Icariïne-geladen mPEG-nanopartikelen: verbeterde bescherming tegen LPS-geïnduceerde cardiotoxiciteit in H9c2-cellen

Samenvatting

Icariïne (ICA), een flavonol-glycoside uit Epimedium, vertoont cardioprotectieve, antioxidante en anti-inflammatoire eigenschappen, maar lijdt aan slechte wateroplosbaarheid, snelle clearance en lage orale biobeschikbaarheid. We synthetiseerden een hydrofiele polyethyleenglycol-monomethylether (mPEG) conjugaat (mPEG-ICA) via succijnzuuranhydride-gemedieerde esterificatie, en encapsuleerden vervolgens vrije ICA in het polymer door dialyse om ICA-geladen mPEG-ICA-nanopartikelen (NP's) te vormen. Fourier-transformatie-infraroodspectroscopie (FT-IR) en protonen-kernmagnetische-resonantie (¹H-NMR) bevestigden succesvolle conjugatie. Dynamische lichtspriding (DLS) onthulde een gemiddelde hydrodynamische diameter van 220 ± 13,7 nm met een ζ-potentiaal van +2,30 ± 1,33 mV, terwijl transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) een uniforme, sferische morfologie toonde. In fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) bij pH 7,4 gaven de nanopartikelen 52,8 ± 1,7% ICA vrij over 72 u; bij pH 6,8 versnelde de vrijgave tot 75,7 ± 0,2% binnen 48 u. In vitro behielden de NP's de H9c2-celviabiliteit, verminderden lactaatdehydrogenase (LDH)-lekken en remden apoptose geïnduceerd door lipopolysaccharide (LPS). Bovendien werden mRNA-niveaus van de pro-inflammatoire cytokines TNF-α, IL-1β en IL-6 merkbaar onderdrukt. Deze resultaten tonen aan dat ICA-geladen mPEG-ICA NP's een veelbelovend nanomedicine-platform bieden voor het mitigeren van LPS-gemediaal myocariale letsel.

Inleiding

Cardiale remodelling na myocardiale letsel wordt grotendeels gedreven door duurzame inflammatoire signalering, met name via TNF-α, IL-1β, IL-6 en IL-18. Deze cytokines triggeren oxidatieve stress, fibroblastactivatie en cardiomyocytaapoptose, wat uiteindelijk de cardiale functie compromiseren. Icariïne (C₃₃H₄₀O₁₅) is uitgebreid gerapporteerd om immunomodulerende, antioxidante en anti-apoptotische effecten uit te oefenen in preklinische modellen, doch haar therapeutisch potentieel wordt beperkt door hydrofobiciteit, snelle systemische clearance en slechte orale absorptie. Nanodragersystemen – zoals micellen, liposomen en polymere nanopartikelen – zijn opgedoken als effectieve strategieën om medicijnoplosbaarheid te verbeteren, circulatiatijd te verlengen en gerichte aflevering aan geïnflameerd cardiaal weefsel te bereiken, gebruikmakend van het verbeterde permeabiliteits- en retentie-effect (EPR).

Polyethyleenglycol-monomethylether (mPEG) biedt superieure hydrofiliciteit, biocompatibiliteit en minimale immunogeniciteit vergeleken met lineair PEG. Door ICA covalente te koppelen aan mPEG-COOH via een esterbinding, creëren we een hydrofiel-hydrofoob amfifiel dat in staat is tot zelfassemblage in nanopartikelen. De esterbinding is zuur-labil, wat pH-responsieve vrijgave van ICA toelaat in de licht zuur micro-omgeving (pH ≈ 6,8) kenmerkend voor geïnflameerd myocard. Deze studie beschrijft de synthese van mPEG-ICA, encapsulatie van ICA in nanopartikelen, fysicochemische karakterisatie, in-vitro vrijgaveprofiel, en evaluatie van cardioprotectieve effectiviteit tegen LPS-geïnduceerde schade in H9c2-cellen.

Materialen en methoden

Experimentele instrumenten

Belangrijke analytische instrumenten omvatten een JA302 elektronische balans, RE52CS‑1 rotatieverdampers, 78HW‑1 magnetische roerder, 101‑OA blast-droger, NEXUS670 FT‑IR-spectrometer, UV–Vis-spectrofotometer, TEM Glacios, JP‑010S ultrasonische disperser, real-time qPCR-systeem, enzyme-gekoppelde fluorescentie-analyser, Olympus omgekeerde microscoop, Leica fluorescentiemicroscoop, en een Thermo CO₂-incubator.

Experimentele reagentia

Reagentia van analytische graad werden verkregen van commerciële leveranciers: Icariïne (95%, 1 g, DL070208), LPS (55 mg, Sigma, Z06J9Y52452), mPEG-Me (250 g, Sigma, MKBT7172), dichloormethaan (500 mL, Sinopharm), 4-dimethylaminopyridine (100 g, Aladdin), N-hydroxysuccinimide (100 g, Ruiyong), FastKing cDNA-synthesekit (Tiangen), Biyuntian apoptosekit, SYBR Green qPCR-kit (QIAGEN), onder anderen.

Synthese van mPEG-COOH

mPEG (5 g), succijnzuuranhydride (0,40 g) en DMAP (0,50 g) werden gereageerd in 50 mL dichloormethaan bij 60 °C gedurende 2 u onder reflux. Het mengsel werd verdampt, en het resulterende witte vast werd gezuiverd door dialyse (2 kDa MWCO) tegen water gedurende 48 u. Vriesdrog product leverde mPEG-COOH op.

Synthese van mPEG-ICA-polymer

mPEG-COOH (0,37 g) werd geactiveerd met NHS (0,024 g) en DMAP (0,026 g) in 10 mL droge DMSO, daarna gereageerd met 100 mg ICA (opgelost in 5 mL droge DMSO) onder stikstof bij kamertemperatuur gedurende 48 u. Na uitgebreide dialyse tegen water en vriesdrogen, werd mPEG-ICA-polymer verkregen.

Bereiding van ICA-geladen mPEG-ICA-nanopartikelen (NP's)

mPEG-ICA (5 mg) werd opgelost in 2 mL DMSO en gemengd met 5 mg ICA in DMSO, gevolgd door de toevoeging van 5 mL gedistilleerd water. Na 15 min roeren bij kamertemperatuur werd het mengsedialyseerd (3500 Da MWCO) gedurende 24 u met frequente waterverversingen, daarna gefilterd om ICA-geladen mPEG-ICA NP's te leveren.

Fourier-transformatie-infraroodspectroscopie

Monsters werden gemengd met KBr, in pelletten geperst, en gescand van 4000 tot 400 cm⁻¹ om functionele groeptransformaties te bevestigen.

Kernmagnetische-resonantie waterstofspectrum

Monsters werden opgelost in DMSO-d₆ en geanalyseerd op een 500 MHz NMR-spectrometer om chemische verschuivingen consistent met esterificatie te bevestigen.

UV–Vis-spectrum

Een calibratiecurve van ICA bij 270 nm werd gegenereerd; concentraties van polymer en nanopartikelen werden gekwantificeerd met deze curve.

Karakterisatie van ICA-geladen mPEG-ICA NP's

Dynamische lichtspridingdetectie

Deeltjesgrootteverdeling en ζ-potentiaal werden gemeten met een Zetasizer 3000hs na vriesdrogen en herdispersie in water; elk monster werd in drievoud geanalyseerd.

Morfologieobservatie door TEM

1,0 mg/mL NP-suspensie werd aangebracht op koolstof-bekopperde koperen roosters, gekleurd met 2% fosfo-wolfraamzuur, en geïmageerd bij 80 kV.

Stabiliteitsmeting

NP's werden vriesgedroogd met 5% mannitol, hergedispergeerd in water, en grootte/PDI gemonitord om opslagstabiliteit te beoordelen.

Bepaling van medicijnlading en encapsulatie-efficiëntie

Medicijnlading (EE%) en encapsulatie-efficiëntie (LC%) werden berekend uit UV-Vis-absorptie met de formules: EE = medicijnmassa in NP's / totale massa van NP's × 100%; LC = medicijnmassa in NP's / initiële medicijnmassa × 100%.

In-vitro medicijnvrijgave

NP's werden geplaatst in 25 mL PBS (pH 7,4 of 6,8) bij 37 °C met 100 rpm roeren. Monsters (2 mL) werden op gedefinieerde intervallen onttrokken, vervangen door vers medium, en geanalyseerd door UV–Vis bij 270 nm. Cumulatieve vrijgave (%) werd berekend met de standaardvergelijking.

Celexperiment

H9c2 ratcardiomyoblasten werden gekweekt in DMEM + 10% FBS bij 37 °C/5% CO₂. Cellen werden gezaaid in 96-putplaten (10⁴ cellen/put) voor viabiliteit, LDH, apoptose en qPCR-assays.

Celbehandeling met LPS of ICA-nanopartikelen

Cellen werden verdeeld in vijf groepen: (1) controle (geen behandeling), (2) LPS (10 µg/mL) gedurende 24 u, (3) ICA (20 µM) + LPS, (4) mPEG-ICA-polymer (20 µM) + LPS, (5) ICA-geladen mPEG-ICA NP's (20 µM) + LPS.

MTT

Na 24 u behandeling werd 0,5 mg/mL MTT toegevoegd voor 4 u. Formazan werd opgelost in DMSO en absorbantie gemeten bij 570 nm.

Lactaatdehydrogenase (LDH)-vrijgave

LDH-activiteit in cultuursupernatanten gekwantificeerd met een commercieel kit; absorbantie gelezen bij 490 nm.

Hoechst 33342-kleuring

Kernmorfologie werd onderzocht na 15 min kleuring met Hoechst 33342 (1 µg/mL) en geïmageerd onder een fluorescentiemicroscoop. Apoptose-index = apoptotische kernen/totale kernen × 100%.

TUNEL-assay

DNA-fragmentatie werd gedetecteerd met een TUNEL-kit; apoptotische kernen geteld als groene fluorescentie ten opzichte van totale DAPI-gekleurde kernen.

Stroomcytometrie om apoptose te detecteren

Annexin V-FITC/PI dubbele kleuring werd uitgevoerd; vroege en late apoptotische populaties gekwantificeerd door stroomcytometrie.

Reverse-transcriptie kwantitatieve polymerase-kettingreactie (RT–qPCR)

RNA werd geëxtraheerd met TRIzol, reverse-getranscribeerd, en geampliceerd op een Bio-Rad CFX96-systeem met SYBR Green. Genexpressie van TNF-α, IL-1β, IL-6 en actine (huishoudgen) genormaliseerd aan actine. Primer-sequenties zijn vermeld in het originele manuscript.

Resultaten en discussie

FTIR en ¹H-NMR-spectra

FT-IR-spectra toonden karakteristieke ester-carbonylabsorpties bij 1700 en 1740 cm⁻¹, wat succesvolle conjugatie bevestigde. ¹H-NMR onthulde fenolische hydroxysignalen bij 12,6 ppm, aromatische protonen bij 7,5 ppm, en methyleneprotonen van de PEG-keten bij 3,5 ppm, wat de aanwezigheid van zowel ICA- als mPEG-moieties bevestigde.

FTIR-spectra van mPEG-ICA (A), ICA (B) en mPEG-COOH (C). ¹H-NMR-spectra voor mPEG-COOH en mPEG-ICA.

Deeltjesgrootte, zeta-potentiaal en TEM

De kernpolymer NP's gemiddelde 145 ± 15,2 nm (PDI = 0,277), terwijl ICA-geladen NP's uitgebreid tot 220 ± 13,7 nm (PDI = 0,119). Zeta-potentialen verschoven van +0,44 ± 0,26 mV naar +2,30 ± 1,33 mV na lading, wat verbeterde colloïdale stabiliteit aangeeft. TEM-afbeeldingen bevestigden een sferische, uniforme morfologie (Fig. 2).

Deeltjesgrootte, zeta-potentiaal en TEM van ICA-geladen mPEG-ICA NP's.

Medicijnlading en encapsulatie-efficiënties

UV-Vis-analyse leverde medicijnlading van 21,9 ± 0,013% en encapsulatie-efficiëntie van 54,9 ± 0,032% voor de ICA-geladen NP's, wat polymer-enkel NP's (lading = 16,5%; EE = 41,3%) overtrof. Deze waarden zijn consistent met de gewenste therapeutische lading.

Stabiliteitsbepaling

Na vriesdrogen met 5% mannitol, vertoonden hergedispergeerde NP's een modeste grootte-toename tot 255 nm (PDI = 0,326) maar behielden acceptabele uniformiteit, wat opslagstabiliteit bevestigt (Fig. 3).

Stabiliteit van ICA-geladen mPEG-ICA NP's.

mPEG-ICA-ICA medicijnvrijgave in vitro

In pH 7,4 PBS gaf vrije ICA 77,2% vrij binnen 12 u, terwijl mPEG-ICA NP's 44,1% over 72 u vrijgaf. ICA-geladen NP's gaven 52,8% vrij over 72 u bij neutraal pH en 75,7% binnen 48 u bij pH 6,8, wat pH-responsieve versnelde vrijgave weerspiegelt (Fig. 4).

A ICA-vrijgave van ICA-geladen mPEG-ICA NP's in PBS bij pH 7,4. B Vrijgave bij pH 7,4 vs pH 6,8.

H9C2-celviabiliteit en lactaatdehydrogenase-vrijgave

MTT-assays onthulden geen cytotoxiciteit van ICA, mPEG-ICA of ICA-geladen NP's bij 20 µM. Na LPS-blootstelling daalde viabiliteit tot 50,0% (controle = 100%). Behandeling met ICA, mPEG-ICA en ICA-geladen NP's herstelde viabiliteit tot respectievelijk 55,9%, 61,0% en 65,4% (p < 0,05) (Fig. 5, 6).

Evaluatie van de cytotoxiciteit van ICA-nanopartikelen op H9c2-cellen.

Effect van ICA-nanopartikelen op LPS-geïnduceerde H9c2-celschade.

LDH-assays toonden een significante stijging in enzymlek na LPS-behandeling; ICA, mPEG-ICA en ICA-geladen NP's verminderden LDH-vrijgave merkbaar, met het meest uitgesproken effect voor ICA-geladen NP's (Fig. 7).

Effect van ICA-nanopartikelen op het LDH-niveau geïnduceerd door LPS in H9c2-cellen.

Celapoptose geïnduceerd door LPS

Hoechst 33342-kleuring onthulde chromatine-condensatie en -fragmentatie in LPS-behandelde cellen; ICA-geladen NP's attenuereerden apoptotische morfologie significant (Fig. 8). TUNEL-assay kwantificeerde apoptosesnelheden: LPS induceerde 47,6% apoptose, wat verminderd werd tot 35,5% (ICA), 26,5% (mPEG-ICA) en 17,9% (ICA-geladen NP's). Stroomcytometrie bevestigde deze bevindingen, met totale apoptose van 35,9% in LPS versus 16,7% (ICA-geladen NP's) en 19,2% (mPEG-ICA) (Fig. 9‑10).

Detectie van apoptose door Hoechst 33342-kleuring.

Detectie van apoptose door TUNEL.

Apoptosesnelheid gedetecteerd door stroomcytometrie.

Inflammatoire cytokinemRNA in LPS-geïnduceerde H9c2-cellen

RT-qPCR demonstreerde dat LPS de TNF-α, IL-1β en IL-6-transcripten merkbaar verhoogde. Behandeling met ICA, mPEG-ICA en ICA-geladen NP's onderdrukte deze cytokines, met ICA-geladen NP's die de meest substantiële down-regulatie bereikten (Fig. 11).

Effecten van ICA-geladen mPEG-ICA NP's op IL-1β, TNF-α en IL-6 mRNA-expressie.

Deze bevindingen bevestigen dat ICA-geladen mPEG-ICA NP's verbeterde cardioprotectie bieden door ICA direct aan geïnflameerd myocard af te leveren, oxidatieve stress, apoptose en inflammatoire cytokinproductie te reduceren.

Conclusie

We hebben met succes ICA-geladen mPEG-ICA-nanopartikelen gefabriceerd via een hybride chemisch-fysieke benadering die de ICA-oplosbaarheid, ladingscapaciteit en langdurige, pH-responsieve vrijgave aanzienlijk verbetert. In LPS-uitgedaagde H9c2-cellen herstelden deze NP's de celviabiliteit, attenuereerden LDH-lekkage, remden apoptose en onderdrukten pro-inflammatoire cytokin-expressie effectiever dan vrije ICA of polymer alleen. De data ondersteunen het potentieel van ICA-geladen mPEG-ICA NP's als gerichte nanomedicijn voor het behandelen van inflammatoire cardiale letsel.