresponderende DOX's concentraties zijn 0, 7,8, 15,6, 23,4, 31,2, 39,0 μg/mL. Gegevens worden voorgesteld als gemiddelde ± standaarddeviaties van drievoudige monsters (n = 3). Afbeeldingen van Hela cellen geïncubeerd met verschillende concentratie van DRN-GNPs (c)

Het resultaat gedetecteerd door de stroomcytometrie in Fig. 7 toont ook de anti-tumor effectiviteit van DRN-GNPs. Viabiliteit van Hela cellen wanneer blootgesteld aan DRN-GNPs van verschillende concentraties werd gemeten door stroomcytometrie gebaseerde assays. Twee modi van celdood, apoptose en necrose, werden gemeten met behulp van AnnexineV-FITC en propidium iodide (PI) kleurstoffen, respectievelijk (Fig. 7). Vergelijkbaar met de resultaten van MTT assay, toonde de data aan dat DRN-GNPs celdood necrose was dosis-afhankelijk. De proportie van necrotische cellen was 8% zonder incuberen met DRN-GNPs; toen de concentratie hoog was tot 100 μg/mL, was de proportie van necrotische cellen 23,84%; dat betekent dat onze gesynthetiseerde DRN-GNPs Hela cellen efficiënt kunnen doden. Het verschil tussen de resultaten van MTT en stroomcytometrie kan worden uitgelegd door het verschil in celnummer en de methoden.

Representatieve tweedimensionale contour dichtheid plots om fracties van levende, apoptotische, en necrotische cellen te bepalen, wanneer blootgesteld aan DRN-GNPs bij verschillende concentraties (0–100 μg/mL) voor 24 uur, respectievelijk. Cel necrose en apoptose werden gemeten door gebruik te maken van PI en AnnexineV-FITC kleurstoffen

Therapie Evaluatie van DRN-GNPs in Tumor-Dragende Muizen

Om verder te bepalen of DRN-GNPs een gecombineerd therapeutisch effect induceerde op tumorcellen in vivo, evalueerden we het anti-tumor effect van DRN-GNPs in tumor-dragende muizen voor langdurige intraveneuze injectie van geneesmiddelen. De zoutoplossingsgroep en de geneesmiddelen van vrije DOX, DR-GNPs, en DN-GNPs intraveneuze geïnjecteerde groepen werden ingesteld als de controlegroepen, waarin de concentratie van geconjugeerde DOX hetzelfde was als die van de vrije DOX. We observeerden dat de tumorformaten van DRN-GNPs-behandelde groepen duidelijk kleiner waren dan die van de zoutoplossing, DOX, DN-GNPs, en DR-GNPs-behandelde groepen (Fig. 8a). Het tumorvolume en het lichaamsgewicht van de muizen werden elke 2 dagen gemonitord. Significante variatie van tumorvolume en tumorgewicht onder alle behandelde groepen wordt getoond in Fig. 8d, f; de tumorvolumes en tumorgewicht van DN-GNPs en DR-GNPs-behandelde groepen waren kleiner dan die van de vrije DOX-behandelde groep, maar nog steeds groter dan die van de DRN-GNPs-behandelde groepen vanwege de minder gerichte activiteit. Dat kan zijn omdat DOX moleculen klein zijn, targeting missen, en ze een korte halfwaardetijd in vivo hebben; daarom kunnen ze snel worden uitgeplast. Echter, DRN-GNPs bezitten sterke stabiliteit in het bloedsysteem, lange halfwaardetijd, en hoge gerichte capaciteit, dus ze kunnen worden gericht op de tumorplek, en dan het anti-tumor effect van DOX spelen. Tussen de DRN-GNPs intraveneuze geïnjecteerde en tumor-geïnjecteerde groepen, is de anti-tumor effectiviteit van de latere groep beter dan die van de eerste groep omdat de geneesmiddelen geen complex bloedsysteem nodig hebben in de focus. De tumorinhibitiepercentage van DOX is minder dan 50%, en de percentages van alle DOX-geconjugeerde GNPs zijn groter dan 50%; ze kunnen hoog zijn tot 66,7% en 57,7%, respectievelijk. De HE kleurresultaten toonden aan dat er een zekere mate van schade was voor leverorganen in de intraveneuze geïnjecteerde DRN-GNPs groep (Fig. 9). Verder werd de biotoxiciteit van DOX, DR-GNPs, en DN-GNPs op tumor-dragende muizen ook beoordeeld door histologische analyse. Zoals getoond in Fig. 8b, is het tumorcelvolume van de zoutoplossingsgroep vergelijkbaar groter dan die van behandelingsgroepen, en tumorcellen tonen meer mitotische figuren. Alle resultaten toonden aan dat het tumorinhibitie-effect van DRN-GNPs het beste was onder de GNPs. Dus, onze gesynthetiseerde DRN-GNPs kunnen worden gebruikt als een perfect DOX leveringssysteem voor tumortherapie.

a Tumor afbeeldingen geïsoleerd van tumor-dragende muizen na behandeling van zoutoplossing, vrije DOX, DN-GNPs, DR-GNPs, en DRN-GNPs (tumor injectie en intraveneuze injectie). b De histologische afbeeldingen van tumoren van de muizen na behandeling met zoutoplossing, vrije DOX, DN-GNPs, DR-GNPs, en DRN-GNPs (tumor injectie en intraveneuze injectie). c Lichaamsgewicht, tumorvolume (d), tumor inhibitiepercentage (e), en tumor gewicht (f) van tumor-dragende muizen gedurende 14 dagen behandeling; gegevens worden voorgesteld als gemiddelde ± standaarddeviaties (n = 6)

De histologische afbeeldingen van de hooforganen (hart, lever, milt, long, en nier) van de muizen na behandeling met zoutoplossing, vrije DOX, DR-GNPs, DN-GNPs, en DRN-GNPs (tumor injectie en intraveneuze injectie)

Conclusie

In deze studie hebben we succesvol een een-staps methode ontwikkeld om de multifunctionele DRN-GNPs in ongeveer een half uur te bereiden. De GNPs zijn ook succesvol toegepast op de tumor gerichte imaging en tumortherapie zowel in vitro als in vivo. Het succes toont aan dat het mogelijk is om volledig gebruik te maken van de reducerende en stabiliserende capaciteit van de DOX, RGD peptiden, en CCYNLS peptiden, wat het GNPs' syntheseproces eenvoudig en efficiënt zal maken. Belangrijker nog, de een-staps gesynthetiseerde DRN-GNPs bezitten nog steeds goede colloidale stabiliteit in het fysiologische systeem, en de peptiden geconjugeerd op het oppervlak bleven de gerichte capaciteit behouden en DOX bezit nog steeds zijn anti-tumor capaciteit. Onze kennis naar is dit het eerste rapport voor synthese van DOX, RGD en CCYNLS peptiden geconjugeerde multifunctionele GNPs met een een-staps methode, en hun toepassing in tumor imaging, diagnostiek, en therapie. Deze strategie is in lijn met de ontwikkelingsrichting van groene chemie, en het zou de basis leggen voor grootschalige toepassingen in de nabije toekomst. We verwachten dat ons rapport een nieuwe weg zal bieden voor de een-staps synthese van multifunctionele nanomaterialen gebruikt voor tumor imaging en therapie.

Beschikbaarheid van Gegevens en Materialen

Alle datasets worden gepresenteerd in het hoofdartikel of in de additionele ondersteunende bestanden.

Afkortingen

CCYNLS peptiden:

De aminozuur sequentie is cysteine-cysteine-tyrosine-proline-proline-lysine-lysine-lysine-arginine-lysine-valine

Cyclische RGD peptiden:

De aminozuur sequentie is arginine-glycine-aspartaat-tyrosine-glutaminezuur

DOX:

Doxorrubicine

DR-GNPs:

DOX-RGD-GNPs, DN-GNPs: DOX-NLS-GNPs, DRN-GNPs: DOX-RGD-NLS GNPs

GNPs:

Goud nanodeeltjes