Eenstaps, snelle en groene synthese van multifunctionele gouden nanodeeltjes voor tumorgerichte beeldvorming en therapie

Resultaten en discussie

Synthese en karakterisering van DOX-BNP's, NLS-BNP's, DN-BNP's, DR-BNP's, DRN-BNP's

Bij de synthese van de DOX-BNP's, toen de NaOH-oplossing werd toegevoegd aan de gemengde oplossing van DOX en chloorgoudzuuroplossing, veranderde de kleur van de oplossing onmiddellijk van oranje in ondiep paars, en werd vervolgens wijnrood bij 100 ° C in een refluxsysteem onder magnetisch roeren in één minuut, wat de vorming van de DOX-BNP's aangeeft. Het resultaat gaf aan dat het reductievermogen van DOX erg sterk is omdat DOX twee fenolische hydroxylgroepen bezit (de nr. 6 en nr. 11 koolstof) met een sterke reduceerbaarheid onder basische omstandigheden. De reactie duurde 30 minuten totdat de kleur niet veranderde.

Om te voorkomen dat de oranjerode kleur van de DOX en de wijnrode kleur van de BNP's worden verward, hebben we meer bewijs naar voren gebracht door hun UV-absorptiespectra te karakteriseren (zoals weergegeven in figuur 1a). DOX heeft een karakteristieke absorptiepiek bij 485 nm en een piek bij 530 nm; de piek bij 480 nm verdween echter in het spectrum van de oplossing van het product en er ontstond een karakteristieke piek bij 520 nm karakteristieke oppervlakteplasmonresonantie (SPR) absorptiepiek van de BNP's. Toch wordt de vorming van BNP's nog steeds niet volledig bepaald tussen de 520 nm van de BNP's en 530 nm van de piek van DOX. Rekening houdend met de BNP's zullen worden geprecipiteerd met snelle centrifugatie, en DOX-moleculen niet, kunnen we paarse neerslag zien in het product van de bodem van de centrifugebuis (inzet van Fig. 1a (3-4)) en DOX do geen van beide hebben (inzet van Fig. 1a (1-2)).

een UV-zichtbare absorptiespectra van DOX en de voorbereide DOX-BNP's, de inzet van (a ) zijn de afbeeldingen van DOX (1, ​​2) en DOX-GNP's (3, 4) voor (1, 3) en na centrifugeren (2, 4). b TEM-afbeelding van DOX-BNP's. c FTIR-spectra van DOX en de voorbereide DOX-BNP's. d XPS-spectrum van DOX-BNP's

DOX heeft rode fluorescentie onder de bestraling van 365 nm ultraviolet licht; de fluorescentie van DOX verdween echter na de synthese van BNP's. Er zijn twee mogelijke redenen; de eerste is dat de extinctiecoëfficiënt van de BNP's erg sterk is, ze hebben de neiging om de fluorescentie van moleculen te doven wanneer ze zich dicht bij het oppervlak van de BNP's bevinden (<-5 nm) [40]. Als de afstand toeneemt tot 20 nm of meer, is het plasmonveld van de nanodeeltjes te ver om hun fluorescentiesignaal te doven [41]. De andere reden is dat de fluorescerende groep van DOX werd vernietigd na het spelen van de rol van reductiemiddel. Zoals getoond in Fig. 1c, hoewel het aantal infraroodabsorptiepieken van de DOX-GNP's aanzienlijk minder is dan dat van de DOX, zijn veel van de kenmerken van de DOX nog steeds behouden, zoals de karakteristieke IR-absorptiepieken op 2910 cm ⁻¹ (C-H, rekvibratie) [42], 1631 cm ⁻¹ (carbonyl rekvibratie) [43], 1114 cm ⁻¹ (C-O, C-N rekvibratie) [44] en 867 cm ⁻¹ (N-H, C-H, buigtrilling buiten het vlak) [45], respectievelijk. Die representatieve pieken van DOX werden ook weergegeven in de spectra van de DOX-BNP's, wat erop wijst dat de DOX met succes aan de DOX-BNP's bindt. Interessant is dat de piek op 1214 cm ⁻¹ karakteristieke piek voor C-O-rektrillingen van de fenolische hydroxylgroep [46] verdween in de spectra van DOX-BNP's. De fenolische groep kan Au-ionen reduceren tot BNP's en vervolgens naar de carbonylgroep getransporteerd. We speculeren dat het effect van DOX niet wordt beïnvloed, omdat het in het DNA wordt ingebed door de aminogroep van koolstof 7 en de hydroxylgroep van koolstof 9 [39].

We kunnen waarnemen dat de deeltjesgrootte van de DOX-BNP's ongeveer 6 nm is van de TEM-resultaten (figuur 1b). De berekende verhouding van Au (I) was 31,93% van het XPS-spectrum van de DOX-GNP's (figuur 1d), wat hoog genoeg is om de stabiliteit van het colloïde te behouden. Toen de afzetting van DOX-GNP's echter werd gedispergeerd in 0, 2 M PBS-bufferoplossing met centrifugatie op hoge snelheid na verwijdering van het supernatant, werd de kleur van deze oplossing paarszwart en was er een zichtbare onoplosbare vlok. Het gaf aan dat de stabiliteit van de DOX-BNP's niet erg goed was in de omgeving van de hoge zoutconcentratie. Het kan worden verklaard dat DOX slechts één aminogroep bezit maar geen sulfhydrylgroep, wat niet genoeg is voor DOX om het oppervlak van BNP's te verbinden via Au-S- en Au-N-binding. Er zijn dus meer inspanningen nodig als DOX-GNP's worden gebruikt als contrastmiddel en antitumormateriaal voor beeldvorming en therapie van tumoren.

We hebben DRN-BNP's gesynthetiseerd met DOX, de RGD-peptiden en NLS-peptiden als reducerende en stabiliserende middelen. De RGD-peptiden kunnen specifiek gericht zijn op sommige tumorcellen die de α_v . tot overexpressie brengen β₃ integraïne, en de NLS-peptiden kunnen zich specifiek op de kern richten. Figuur 2a toont de UV-Vis-spectra van de gefabriceerde DOX-BNP's, NLS-BNP's, DRN-BNP's; de kenmerken van hun oppervlakteplasmonabsorptiepiek waren 520-530 nm [33]. Men kan ook aan de inzet zien dat de BNP's een heldere rode wijnkleur vertoonden. TEM-afbeeldingen (aanvullend bestand 1:figuur S1) laten zien dat de deeltjesgrootte van NLS-BNP's en DRN-BNP's ongeveer 10 nm en 5 nm was, en dat de BNP's uniform zijn verdeeld, er werd geen duidelijke coagulatie gevonden.

een UV-zichtbare absorptiespectra en de fotobeelden van DOX-BNP's (a ), NLS-BNP's (b ), en DRN-BNP's (c ). b UV-zichtbare absorptiespectra van basische DOX-, RGD-peptiden, NLS-peptiden en het supernatant van DRN-BNP's. c FTIR-spectra van NLS-peptiden, NLS-BNP's en DRN-BNP's. De afstand tussen het spectrum van het BNP en het spectrum van NLS-peptiden wordt duidelijk vergroot voor het contrast

Om de synthese van NLS-BNP's en DRN-BNP's te valideren, hebben we de FTIR-spectra van NLS-peptiden en de BNP's in Fig. 2c gekarakteriseerd. Sommige FTIR-pieken van NLS-peptiden werden gevonden in de spectra van NLS-GNP's en DRN-GNP's, zoals C-H stretching-trillingsabsorptiepiek (2840-2972 cm ⁻¹ ) [47], C=O stretching trillingsabsorptiepiek (1630-1700 cm ⁻¹ ) [48], en =C-H in-plane buigtrillingspiek (1300–1475 cm ⁻¹ ) [49]; het gaf aan dat de CCYNLS-peptiden met succes waren geconjugeerd op het oppervlak van BNP's. We vonden ook dat de benzeenskeletvibratiepiek van het tyrosine-uiteinde in het NLS-peptide op 1529 cm ⁻¹ en de fenolische hydroxyl C-O rektrillingspiek bij 1193 cm ⁻¹ [49] verdween in de infraroodspectra van NLS-GNP's en DRN-GNP's, wat betekent dat het benzeenskelet van het tyrosine-uiteinde werd getransporteerd naar een chinonstructuur nadat het zijn rol van reductiemiddel had gespeeld.

We centrifugeren de DRN-BNP's met hoge snelheid, verzamelden de supernatantvloeistof, die bijna kleurloos was, en testten vervolgens of er reactanten over waren via UV-Vis-spectra in Fig. 2b. De UV-absorptiepieken van RGD- en NLS-peptiden zijn afgeleid van tyrosineresiduen, de absorptiepiek bevond zich op 275 nm. De fenolische hydroxylgroep werd echter negatieve zuurstofionen onder alkalische omstandigheden, wat de elektronendichtheid van de benzeenring verhoogt, de piek was rood verschoven naar 292 nm. We zagen de karakteristieke piek in het UV-Vis-spectrum van het supernatant van de DRN-GNP's niet, wat betekent dat beide peptiden aan de reactie deelnamen. DOX heeft drie absorptiepieken in het bereik van 450-600 nm, maar het supernatant van de DRN-BNP's heeft die pieken niet. Daarnaast werd er geen DOX gevonden in het supernatant van de DRN-BNP's omdat de kleur lichtbruin was, maar de kleur van DOX onder basisconditie was transparant lichtpaars. Geconcludeerd kan worden dat de drie materialen bijna volledig reageren. Op dezelfde manier worden ook de DR-BNP's en DN-BNP's op deze manier uitgelegd, zie Aanvullend bestand 1:Figuur S2.

We gebruikten XPS-spectroscopie om de valentie van Au voor de NLS-BNP's en DRN-BNP's te onderzoeken. Zoals getoond in Fig. 3a, b, zijn twee pieken met bindingsenergieën van ongeveer 83,6 eV en 87,0 eV consistent met de emissie van Au 4f7/2 en 4f 5/2 foto-elektronen [33]. Hun Au 4f7/2-bindingsenergiepositie van beide BNP's is bijna 84,0 eV. Voor de NLS-BNP's kan het worden gedeconvolueerd in Au (0) (83,5 eV) en Au (I) (84,1 eV), hun piekoppervlakteverhouding is respectievelijk 57% en 43%. Evenzo kan het voor de DRN-BNP's worden gedeconvolueerd in Au (0) (83,6 eV) en Au (I) (84,4 eV), de piekoppervlakverhoudingen zijn respectievelijk 62% en 38%, dus ze hebben een hoger aandeel van Au (I). De lading kan Au (I)-S-complexen vormen, die helpen om de colloïdale stabiliteit van het BNP te behouden. Interessant is dat we drie soorten S hebben geïdentificeerd in de XPS-spectra van NLS-BNP's, DN-GNP's en DRN-GNP's in aanvullend bestand 1:figuur S3. De blauwe en zwarte curven vertegenwoordigen de oxidatietoestanden van zwavel, paarse curven vertegenwoordigen de S-H-binding en de groene curve vertegenwoordigt de Au-S-binding. De vorming van Au-S-binding illustreerde dat de NLS-peptiden met succes waren geconjugeerd op het oppervlak van deze drie BNP's.

XPS-spectrum van de Au 4f van de (a ) NLS-BNP's, (b ) DRN-BNP's. De Au 4f7/2-bindingsenergie van de originele spectra (zwart) en de aangepaste resultaten (rood) kunnen worden gedeconvolueerd in twee componenten, de Au(0)-blauwe curve en de Au(I)-paarse curve. UV-zichtbare absorptiespectra en afbeeldingen van DRN-BNP's gedispergeerd in respectievelijk PBS, NaCl, NaOH en HCl (c ).

Bovendien toonden de pieken van N 1s, C 1s en O 1s van XPS-spectra aan dat de peptiden en DOX waren gehecht aan BNP's (aanvullend bestand 1:figuur S4).

De XRD-spectra (aanvullend bestand 1:figuur S5) toonden aan dat de kristalstructuur van deze BNP's een face-centered-cubic kristallijne structuur heeft, omdat al hun XRD-spectra vier pieken bevatten bij 38,2 °, 44,5°, 64,7 ° en 77,8 ° overeenkomend met de (111), (200), (220) en (311) vlakken [33].

Stabiliteit van DRN-BNP's

Dynamische lichtverstrooiing (DLS) en zeta-potentiaalgegevens van deze vijf BNP's werden weergegeven in Tabel 1; hun hydrodynamische grootte is groter dan die wordt gekenmerkt door TEM, wat kan worden toegeschreven aan een bepaalde hoeveelheid gehydrateerde moleculen rond de kern van de in water oplosbare BNP's. Hun zeta-potentialen waren negatief vanwege de carboxylgroep geconjugeerd op het oppervlak van BNP's. De BNP-oplossing vertoont een goede colloïdale stabiliteit wanneer de absolute waarde van zeta-potentiaal groter is dan 30 mV; hoe groter de absolute waarde, hoe beter de stabiliteit. Uit tabel 1 blijkt dat ze allemaal een goede colloïdale stabiliteit bezitten. Ter vergelijking:de zeta-potentiaal van de NLS-BNP's was het hoogst, mogelijk omdat hun oppervlak vol zit met NLS-peptiden die een sterke Au-S-binding kunnen vormen via de thiolgroep. De absolute waarde van het zeta-potentieel van DOX-BNP's was bijna 30 mV; het was consistent met het eerder genoemde dat de DOX-BNP's niet erg stabiel waren wanneer ze werden gedispergeerd in PBS-bufferoplossing. De spectra-gegevens werden weergegeven in Aanvullend bestand 1:Afbeelding S6.

De veranderingen van de karakteristieke oppervlakte-plasmonresonantie (SPR)-banden van de BNP's kunnen worden gebruikt om de aggregatie van BNP's te bepalen door gebruik te maken van UV-Vis-spectrometrie [49]. We maten hun UV-Vis-spectra en namen de foto's van de DRN-GNP's (Fig. 3c) wanneer ze waren gedispergeerd in hoog zout (1 M NaCl en 0,2 M PBS), sterk zuur (0,5 M HCl) en sterke base ( 0,5 M NaOH) oplossingen. Noch de kleurverandering van de oplossing, noch de UV-vis-spectraverschuiving werd waargenomen onder verschillende zware omstandigheden, behalve in de HCl-oplossing, waarin hun kleur veranderde in licht paars en de ultraviolette absorptiepiek roodverschuiving ongeveer 20 nm, wat betekent dat BNP's enigszins coaguleerden onder sterk zure omstandigheden . De reden kan zijn dat de negatief geladen colloïdale stabiliteit van het BNP werd beïnvloed onder sterk zure omstandigheden, maar niet werd beïnvloed in de neutrale PBS-buffer en alkalische omgeving. We kunnen concluderen dat de DRN-BNP's zeer stabiel zijn onder hoge zout- en alkali-omstandigheden, wat aangeeft dat onze gesynthetiseerde DRN-BNP's naar verwachting zouden worden gebruikt voor in vitro celbeeldvorming en in vivo antitumortherapie.

Plasmonische donkerveldverstrooiingsbeeldvorming van tumorcellen en cel-TEM-microscopie

Voor de specifieke gerichte beeldvorming van tumorcellen met DRN-GNP's selecteerden we de Hela-cellen als testgroep en de MCF-7-cellen als de controlegroep. De reden is dat de Hela-cellen het integrine tot overexpressie brengen α_v β₃ [50] maar de MCF-7-cellen niet, dus het heeft geen specifieke binding van RGD; het is een goede controlegroep [51]. De opname van DRN-BNP's door deze twee cellijnen na incubatie gedurende 24 uur met een eindconcentratie van 35 g/mL werd beoordeeld door een rechtopstaande fluorescentiemicroscopie in het donkerveldmodel. De cellen die worden behandeld zonder BNP's vertonen geen plasmonische lichtverstrooiing (Fig. 4 A-Hela-cellen, 5C-MCF-7-cellen). Afbeeldingen van Hela-cellen die worden behandeld met de DRN-BNP's laten zien dat verstrooiingssignalen van de BNP's sterk gelokaliseerd zijn in de kern (figuren 4b en 5e). We konden het verstrooide licht van de MCF-7-cellen echter nauwelijks zien nadat ze waren geïncubeerd met de DRN-BNP's, hoewel een kleine hoeveelheid BNP's de tumorcellen zou zijn binnengekomen via het passieve verbeterde permeatie- en retentie-effect van de tumorcellen (EPR effect) (Figs. 4d and 5f), the enhanced permeability and retention (EPR) effect is a unique phenomenon of solid tumors related to their anatomical and pathophysiological differences from normal tissues. For example, angiogenesis leads to high vascular density in solid tumors, large gaps exist between endothelial cells in tumor blood vessels, and tumor tissues show selective extravasation and retention of macromolecular drugs [52]. So they might not be clearly detected under the same experimental condition. The results demonstrated that the endocytosis of Hela cells via receptor-mediated endocytosis was facilitated by the RGD peptides on the GNPs’ surface. The NLS peptides could also maintain their activity to specifically targeted nucleus. So our synthesized DRN-GNPs could be a very potential contrast agent for tumor targeted imaging.

The contents of the rows are listed as follows:“PBS buffer” represents the cells incubate with PBS buffer, “DRN-GNPs” represents the cells incubate with DRN-GNPs. The subscript of “1” represents the bright field images of cells, “2” represents the dark field images of cells, and “3” represents the overlapping images (bright-field and dark-field) of cells. All of the scale bars are 20 μm. The picture of E is a small region chosen from B₃ in Fig. 4, the picture of F is a small region chosen from D₃ in Fig. 4, the scale bars are 10 μm

TEM images of DRN-GNPs incubated in Hela and MCF-7 cells for 24 h. A₁ , A₂ , and A₃ are corresponding to HeLa cells while B₁ and B₂ are to MCF-7 cells

Table 2 shows the ratio values between the cells’ densitometric mean grey and the background in the same image, which has a positive correlation with the taken up amounts of DRN-GNPs by these two cell lines. The ratios of the cells incubated with PBS buffer and the MCF-7 cells were nearly 1.0, the brightness of cells was nearly close to the background. The ratio of Hela cells incubated with DRN-GNPs was 4.80, that means the synthesized DRN-GNPs could be specifically targeted and entered the tumor cells overexpressed the integrin α_v β₃ .

To confirm receptor-specific internalization of the DRN-GNPs, we investigated the cellular uptake of the DRN-GNPs by Hela and MCF-7 cells utilizing the TEM technique (see Fig. 5). There was a large amount of DRN-GNPs localized in the nucleus and cytoplasm regions of α_v β₃ -positive Hela cells (Fig. 5(A₁ - A₃ )). On the other hand, only a negligible amount of particles was found inside the cytoplasm regions of α_v β₃ -negative MCF-7 cells (Fig. 5(B₁ -B₂ )), they might be accumulated in the MCF-7 cells by means of the passive targeting EPR effect. We found that there were high contrast black continuous regions in the MCF-7 cells’ nucleus; they were uranyl acetate, which stained the nucleus, and they were different from the granular particles in the nucleus of Hela cells. The TEM images are consistent with the dark-field imaging results, indicating that the RGD and NLS peptides on the surface of GNPs facilitated the DRN-GNPs targeting Hela cells’ nucleus. So our synthesized DRN-GNPs could be used as a perfect contrast agent for tumor targeted imaging and diagnosis.

Cellular Therapeutic Efficacy Evaluation

To evaluate the therapeutic efficacy of DOX and DRN-GNPs at cell level, MTT assay was firstly carried out to study cell viability of Hela and MCF-7 cells under the treatment of these two samples for 24 h. DRN-GNPs demonstrated almost the same inhibition effect by killing nearly 70% of cells at the same DOX’s concentration (39.0 μg/mL, Fig. 6(A, B)). In line with the MTT results, when the concentration of DRN-GNPs was 40 μg/mL, the number and state of the Hela and MCF-7 cells were relatively good, so the concentration of 35 μg/mL was the suitable concentration for imaging. We observed that when the DRN-GNPs’ concentration was high to 60 μg/mL (Fig. 6(C₃ )), the Hela cells became necrosis obviously. When the concentration of DRN-GNPs goes high to 100 μg/mL, salient reduction of the number cells can be observed and clear cellular morphological change as the characteristic of necrosis was observed. The same concentration of conjugated DOX still exhibited nearly the same anti-tumor efficacy compared with the free DOX. These results indicated that our synthesized DRN-GNPs could be used not only as a contrast agent but also as a good drug delivery system.

MTT assay was used to qualitatively display in vitro anti-tumor activity of DOX and DRN-GNPs on Hela (a ) and MCF-7 cells (b ) for 24 h (100%). The concentrations of C₀ -C₅ are 0, 20, 40, 60, 80, 100 μg/mL for DRN-GNPs; the corresponding DOX’s concentrations are 0, 7.8, 15.6, 23.4, 31.2, 39.0 μg/mL. Data are represented as means ± standard deviations of triplicate samples (n =3). Images of Hela cells incubated with different concentration of DRN-GNPs (c )

The result detected by the flow cytometry in Fig. 7 also demonstrates the anti-tumor efficacy of DRN-GNPs. Viability of Hela cells when exposed to DRN-GNPs of different concentrations was measured by flow cytometry based assays. Two modes of cell death, apoptosis and necrosis, were measured using Annexinv-FITC and propidium iodide (PI) dyes, respectively (Fig. 7). Similar to the results of MTT assay, the data showed that DRN-GNPs induced cell necrosis was dose-dependent. The proportion of necrotic cells was 8% without incubating with DRN-GNPs; when the concentration was high to 100 μg/mL, the proportion of necrotic cells was 23.84%; that means our synthesized DRN-GNPs could kill Hela cells efficiently. The difference between the results of MTT and flow cytometry can be explained that the difference of cell number and the methods.

Representative two-dimensional contour density plots to determine fractions of live, apoptotic, and necrotic cells, when exposed to DRN-GNPs at different concentrations (0–100 μg/mL) for 24 h, respectively. Cell necrosis and apoptosis were measured by using PI and Annexinv-FITC dyes

Therapy Evaluation of DRN-GNPs in Tumor-Bearing Mice

To further determine whether DRN-GNPs induced a combined therapeutic effect on tumor cells in vivo, we evaluated the anti-tumor effect of DRN-GNPs in tumor-bearing mice for long-term intravenously injection of drugs. The saline group and the drugs of free DOX, DR-GNPs, and DN-GNPs intravenously injected groups were set as the control groups, in which the concentration of conjugated DOX was the same as that of the free DOX. We observed that the tumor sizes of DRN-GNPs-treated groups were obviously smaller than that of the saline, DOX, DN-GNPs, and DR-GNPs-treated groups (Fig. 8a). The tumor volume and body weight of the mice were monitored every 2 days. Significant variation of tumor volume and tumor weight among all of the treated groups is shown in Fig. 8d, f; the tumor volumes and tumor weight of DN-GNPs and DR-GNPs-treated groups were smaller than that of the free DOX-treated group, but still larger than that of the DRN-GNPs-treated groups because of the less targeted activity. That might be because DOX molecules are small, lack targeting, and they have a short half-life in vivo; therefore, they might be cleared out quickly. However, DRN-GNPs possess of strong stability in the blood system, long half-life, and highly targeted ability, so they can be targeted to the tumor site, and then play the anti-tumor effect of DOX. Between the DRN-GNPs intravenously injected and tumor-injected groups, the anti-tumor efficacy of the latter group is better than that of the former group because the drugs do not need a complex system of blood circulation into the focus. The tumor inhibition rate of DOX is less than 50%, and the rates of all of the DOX-conjugated GNPs are larger than 50%; they can be high to 66.7% and 57.7%, respectively. The HE stain results showed that there was a certain degree of damage for liver organs in the intravenous injected DRN-GNPs group (Fig. 9). Furthermore, the bio-toxicity of DOX, DR-GNPs, and DN-GNPs on tumor-bearing mice were also assessed by histological analysis. As shown in Fig. 8b, tumor cell volume of saline group is comparatively larger than that of treatment groups, and tumor cells demonstrate with more mitotic figures. All the results showed that the tumor inhibition effect of DRN-GNPs was the best among the GNPs. Thus, our synthesized DRN-GNPs could be used as a perfect DOX delivery system for tumor therapy.

een Tumor images isolated from tumor-bearing mice after treatment of saline, free DOX, DN-GNPs, DR-GNPs, and DRN-GNPs (tumor injection and intravenous injection). b The histological images of tumors of the mice after treated with saline, free DOX, DN-GNPs, DR-GNPs, and DRN-GNPs (tumor injection and intravenous injection). c Body weight, tumor volume (d ), tumor inhabitation rate (e ), and tumor’s weight (f ) of tumor-bearing mice during 14 days treatment; data are represented as means ± standard deviations (n =6)

The histological images of the main organs (heart, liver, spleen, lung, and kidney) of the mice after treated with saline, free DOX, DR-GNPs, DN-GNPs, and DRN-GNPs (tumor injection and intravenous injection)