Gerichte pH-gevoelige liposomale afgifte van morine via aptamer-goudnanodeeltjesconjugaten voor kankertherapie

Samenvatting

Deze studie beschrijft de synthese van een anticancer nanodeeltje: een door aptamers en goudnanodeeltjes (Apt-Au) gemodificeerde, pH-gevoelige liposoom beladen met morine (MSL), dat tumor-targetende eigenschappen vertoont. Tumorweefsel is lastig te behandelen omdat de microomgeving afwijkt van normaal weefsel; de pH is lager, wat de effectiviteit van geneesmiddelen doorgaans belemmert. Daarom hebben pH-responsieve geneesmiddelen veel aandacht gekregen. Goudnanodeeltjes (AuNP's) tonen potentieel als dragers door hun kleine formaat, goede biocompatibiliteit, gemakkelijke oppervlaktemodificatie en sterke celpenetratie. Apt-Au@MSL vertoont uitstekende monodispersiteit en tumor-targetende eigenschappen en kan in een zwak zure omgeving worden vrijgemaakt via dialyse. We screenden ons kankercelmodel met een MTT-test en vonden dat SGC-7901-cellen effectief de proliferatie kunnen onderdrukken. In vivo-resultaten tonen aan dat toediening van Apt-Au@MSL tumorgroei kan remmen in xenotransplantatiemuismodellen. HE-kleuring en TUNEL-assay bevestigen verder dat Apt-Au@MSL tumorapoptose bevordert. Apt-Au@MSL kan apoptose induceren door overproductie van reactieve zuurstofsoorten (ROS) en regulatie van meerdere signaalcrosstalk. Zowel bloedbiochemische tests als HE-kleuring suggereren dat deze materialen verwaarloosbare acute toxiciteit en goede biocompatibiliteit in vivo vertonen. Met zijn krachtige functie kan Apt-Au@MSL dienen als een target-gebaseerd anticancermateriaal voor toekomstige klinische kankerbehandeling.

Inleiding

Kanker, een van de meest voorkomende doodsoorzaken, leidt tot aanzienlijke economische verlies en schade aan de mensheid. Er zijn veel inspanningen geleverd voor de ontwikkeling van slimme geneesmiddelen voor kankerbehandeling. Vanwege hun vermogen om geneesmiddelen te beschermen tot ze de doelsite bereiken, kunnen polymernanodeeltjes de afgifte van therapeutische middelen verbeteren. Om ervoor te zorgen dat het therapeutische middel de actieve plek bereikt, worden hoogreactieve nanodeeltjes gebruikt. Zulke nanodeeltjes kunnen worden ontworpen om in materiaaleigenschappen te varieren onder verschillende biologische stimuli. Reactieve nanodeeltjes worden ontworpen met verschillende stimuli, waaronder externe stimuli (bijv. temperatuur en licht) en biologische stimuli (bijv. pH- of redoxcondities). Nanodeeltjes die op pH reageren, hebben onderzoeksaandacht getrokken vanwege pH-veranderingen na endocytose van nanodeeltjes. Materialen die op pH reageren, trekken ook aandacht omdat de pH-responsieve functie gemakkelijk kan worden geïntegreerd in diverse polymere structuren om een set van pH-responsieve nanodeeltjes te ontwerpen. Nanodeeltjes kunnen op pH reageren door verandering in oppervlaktechemie, verandering in deeltjesgrootte of -vorm, en afbraak of vrijgave van stoffen. Deze verandering in nanodeeltjeseigenschappen kan worden gebruikt om celopname en gecontroleerde vrijgave te reguleren. Daarom bieden pH-responsieve nanodeeltjes een krachtige strategie voor het ontwerp van therapeutische afgiftesystemen.

Morinehydraat (3,5,7,2′,4′-pentahydroxyflavone) is een natuurlijke actieve stof geïsoleerd uit Chinese kruidengeneesmiddelen of planten. Het is een progesteronverbinding en een secundair metaboliet van fenol in planten. Morine is wijd verspreid in de natuur en vertoont goede antioxidant, antikanker en significante anti-inflammatoire effecten. De potentie van morine voor diverse toepassingen heeft aanzienlijke interesse gewekt, maar deze wordt aanzienlijk beperkt door de lage wateroplosbaarheid en biobeschikbaarheid van de stof.

Liposomen (hol) samengesteld uit lecithine en ceramiden, onder andere, hebben een dubbellaagsstructuur bestaande uit amphifiele lipidmoleculen. Liposomen bieden wenselijke eigenschappen, zoals biocompatibiliteit, functionaliteit, verminderde bijwerkingen en de mogelijkheid om grote hoeveelheden geneesmiddel te encapsuleren. Ze kunnen efficiënt hydrofiele en hydrofobe middelen dragen en deze beschermen tegen externe condities, met succesvol transport naar getargette weefselgebieden. Verbeterde effectiviteit is geïntegreerd in het ontwerp om de pH-getriggerde vrijgave van het anticancermiddel in het tumorinterstitium via pH-gevoelige liposomen te faciliteren. Deze pH-gevoelige liposomen zijn speciale liposomen die geneesmiddel vrijgeven in weefselomgevingen en snel destabiliseren in zuure omgevingen, zoals endosomen van kankerweefsel.

Voor verbeterde selectiviteit en effectiviteit van tumorbehandeling, moeten pH-gevoelige liposomen worden gemodificeerd om tumor-getargette nanodeeltjes te vormen. DNA-aptamers zijn recent ontwikkeld als hoog selectieve en gevoelige biosensoren en beeldvormingssensoren, alsook als potentiële middelen voor kanker-getargette therapieën. De enkelstrengs DNA-aptamer AS1411 is aangetoond om te functioneren als chemotherapeutisch middel vanwege zijn hoge bindingsaffiniteit voor kankercelkernen. Deze aptamer (Apt) werd gecombineerd met AuNP's om een tweekomponenten nanoconstruct van Apt-beladen AuNP's te fabriceren die kan interageren met kankercelkernen. Sommige studies hebben ook aangetoond dat het ontwerp van liposoom-nanodeeltjeshybriden een rijk gereedschapskist kan bieden voor de fabricage van dergelijke multifunctionele modaliteiten. Een hybride liposoom-AuNP-vesicelsysteem bestaande uit kationische liposomen en AuNP's is ontworpen om medicijndoordringing in het tumorinterstitium te verbeteren en antikankeractiviteit te versterken.

Goudnanodeeltjes (AuNP's) worden beschouwd als goede medicijndragers en kunnen worden gemodificeerd met biogerelateerde moleculen om de kanker-getargette specificiteit te verbeteren. Met de oppervlaktemodificatie van AuNP's kan de aptamer van de sulfhydrylgroep worden gebruikt om het oppervlak van AuNP's te modificeren, wat kan worden getarget door de Au-S covalente binding, en de juiste sulfhydrylgroep op het nanogoudoppervlak kan aan het nanogoudoppervlak worden gehecht. Vanuit een ingenieurs- en toepassingsperspectief bieden ligand-gebonden goudnanomaterialen een krachtig platform om gerichte identificatie, detectie en behandeling te faciliteren.

In de huidige studie gebruikten we pH-gevoelige liposomen die morine encapsuleren en assembleerden Au-Apt dat op het oppervlak van de liposomen was gemodificeerd (Apt-Au@MSL). Morine, gekenmerkt door lage wateroplosbaarheid en biobeschikbaarheid, werd getransformeerd. De morfologie, grootte en andere eigenschappen van het bereide Apt-Au@MSL werden gekarakteriseerd. Het nieuwe nanodeeltje toonde tumor-getargette eigenschappen en hoge antikankeractiviteit. De antikankeractiviteit van Apt-Au@MSL werd in vitro en in vivo onderzocht.

Materialen en methoden

Materialen

L-α-Fosfatidylcholine (PC), cholesterol (Chol), cholesterylhemisuccinaat (CHEMS), morine (≥ 99,99%), natriumcitraat (99,9%), HAuCl₄·3H₂O (≥ 99,9%), polyvinylpyrrolidon (PVP, mw 40.000), NaOH (≥ 98,0%) en HCl (37%) werden aangeschaft bij Sigma-Aldrich Chemical Co. (VS). De AS1411-aptamer met een disulfide-modificatie werd gesynthetiseerd door TaKaRa (Dalian, China) met de volgende sequentie: 5′-HS-T-(C6-S-S-C6)-TTG GTG GTG GTG GTT GTG GTG GTG GTG G-3′. Thiazolylblauw tetrazoliumbromide (MTT), propidiumiodide (PI), calceïne en Alexa Fluor 488 Annexine V werden aangeschaft bij Sigma-Aldrich Chemical. Alle waterige oplossingen werden bereid in dubbel gedestilleerd water. Alle overige reagentia waren van de beste commercieel beschikbare kwaliteit.

Synthese van AuNP's

Maximaal 1 mL HAuCl₄·4H₂O (1%) werd opgelost in 25 mL Milli-Q water (pH = 5,5), en 50 mg PVP werd aan de oplossing toegevoegd. De verkregen oplossing werd in een driehalsige fles (150 mL) gegoten en 5 min behandeld met microgolf (MW) bestraling met mechanische roering. Vervolgens werd 1,5 mL natriumcitraatoplossing (1%) snel toegevoegd en 3 min MW-bebestrald. De oplossing werd verzameld door centrifugatie bij 10.000 toer/min gedurende 5 min.

Synthese van Apt-AuNP's

De disulfidebinding van de aptamers werd gespleten met tris(2-carboxyethyl)fosfine. Na 30 min werd de aptameroplossing (100 μL, 100 μM) toegevoegd aan 10 mL 5 nM AuNP-oplossing en vervolgens 24 u geïnculeerd om Au-AptNP's te vormen. Na 1 dag werd de mengseloplossing gezout met 2,5 mL van een 500 mM NaCl-oplossing tweemaal, gescheiden door 4 u.

Bereiding van pH-gevoelige liposomen

Liposomen samengesteld uit eieren-PC tot CHEMS tot Chol in de molaire verhouding 33:13:5 en 5% morine werden bereid door filmhydratatie. Eieren-PC, CHEMS, Chol en 2 mg morine werden opgelost in 8 mL CHCl₃, en de organische oplosmiddelen werden bij 40 °C verwijderd met een rotatieverdamper. Voor morine-liposomen werd de resulterende dunne lipidfilm gehydrateerd met 2% (g/v) PBS en daarna 15 min gesonicerd met een ijzbad. De uiteindelijke liposoom werd gesynthetiseerd en gestabiliseerd in het colloïdale systeem. Voor Apt-Au@Morine pH-gevoelige liposomen (Apt-Au@MSL) werd de lipidfilm gehydrateerd met 475 μg/mL Au-AptNP's in 5% dextrose gevolgd door sonicatie.

Karakterisatie

Ultraviolet-zichtbare spectroscopie (UV-Vis, S-3100 Photodiode Array, Scinco Co., Ltd., Korea) en Fourier-transformatie infraroodspectroscopie (FT-IR) werden uitgevoerd (Nicolet iS50, VS, Thermo Fisher Scientific). De morfologie van Apt-Au@MSL werd onderzocht met transmissie-elektronenmicroscopie (TEM, HT7700, Tokio Japan, Hitachi). Het vrijgavepercentage van morine werd gedetecteerd door UV-vis-spectroscopie. De morfologie van de morine-liposomen en Apt-Au@MSL werd ook waargenomen met scanning-elektronenmicroscopie (SEM, S-4800, Hitachi, Japan). Dynamische lichtverstrooiing (DLS) en zetapotentiaalmetingen werden gebruikt om de optische eigenschappen en grootten van morine-liposomen en Apt-Au@MSL te karakteriseren op een Brookhaven ZetaPALS potentiaalanalysator.

Celcultuur

De humane kankercellijnen SGC-7901, BGC-823, A549, HeLa, MCF-7 en Hs68 werden aangeschaft bij de American Type Culture Collection (ATCC) en onderhouden in RPMI met 10% foetaal kalverseum bij 37 °C en 5% CO₂.

In vitro antikankeractiviteitsstudie

SGC-7901, BGC-823, A549, HeLa, MCF-7 en Hs68 werden gezaaid op 96-gatenplaten (2,0 × 10³ cellen/put) en vervolgens gekweekt met Apt-Au@MSL in varierende concentraties (0, 5, 10, 15, 20 en 30 μg/mL). AuNP's en morine werden toegewezen als controlegroepen. De blanco groep bestond uit onbehandelde cellen. De 96-gatenplaten werden geïnculeerd in een gevochtigde incubator. Na incubatie werd 9,6 mL MTT-oplossing (5 mg/mL) aan elke put toegevoegd en verder 2 u geïnculeerd. Elke groep werd in driploop getest, en IC₅₀-waarden werden afgeleid van de gemiddelde OD-waarden van de driplooptests versus medicijnconcentratiecurves. De helderheid van elke groep werd verkregen door confocal fluorescentiemicroscopie.

Celadhesie werd gemonitord met een real-time celdetectiesysteem (RT-CES; ACEA Biosciences, Inc.) elke 10 min gedurende 75 u. Om celadhesie te bepalen, werd elke put in de plaat gezaaid met cellen (1,0 × 10⁴ cellen/put) met een vers medium tot een eindvolume van 200 μL en vervolgens geïnculeerd in een Apt-Au@MSL-oplossing in varierende concentraties (10, 20 en 30 μg/mL) bij 10 u geïnculeerd voor 12 u. De blanco groep bestond uit onbehandelde cellen, en de controlegroepen bestonden uit de morine- en morine-liposomgroepen.

Fluorescentiemicroscopie

SGC-7901-cellen werden overnacht in 48-gatenplaten gekweekt bij 37 °C, 5% CO₂. De cellen werden vervolgens behandeld met Apt-Au@MSL-oplossingen (10 en 30 μg/mL) in verschillende concentraties gedurende 12 u. De controlegroepen bestonden uit de morine- en morine-liposomgroepen. Vervolgens werd het medium verwijderd. De blanco groep bestond uit onbehandelde cellen. De cellen werden drie keer met PBS gewassen. De cellen werden gekleurd en vervolgens gemeten door co-kleuring van levende en dode cellen (de LIVE/DEAD-assay). Na co-kleuring met Calceïne-AM/PI gedurende 30 min werden de cellen tweemaal met PBS gewassen om overtollige kleurstof te verwijderen, en fluorescentiebeelden werden verkregen door confocal laserscanningsmicroscopie (CLSM) (voor calceïne-AM, Ex = 488 nm en Em = 515 nm; PI Ex = 535 nm en Em = 615 nm).

Apoptotische celdoodanalyse

Om de antikankereffecten van Apt-Au@MSL te meten, werd elke put in een zestudige plaat gezaaid met SGC-7901-cellen (1,0 × 10⁵ cellen/put) en vervolgens geïnculeerd in Apt-Au@MSL-oplossingen in varierende concentraties (5, 10, 20 en 30 μg/mL) gedurende 12 u. De blanco groep bestond uit onbehandelde cellen, en de controlegroepen bestonden uit de morine- en morine-liposomgroepen. Na behandeling werden de cellen verzameld en tweemaal met PBS gewassen. De cellen werden gekleurd met PI en Annexine V-FITC en vervolgens geanalyseerd met een CytoFLEX-analysator (Beckman Coulter) (voor PI, Ex = 535 nm en Em = 615 nm; Annexine V-FITC, Ex = 488 nm en Em = 525 nm).

Studies naar celwanddestructie

Om celwanddestructie in antikankerassays te bestuderen, werden SGC-7901-cellen in zestudige platen gekweekt bij 37 °C en 5% CO₂. De cellen die zonder materiaal werden gekweekt, dienden als blanco groep. Na de cellen te hebben gekweekt met Apt-Au@MSL in varierende concentraties (5, 10, 20 en 30 μg/mL) gedurende 12 u, werden ze behandeld met Trypsine-EDTA-oplossing 0,25%. Alle cellen (waaronder de zwevende cellen in het medium) werden verzameld met 2000 t/min gedurende 5 min. De verzamelde cellen werden vervolgens 4 u post-gefixeerd in 2,5% glutaraldehyde-oplossing. De gefixeerde cellen werden gedeshydrateerd in een acetongradientserie gedurende 20 min. De cellen werden uiteindelijk een reeks procedures onderworpen, op koperen grids gemonteerd en waargenomen met TEM (HT-7700, Hitachi, Japan).

Western blot-assay

De proteïnexpressie van SGC-7901-cellen werd gedetecteerd door Western blot-analyse. SGC-7901-cellen (4,0 × 10⁵ cellen/put) werden geïnculeerd op een 9-cm cultuurschaaltje en 20 μg/mL Apt-Au@MSL gedurende 1, 6, 12 en 24 u. Cellen werden na behandeling geoogst en in een cellysebuffer op ijs 1 u opgeschud. Het mengsel werd in een centrifuge geplaatst bij 11.000 g bij 4 °C gedurende 10 min, en de supernatans met het totale cellulaire eiwit werd verzameld. De totale eiwitconcentratie in de supernatans werd bepaald met de BCA-methode. Het eiwit werd vervolgens heropgelost in het laadbuffer en 10 minuten bij 100°C gekookt. Monsters met gelijke hoeveelheden eiwit (40 μg/baan) werden aan SDS-PAGE (10% tricine-gelen) onderworpen. Vervolgens werden ze op nitrocellulose (NC) membranen overgebracht bij 100 V gedurende 1,5 u en geblokkeerd met 5% magere melkpoeder in Tris-gebufferde zoutoplossing met 0,1% Tween-20 (TBST) gedurende 1 u. Vervolgens werd de NC-membraan met de primaire antilichamen en het tweede antilichaam geïnculeerd. Doelwiteiwittenbanden werden op de membraan gevisualiseerd met ECL Western blotting detectiereagentia. β-actine werd gebruikt als interne controle voor gelijke eiwitlading en -overdracht. De eiwitexpressie werd gekwantificeerd met Quantity-One Software, en de expressiesnelheid werd onder de band gelabeld.

Diermodel

BALB/c mannelijke naakte muizen (~ 17 g) werden aangeschaft bij het Model Animal Research Center van Nanjing University en geteeld in een axenische omgeving (specifieke pathogen-vrije dieren). Tumormodellen werden gevestigd door subcutane injectie van celsuspensie (SGC-7901-cellen, 100 μL, 1 × 10⁶/mL) in de schouder van de naakte muizen. Helderheidbeelden van de tumor werden gegenereerd 15 dagen na de subcutane injectie van tumorcellen. Alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de protocollen goedgekeurd door het Laboratoriumdierencentrum van Anhui Agricultural University (Vergunningsnummer: SYXK 2016-007). Een schuifmaat werd gebruikt om de maximale lengtediameter (lengte) en maximale dwarsdiameter (breedte) van elke tumor te bepalen. Het tumovolume werd vervolgens berekend met de formule lengte × breedte² × 0,5.

In vivo antikankerstudie

Opvolgingstesten werden uitgevoerd wanneer het tumovolume 50 mm³ bereikte. Muizen willekeurig verdeeld in vijf groepen werden de volgende intraveneuze behandelingen onderworpen: PBS (100 μL), morine, morine-liposomen, Au-Apt en Apt-Au@MSL. De muizen werden intraveneus in de staart geïnjecteerd met een dosis van 2 mg/kg van het materiaal voor behandeling. De tumorformaten van de muizen werden na 24 dagen gemeten. Het lichaamsgewicht en de overleving van de muizen werden ook bepaald. De muizen werden gedood, en tumor- en orgaanjeweefsels van de muizen werden verzameld voor HE-kleuring.

Na blokkeren en permeabilisatie werden de tumorplaatjes met PBS gewassen, gekleurd met TUNEL-assay en onderwerp van DAPI-contrastkleuring. Fluorescentiebeelden werden verkregen door CLSM. Voor DAPI-beeldvorming: Ex = 358 nm en Em = 461 nm, en voor TUNEL-assay: Ex = 450–500 nm en Em = 515–565 nm.

Toxiciteitsevaluatie-assay

Om de toxiciteit van Apt-Au@MSL-behandeling op vitale organen te evalueren, werden de muizen in de vier behandelingsgroepen na 30 dagen geofferd. De belangrijke organen (lever, milt, nieren, hart, longen en tumor) van de muizen uit alle groepen werden verzameld en met HE gekleurd. Bloedmonsters werden ook verzameld, en bloedglucose werd gemeten. Daarnaast werden de gewichten van de muizen bepaald.

Resultaten en discussie

Karakterisatie

Deze studie had tot doel een nieuw liposoom te ontwikkelen dat de voordelen van nanodeeltjes (Apt-beladen AuNP's) bezit en effectief kan worden gebruikt als antikankermiddel. De basiseigenschappen van de nieuwe liposomen zijn belangrijk voor verdere studies. Apt-Au@MSL werd gesynthetiseerd zoals beschreven in een eerdere studie, met kleine wijzigingen, en vervolgens gekarakteriseerd met verschillende methoden. UV-vis-spectroscopie toont de karakteristieke piek en kan de vorming van AuNP's monitoren. Karakteristieke pieken werden waargenomen in het UV-vis-spectrum van AuNP's op ongeveer 530 nm. Specifiek vertoonde UV-vis-spectraanalyse sterke UV-absorptie, beïnvloed door oppervlakte-Apt-modificatie. Dezelfde resultaten werden waargenomen. Karakteristieke pieken verschoven na pH-gevoelige liposomen waren gecoat met morine. De karakteristieke piek van het gefabriceerde Apt-Au@MSL bevond zich op 362 en 550 nm. Deze resultaten gaven aan dat de synthese met succes was voltooid. Voor verdere karakterisatie werd FT-IR-spectroscopie uitgevoerd om de synthese-resultaten te verifiëren. De karakteristieke piek roodverschuiving van morine-liposomen en Apt-Au@MSL gaf verder aan dat de modificatie van morine succesvol was. We voerden een morine-vrijgaveassay uit in PBS bij verschillende pH-waarden om de pH-gevoeligheid van Apt-Au@MSL te bepalen. Deze drie pH-waarden simuleren de neutrale omgeving van de bloedsomloop, de zwak zure omgeving van de tumor en de zuure omgeving van het intracellulaire lichaam. Het vrijgavepercentage van morine werd gedetecteerd door UV-vis-spectroscopie. Bij pH 5,0 werd ongeveer 54% van de morine binnen 24 u vrijgemaakt, en continue vrijgave werd waargenomen in de daaropvolgende 96 u; terwijfel, bij pH 7,4 werd slechts ongeveer 10% van de morine binnen 24 u vrijgemaakt. Deze resultaten tonen aan dat Apt-Au@MSL goede stabiliteit vertoont onder normale fysiologische condities, wat lekkage van het geneesmiddel voorkomt; het geneesmiddel wordt echter snel vrijgemaakt in het kernlichaam. Dit vrijgavegedrag kan de behandelingseffectiviteit effectief verbeteren.

TEM en SEM werden uitgevoerd om de structuren van het liposoom en Apt-Au@MSL te verduidelijken. TEM werd uitgevoerd om de structuren van de AuNP's te verduidelijken. De AuNP's hebben een deeltjesgrootte van ongeveer 10 nm, wat consistent is met de grootte van de modificatie op de liposomen. De SEM-resultaten tonen aan dat ruwe liposomen uitsluitend unilamellaire vesikels vormen met een non-uniforme diameter van ongeveer 120 nm, wat consistent is met de grootte bepaald door DLS. In tegenstelling hiertoon toont Apt-Au@MSL dat de morfologie van hybride vesikels toegeschreven wordt aan Au-Apt-modificatie. De diameter van 150 nm was ook consistent met de grootte bepaald door DLS. Opvallend was dat TEM-onderzoek van de interacties tussen de pH-gevoelige liposomen en Au-Apt onthulde dat de AuNP's vrijwel uitsluitend geassocieerd waren met de vesiculaire lipidedubbellaag en gelokaliseerd aan de periferie van de vesikels. De ζ-potentiaalmetingen tonen aan dat de zetapotentialen van AuNP's en Au-Apt negatief zijn. Het resultaat toont aan dat zowel AuNP's (−57,1 ± 0,3 mV) als Au-Apt negatief geladen zijn (−31,7 ± 0,2 mV). Apt-Au@MSL werd gemodificeerd met positief geladen morine-liposomen, en het potentiaal veranderde naar 36,4 ± 0,3 mV. Positieve en negatieve ladingadsorptie is het mechanisme waarmee Au-Apt en morine-liposomen binden. Bovendien vertegenwoordigt de verandering in de encapsulatiesnelheid van het deeltje in de loop van de tijd de stabiliteit van het deeltje over een bepaalde periode. De encapsulatiesnelheid van het deeltje verandert nauwelijks binnen 24 u, wat aangeeft dat het deeltje goede stabiliteit vertoont over een bepaalde periode. De standaardcurve van morineconcentratie versus de UV-Vis-absorptie van morine werd opgesteld om de encapsulatiesnelheid van morine-liposoom en Apt-Au@MSL te bestuderen. De resultaten onthulden dat de ingesloten efficiëntie van morine-liposoom en Apt-Au@MSL 90,2% en 89,6% kan bereiken.

Antikankeractiviteitstest van Apt-Au@MSL

In vitro

Morine vertoont superieure antitumooractiviteit maar heeft lage biobeschikbaarheid vanwege zijn lage wateroplosbaarheid. Na encapsulatie van morine door pH-gevoelige liposomen en transformatie in een wateroplosbaar materiaal, werd het oppervlak van het liposoom gemodificeerd met Au-Apt om het getargette antitumoreffect te verkrijgen. De antikankeractiviteit van Apt-Au@MSL wordt getoond door MTT-assay in vitro. De medicijnconcentratie wordt gedefinieerd door de morineconcentratie. De morine-behandelde groep toonde geen duidelijke antikankeractiviteit, vergeleken met de blanco groep. De groep behandeld met morine geencapsuleerd door pH-gevoelige liposomen vertoonde verbeterde antikankeractiviteit. Het resultaat suggereert dat de antitumooractiviteit van morine-liposomen superieur was aan die van rauwe morine. Tegelijkertijd vonden we dat de antitumooractiviteit van de door Apt gemodificeerde liposoom (Apt-Au@MSL) was verbeterd. De IC₅₀-waarden van morine, morine-liposomen, Apt-Au@MSL en cisplatine worden weergegeven. Morine, morine-liposomen en Apt-Au@MSL vertoonden een breed bereik van antikankeractiviteit op tumorcellen. Ze toonden een duidelijke voorkeur voor SGC-7901-cellen met hoge potentie en lage toxiciteit naar normale humane cellen. De IC₅₀-waarde van Apt-Au@MSL was 15,6 ± 1,5 μg/mL voor de SGC-7901-cellen. Deze resultaten werden verder bevestigd door RTCA-testen. De SGC-7901-cellen werden gekweekt met Apt-Au@MSL in verschillende concentraties; de blanco groep werd behandeld met PBS, en de controlegroep bestond uit morine en morine-liposomen. Adhesie en uitbreiding werden gemonitord met iCELLigence. De resultaten waren grotendeels vergelijkbaar met die verkregen door MTT-testen. De antikankeractiviteit van Apt-Au@MSL was significant hoger dan die van morine en morine-liposomen. Apt-Au@MSL kon de proliferatie van SGC-7901-cellen remmen met een toename in concentratie. Veranderingen in celmorfologie na Apt-Au@MSL-behandeling werden ook waargenomen door fluorescentiemicroscopie. Zonder Apt-Au@MSL behouden SGC-7901-cellen de structurele integriteit van de cel. In tegenstelling hiertoe is celintegriteit aangetast na behandeling met Apt-Au@MSL in verschillende concentraties.

Apoptotische celdoodanalyse

Kwantitatieve analyse van apoptose werd uitgevoerd door stroomcytometrie met Annexine-FITC-kleuring. De cellen werden gekleurd met PI en Annexine V-FITC en vervolgens geanalyseerd met een CytoFLEX-stroomcytometer (Beckman Coulter). Annexine V werd gebruikt om vroege apoptotische cellen te detecteren gebonden aan het blootgestelde fosfatidylserine, en PI-kleuring werd gebruikt om late apoptotische cellen te kleuren. De apoptoseratio was 1,57% voor de blanco groepen. De met morine behandelde cellen toonden een apoptoseratio van 3,51%. Apt-Au@MSL in verschillende concentraties vertoonde een hogere inductiecapaciteit met apoptoseratio's van 7,44%, 10,75%, 15,53% en 40,77%. De verhoogde apoptose bevestigde de uitstekende antikankeractiviteit geïnduceerd door Apt-Au@MSL. De apoptoseratio van de SGC-7901-cellen steeg met toename van de Apt-Au@MSL-concentratie.

Antikankeractiviteitsstudie door fluorescentie-assay

Het antitumoreffect op SGC-7901-cellen geïnduceerd door Apt-Au@MSL werd intuïtief geëvalueerd door LIVE/DEAD-fluorescentie-assays. Na incubatie van cellen met morine, morine-liposomen en Apt-Au@MSL in verschillende concentraties, werden ze 30 min in het donker geco-kleurd met de LIVE/DEAD-kit. In de blanco groep tonen alle groene fluorescerende cellen levende cellen. De controlegroepen, waaronder morine en morine-liposomen, tonen het aantal rode fluorescerende cellen. De met Apt-Au@MSL behandelde cellen in verschillende concentraties vertoonden echter duidelijk een groot aantal apoptotische cellen. Met toename van de concentratie namen levende cellen geleidelijk af. Het percentage dode cellen nam voornemelijk toe, en de celdichtheid nam af. Het resultaat bevestigde dat Apt-Au@MSL effectief tumorapoptose kan bevorderen.

Celintegriteitstudie

Om de invloed van opname en transport van Apt-Au@MSL op de SGC-7901-cel te bevestigen, voerden we een TEM-assay uit. De verandering in celmorfologie werd waargenomen door TEM. TEM-beelden werden gemaakt om de interne structuur van de cellen te observeren en een referentie te bieden voor antikankermechanismen. De blanco beelden van de SGC-7901-cellen zonder behandeling vertoonden significante veranderingen in de morfologie en het uiterlijk van duidelijke celwanden. In de controlegroep (morine en morine-liposomen) toonde de celmorfologie gedeeltelijke schade, en het kerngebied krimpte. Echter, significante veranderingen in de celwand en interne structuur werden ook waargenomen na blootstelling aan Apt-Au@MSL. Het cytoplasma lekte, en de kernstructuur werd onduidelijk. Veel celfragmenten werden gevormd rondom holle cellen. Daarnaast desintegreerden of werden de celwanden vernield. Hele profielen werden onduidelijk, cellen waren beschadigd, en het cytoplasma lekte. De rode pijlen vertegenwoordigen het AuNP-gebied. Naarmate de concentratie van Apt-Au@MSL toenem, verschenen er meer AuNP-gebieden in de kern. Dit suggereerde de vrijgave van morine nadat Apt-Au@MSL de celbinnen was binnengedrongen, wat de verschijning van een grote hoeveelheid AuNP's verklarde. Deze resultaten suggereren dat antitumooractiviteit geassocieerd was met aangetaste celintegriteit en kernstructuur.

Moleculair mechanisme geïnduceerd door Apt-Au@MSL

Om het moleculaire mechanisme van Apt-Au@MSL-geïnduceerde apoptose te verkennen, detecteerden we de expressieniveaus van caspases en PARP. Activering van caspase-3, -8 en -9 werd eerst gedetecteerd met specifieke substraten. Apt-Au@MSL-behandeling induceert dosis-afhankelijke activering van caspase-3, -8 en -9. Caspase-9 bevordert mitochondria-gemedieerde apoptose meer dan caspase-8, wat aangeeft dat de mitochondria-gemedieerde apoptosesignaalweg dominant is. Western blot-analyse bevestigde verder het bestaan van Apt-Au@MSL-geïnduceerde apoptose op eiwitniveau. Na behandeling van cellen met Apt-Au@MSL toont activering van caspases en splitsing van PARP tijds- en dosisafhankelijkheid. Concluderend: Apt-Au@MSL remt de groei van SGC-7901-cellen voornamelijk door apoptose te induceren.

Apt-Au@MSL remt tumorgroei

In vivo

De in vivo antitumooractiviteiten van Apt-Au@MSL werden geëvalueerd met behulp van een SGC-7901-tumor-xenotransplantatiemodel. Vergelijking van de tumorbeelden met die van de controlegroep (morine en morine-liposomen) toonde aan dat muizen behandeld met Apt-Au@MSL het gewicht en de grootte van de tumor aanzienlijk reduceerden. De relatieve tumovolumecurves en de muisgewichts-curves geven aan dat Apt-Au@MSL in vivo een hogere antikankerefficiëntie vertoont dan de andere behandelingsgroepen. Er was geen significant verschil in gemiddeld tumovolume tussen de controlegroep (morine en morine-liposomen) en de blanco groep. Het tumovolume van de Apt-Au@MSL-groep was slechts bijna een tiende van de blanco groep en bijna een zesde van de controlegroep. Het resultaat gaf aan dat rauwe morine en morine-liposomen bij 40 mg/kg geen effect uitoefenden op de groeisnelheid van tumoren. Echter, Apt-Au@MSL kon tumorgroei remmen. Het lichaamsgewicht van muizen in de verschillende groepen (PBS, morine, morine-liposomen en Au-Apt-groepen) toonde geen duidelijke fluctuatie tijdens de behandelingsperiode. Dit resultaat suggereerde dat de behandeling verdragen werd en geen acute bijwerkingen veroorzaakte. Opvallend was dat muizen met Apt-Au@MSL-behandeling een aanzienlijk verlengde overleving vertoonden. De overlevende muizen in deze groep gedroegen zich normaal, zonder duidelijke tekenen van ongezondheid. Deze resultaten toonden aan dat toediening van Apt-Au@MSL tumorgroei kan remmen in xenotransplantatiemuismodellen.

Histologische analyse van antikankeractiviteit

HE-kleuring van tumorweefsel en orgaanmonsters werd uitgevoerd na fixatie en behandeling. Behandelingsdoeltreffendheid ten aanzien van tumorceldood werd ook geëvalueerd door HE-kleuring van tumorweefsel uit verschillende groepen. Muisbehandeld met Au-Apt, morine en morine-liposomen toonden dezelfde mate van thermische schade als de muizen in de blanco groep. Geen duidelijke apoptose werd waargenomen in de blanco groep. De tumorweefselcoupes bestonden uit dichtgepakte tumorcellen. Echter, Apt-Au@MSL-behandeling vertoonde de meest significante schade aan het tumorweefsel, met matige celapoptose in de tumor. Het resultaat suggereerde antikankeractiviteit in de muismodellen behandeld met Apt-Au@MSL. Om de verhouding van apoptotische cellen in tumorweefsel in vivo verder te onderzoeken, werd TUNEL-assay uitgevoerd voor de detectie van apoptotische cellen. De apoptotische cellen in tumoren kunnen met groene fluorescentie gekleurd worden om apoptose aan te tonen. De samengevoegde beelden tonen minder groene fluorescerende gebieden in de blanco groep en de controlegroep (morine en Au-Apt), wat duidt op minder apoptotische cellen. De cellen van de muizen behandeld met morine-liposomen lijken deels apoptotisch. Bovendien werden een groot aantal groene fluorescerende gebieden waargenomen in de groep behandeld met Apt-Au@MSL, wat duidt op een grote hoeveelheid apoptotische cellen. De resultaten waren consistent met die van HE-kleuring, wat bevestigt dat Apt-Au@MSL tumorapoptose in vivo kan bevorderen.

In vivo toxiciteitsevaluatie

De potentiële in vivo toxiciteit is vaak een belangrijke zorg voor de klinische toepassing van anticancergeneesmiddelen. Om de toepasbaarheid van Apt-Au@MSL in vivo te verifiëren, werden de muizen geëvalueerd onder verschillende behandelingen (morine, morine-liposomen, Au-Apt en Apt-Au@MSL). Bloedbiochemische assays werden ook uitgevoerd om mogelijke veranderingen in de biochemie van muizen na behandeling te onderzoeken. De bloedglucose-index voor de bloedfunctie van de Apt-Au@MSL-groepen was vergelijkbaar met die van de blanco en controlegroepen. Geen verschil in lichaamsgewicht werd gevonden in elke groep. Een stijgende toename werd waargenomen, wat aangeeft dat het geneesmiddel geen toxiciteit vertoonde. HE-kleuring van orgaancoupes toonde geen tekenen van schade of inflammatie in de groep behandeld met Apt-Au@MSL, vergeleken met de blanco en controlegroep. Deze bevinding gaf aan dat PBS, morine, morine-liposomen, Au-Apt en Apt-Au@MSL verwaarloosbare bijwerkingen in vivo vertoonden. Deze resultaten, alsook die van HE-kleuring, duiden verder op veiligheid in het gebruik van Apt-Au@MSL voor tumorbehandeling.

Conclusies

Concluderend presenteert deze studie de synthese van een antitumornanomateriaal, Apt-Au@MSL. Apt-Au@MSL vertoonde uitstekende monodispersiteit en tumor-targetende eigenschappen. De polariteit van morine werd gemodificeerd, en de antitumooractiviteit werd verbeterd. De pH van de oplossing was 5,0, en de vrijgavesnelheid van morine uit Apt-Au@MSL was de hoogste in de karakterisatie-experimenten. Apt-Au@MSL toonde dat de morfologie van hybride vesikels toegeschreven werd aan Au-Apt-modificatie. De diameter van 150 nm was consistent met de grootte bepaald door DLS. We screenden ons kankercelmodel met MTT-assay en vonden dat SGC-7901-cellen effectief proliferatie konden onderdrukken. De IC₅₀ van Apt-Au@MSL was 15,6 ± 1,5 μg/mL voor de SGC-7901-cellen. Fluorescentie-stroomcytometrische assays bevestigden dat Apt-Au@MSL kan worden gebruikt als effectief anticancermateriaal en apoptose in vitro induceerde. De Apt-Au@MSL die in de interne cel werd gevonden, zoals getoond in de TEM-beelden, suggereerde dat Apt-Au@MSL de kankercel kon targeten. De toediening van Apt-Au@MSL kon tumorgroei remmen in xenotransplantatiemuismodellen, vastgesteld uit tumorgewichtstesten. HE-kleuring en TUNEL-assay bevestigden verder dat Apt-Au@MSL tumorapoptose in vivo kon bevorderen. Zowel bloedbiochemische testen als HE-kleuring suggereerden dat deze materialen verwaarloosbare acute toxiciteit en goede biocompatibiliteit in vivo vertonen.