Ultrasone-verbeterde multifunctionele nanopartikelen: Nieuw platform voor imaging en synergistische therapie van metastaserende borstkanker

Samenvatting

Metastase van borstkanker heeft een negatief effect op de prognose. Dankzij de bemerkenswerte diep-penetrerende en non-invasieve kenmerken, toont sonodynamische therapie (SDT) een reeks potenties voor kankerbehandeling. Om de beperking van monotherapie op te heffen, is een multifunctioneel nanoplatform verkend om synergistische behandelingsefficiëntie te realiseren. Hier ontwikkelen we een nieuw multifunctioneel nano-systeem dat chlorin e6 (Ce6, voor SDT), perfluorpentaan (PFP, voor ultrasone imaging) en docetaxel (DTX, voor chemotherapie) in een goed ontworpen PLGA kern-schil structuur inkapselt. De synergistische Ce6/PFP/DTX/PLGA nanopartikelen (CPDP NPs) met uitstekende biocompatibiliteit en stabiliteit maken verdere toepassing mogelijk. Bij bestraling met laag-intensiteit gefocuste ultrasone (LIFU) kon verbeterde ultrasone imaging zowel in vitro als in vivo worden getoond. Belangrijker nog, gecombineerd met LIFU, tonen de nanopartikelen een intrigerende antitumor-capaciteit door Ce6-geïnduceerde cytotoxische reactieve zuurstofsoorten (ROS) alsook DTX-afgifte om een gezamenlijke therapeutische efficiëntie te genereren. Bovendien activeert deze behandelstrategie een sterke anti-metastase capaciteit waardoor longmetastasen significant zijn verminderd. De resultaten wijzen erop dat het SDT-gerichte nanoplatform gecombineerd met chemotherapie een veelbelovende benadering kan zijn voor effectieve synergistische therapie en onderdrukking van longmetastase van borstkanker.

Inleiding

Borstkanker is al jaren een van de meest bedreigende maligne tumoren voor vrouwen. Vanwege de hoge heterogeniteit en hoge metastaserende capaciteit, wordt gerapporteerd dat ver metastasis van borstkanker verantwoordelijk is voor meer dan 90% van de sterfte, terwijl de 5-jaars overlevingscijfer voor gevorderde of gemetastaseerde patiënten slechts 26% bedraagt, wat leidt tot een slechte klinische uitkomst. De negatieve karakterisering van borstkanker maakt het moeilijk om volledig te genezen, wat de behandelstrategie uitdaagt om zowel de primaire tumor als de ver metastasis te elimineren.

Traditionele therapeutische benaderingen zoals chirurgie en chemotherapie worden nog steeds beschouwd als effectief in de behandeling van borstkanker. Onder alle chemotherapeutica speelt docetaxel (DTX) een significante rol in de behandeling van gemetastaseerde borstkanker (MBC) en gevorderde borstkanker (ABC). Als eerste-lijns antitumor middel gesynthetiseerd uit chemische stoffen in de taccsboom, wordt het antitumor effect van DTX voornamelijk bereikt door mitose en celproliferatie te vernietigen. Vanwege de uitgebreide antitumor efficiëntie wordt DTX een van de meest effectieve chemotherapeutische middelen bij borstkanker. Echter, chemotherapie induceert meestal ongewenste effecten en heel lichaam toxiciteit, wat de therapeutische efficiëntie sterk beperkt. Bovendien tonen verschillende klinische stadia en persoonlijke condities aan dat een enkele therapeutische benadering misschien niet efficiënt genoeg is om aan alle verwachtingen in borstkankerbehandeling te voldoen. Er is dringende behoefte aan het beperken van de toxische bijwerkingen en het verbeteren van de behandelwerkzaamheid van DTX voor toekomstige toepassingen.

Ultrasone werd eerst verkend in klinische diagnostiek vanwege zijn uitzonderlijke voordelen zoals stralingsvrij, non-invasief en kosteneffectief. Ondanks de unieke kenmerken hierboven, heeft het ook veel aandacht gekregen in therapeutische perspectieven gebaseerd op nanogestructureerde materialen. Sonodynamische therapie werd initieel gerealiseerd door cavitatie en 'sonoporatie-effect' getriggerd door ultrasone. De generatie van ROS tijdens dit proces induceert effectief cytotoxiciteit naar kankercellen, wat leidt tot snelle DNA-schade en apoptose van tumorklieren. In tegenstelling tot het oppervlakkige gebruik van fotodynamische therapie (PDT), ontvangt SDT een meer gunstige therapeutische uitkomst bij de behandeling van diepgelegen tumoren door laag-intensiteit gefocuste ultrasone (LIFU), wat meriten bezit om ongewenste thermische schade tijdens behandeling te voorkomen. Als een van de essentiëlen in SDT, zijn sonosensitizers verkend in diverse tumortherapieën. Chlorine e6 (Ce6) was oorspronkelijk een veelvoorkomende fotosensitizer, maar zijn gewenste therapeutische capaciteit en uitstekende affiniteit voor tumorweefsel maakten het ook toepasbaar als sonosensitizer. Als tweede generatie van de chloorfamilie, heeft Ce6 uitgebreide aandacht gewekt in tumorbehandeling voor zijn gewenste ROS-generatie. Echter, de enkele toepassing van Ce6 leidt constant tot instabiliteit en ongewenste huidtoxiciteit, wat allemaal de uitgebreide SDT-verkenning beperkt.

In de laatste jaren heeft de ontwikkeling van nanotechnologie een zeer belangrijke rol gespeeld in vele velden, waaronder biosensing, milieuvuilstof en contaminantafbraak. Nanotechnologie-gebaseerde nanopartikelen hebben veel voordelen, zoals kleinere diameter, groter oppervlak en lagere interne diffusieweerstand. Eerder zijn nanopartikelen betrokken bij de toepassing van diverse materialen zoals MOF, titaniumdioxide en grafeen. De snel groeiende trend van nanotechnologie gecombineerd met kankerbehandeling is ook breed verkend, wat een haalbare weg baant voor een gecombineerde therapeutische strategie. Om effectieve tumortherapeutische toepassingen te realiseren, zijn de verfijnd ontworpen nanopartikelen primair ingesteld om de transport-efficiëntie van het toxische chemotherapeutisch middel te verbeteren via het verbeterde permeabiliteits- en retentie-effect (EPR-effect), wat een verhoogde accumulatie in de tumorlocatie mogelijk maakt. Daarnaast kan het ongewenste bijwerk effect ook worden verminderd door encapsulatie van chemotherapie. Het is gerapporteerd dat perfluorpentaan (PFP) een uitstekende capaciteit bezit om van vloeibare fase naar gasfase te transformeren onder bestraling, wat kan worden toegepast als een nieuwe ultrasone moleculaire probe, met name in ultrasone imaging en behandeling. Belangrijker nog, de initiële vloeibare fase maakt PFP gemakkelijk in diverse materialen te encapsuleren. Daarnaast kan de encapsulatie van PFP de ultrasone imaging capaciteit op de tumorlocatie aanzienlijk verbeteren volgens het bovengenoemde EPR-effect en de groottebeperking vermijden die ontstaat door grotere micrometer-grote microbellen. Naast tumorimaging, is de combinatie van meerdere therapeutische benaderingen van enorme waarde in nanosysteem-gerichte kankerbehandeling. Specifiek, praktijken inclusief de integratie van sonodynamische therapie en chemotherapie leggen de nadruk op het revolutioneren van traditionele therapeutische efficiënties. Xu et al. toonden aan dat door SDT een verbeterd therapeutisch resultaat kon worden verkregen met chemotherapeutica en dus leidde tot de activatie van mitochondria-gerichte tumorcelapoptose. Dit patroon onthult de synergistische behandeling, die zeer gewaardeerd is in toekomstig gebruik.

Hier, met de bovengenoemde inspiraties, hebben we de intentie om de all-in-one nanopartikelen (CPDP NPs) in te zetten om een diagnostisch en therapeutisch systeem te vestigen, gerealiseerd door de SDT-gerichte synergistische therapie gecombineerd met chemotherapie, alsook de verbeterde ultrasone imaging. Vanwege de uitstekende veiligheid en ideale metabolische stabiliteit als gewenste nanodrager, maakt PLGA het gunstig om diverse antitumor-capaciteiten te verkennen. Daarom in deze strategie, gebruikmakend van PLGA als buitenlaagmateriaal, kan PFP de ultrasone imaging aanzienlijk verbeteren door zijn faseverschuivingscapaciteit getriggerd door LIFU, terwijl Ce6, een gewenste tweede-generatie sonosensitizer, ook blootgesteld kan worden aan LIFU om ROS-generatie te induceren. Daarnaast, vergezeld door DTX-afgifte, zullen zowel chemotherapie als SDT gerealiseerd worden om uiteindelijk een synergistische therapie te bereiken. Belangrijk is dat de kern-schil structuur van CPDP NPs stabiel kan worden geadministreerd zonder normale weefsels of cellen te schaden en ook nanopartikelen in staat stelt om een relatief hogere encapsulatie-efficiëntie te hebben. De inhoud kan goed beschermd worden in deze kern-schil structuur, met name voor PFP, wat effectief kan worden getransformeerd van vloeistof naar gas door het bestaan van de structuur. Met deze kern-schil structuur kan de synergistische strategie gelijktijdig op een meer stabiele manier worden gedemonstreerd. Ten eerste helpt de synergistische strategie de bijwerking van DTX aanzienlijk te verminderen door effectieve encapsulatie, wat van groot belang is om het lijden bij de behandeling van maligne en agressieve tumoren te verlichten; ten tweede, in vergelijking met enkele chemotherapie, is de combinatie van SDT en chemotherapie geverifieerd als een veelbelovende strategie om de therapeutische efficiëntie te versterken. Ten derde, de verbeterde ultrasone imaging gerealiseerd door PFP heeft de diagnostische strategie geoptimaliseerd en geholpen de antitumor-effectiviteit te verifiëren. Ten slotte is het hele systeem veilig en stabiel met uitstekende biocompatibiliteit. Het is benadrukt dat in deze strategie, longmetastase alsook tumorgroei zowel in vitro als in vivo bemerkenswaardig zijn geremd. Concluderend, de synergistische strategie toonde een productieve behandelingseffectiviteit tegen borstmaligne tumor en zijn ver metastasis, en gecombineerd met zijn ultrasone imaging capaciteit, zou het de veelbelovende behandelstrategie in toekomstige klinische toepassing kunnen worden.

Materialen en methoden

Materialen

PLGA-COOH (Mw 12.000 Da) werd gekocht bij Jinan Daigang Biomaterial Co., Ltd (Jinan, China). Perfluorpentaan (PFP) en agarose werden verkregen van Sigma-Aldrich Co., Ltd. (St. Louis, MO). Chlorin e6 (Ce6) werd gekocht bij Melone Pharmaceutical Co., Ltd. (Dalian, China). Cell Counting Kit-8 (CCK-8) cytotoxiciteit assay kit werd verkregen van Dojindo Molecular Technologies (Tokyo, Japan). 2′,7′-Dichlorodihydrofluoresceïne diacetaat (H2DCFDA) werd gekocht bij MedChemExpress Co., Ltd. (NJ, VS). Propidium iodide (PI) werd verkregen van Solarbio Science and Technology Co. Ltd. (Peking, China). Annexin V-FITC/PI werd verkregen van BD Biosciences (VS). Docetaxel (DTX) werd gekocht bij MedChemExpress Co., Ltd. (NJ, VS). Alle overige reagentia waren analytisch zuiver zonder verdere zuivering. Roswell Park Memorial Institute 1640 medium (DMEM), foetale kalfserum, en trypsine werden gekocht bij Gibco (ThermoFisher Scientific, VS) en UV-spectrofotometer (UV–Vis, Hitachi, Japan).

Synthese van CPDP NPs

Ce6-PFP-DTX/PLGA nanopartikelen (CPDP NPs) werden bereid via een W/O/W dubbele emulsiemethode volgens eerdere rapporten. Kort gezegd: 2 mg Ce6 werd eerst opgelost in 500 μL methanol. Vervolgens werden 50 mg PLGA-COOH en docetaxel (2 mg) opgelost in 4 mL dichloormethaan, en daarna werd de vorige oplossing er gelijktijdig aan toegevoegd. Daarna werd 200 μL PFP aan de bovengenoemde oplossing toegevoegd. Vervolgens werd het mengsel getriggerd door een ultrasonische probe (Sonics & Materials Inc., VS) om een eerste emulsie te verkrijgen (5 s aan en 5 s uit, 3 min). Om de tweede emulsie te verkrijgen, werd 8 mL van een poly(vinylalcohol) (PVA) oplossing (w/v = 4%) aan de bovengenoemde emulsie toegevoegd, met dezelfde ultrasonische probe gedurende 2 min. Na toevoeging van 10 mL 2% isopropylalcohol aan de finale emulsie, werd de oplossing bij kamertemperatuur mechanisch gemengd gedurende ten minste 4 uur om het dichloormethaan volledig te laten verdampen. Ten slotte werden CPDP NPs gecentrifugeerd voor drie keer (12.000 toer/min, 5 min) en vervolgens verzameld en opgeslagen bij 4 °C voor verder gebruik. De PDP NPs werden op dezelfde manier bereid, behalve voor Ce6. Alle experimentele processen werden boven ijs uitgevoerd en strikt in het donker uitgevoerd.

Karakterisatie van CPDP NPs

De deeltjesgrootte en zeta-potentiaal van CPDP NPs en PDP NPs werden gemeten met een Malvern Zetasizer Nano instrument (Malvern, VK). De morfologie werd gekarakteriseerd door transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) en optische microscopie. Om de stabiliteit te evalueren, werden CPDP NPs opgelost in fosfaat-gebufferde oplossing (PBS) en de grootten gemeten over 7 dagen. Elk monster was in driploop gemeten. De encapsulatie-efficiëntie van CPDP NPs werd berekend via de volgende formule:

Encapsulatie-efficiëntie (%) = (Gewicht van geladen DTX of Ce6 / Gewicht van totaal DTX of Ce6) × 100%. Om de encapsulatie van de diverse materialen te verifiëren, werden UV–Vis spectra van diverse monsters onderzocht (UH5300, Hitachi). De effectieve encapsulatie werd ook geanalyseerd door TEM.

Medicijn-afgiftesnelheid van CPDP NPs

Om de medicijn-afgiftecapaciteit van Ce6 en DTX in CPDP NPs te evalueren, werden twee oplossingen met verschillende pH-waarden (fosfaatbufferoplossing, PBS: 7,4, acetaatbufferoplossing, ABS: 5,6) gebruikt om de cumulatieve afgifteefficiëntie te testen. Kort gezegd: CPDP NPs werden eerst gedispergeerd met 1 mL PBS of ABS waarna het mengsel in een dialysezak (Mw: 10.000) geseald werd; de hele oplossing werd vervolgens overgebracht in een glasfles (totale volume: 150 mL) waarin 149 mL PBS of ABS werd toegevoegd om het totale oplossingsvolume op 150 mL te houden. De glasfles werd vervolgens in een 37 °C constante temperatuur schuddende incubator geplaatst, en op verschillende tijdstippen (0,5, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 48, 72 uur) werd de oplossing verzameld en onmiddellijk aangevuld met hetzelfde volume medium. Elke groep werd drie keer herhaald. Ten slotte werden de concentraties van Ce6 en DTX gemeten met Synergy Hybrid Multi-Mode Read (BioTek, VS) bij 403 en 229 nm, respectievelijk, en de medicijn-afgiftesnelheid op elk tijdstip berekend.

In vitro ultrasone imaging

Om de ultrasone capaciteit van CPDP NPs te onderzoeken, werd de emulsie (1 mg/mL) eerst getriggerd door een laag-intensiteit gefocuste ultrasone (LIFU) transducerapparatuur (Ronghai Ultrasonic Medical Engineering Research Center, Chongqing, China), en het geleidingspatroon was ingesteld als 50% duty cycle, 1 s pulsduur onder verschillende intensiteiten (1–2 W/cm²) voor verschillende duur. Voor ultrasone imaging, werden bestraalde CPDP NPs aan het eerder voorbereide agarosemodel toegevoegd, respectievelijk, met behulp van Philips EPIQ5 ultrasone diagnostisch instrument (profrequentie: 12 MHz, MI: 0,06) om zowel 2D als CEUS imaging van CPDP NPs te observeren. Tegelijkertijd werd ImageJ-software toegepast om de grijswaarde van elke groep te analyseren.

Cellulaire opname en in vitro ROS-generatie van CPDP NPs door LIFU-bestraaling

De muur borstkankercellijijn 4T1 werd verkregen van de Shanghai celbank van de Chinese Academie van Wetenschappen (Shanghai, China) en geïnkubeerd in RPMI 1640 medium gemengd met 10% FBS en 1% streptomycine/penicilline bij 37 °C in een 5% CO₂ gevochtigde incubator.

4T1 cellen werden eerst geïnkubeerd onder de vorige conditie met een dichtheid van 1 × 10⁴ cellen per schaal om de cellulaire opname te testen met CLSM in verschillende tijdsintervallen (1 u, 2 u, 4 u, 8 u). Om de ROS-generatie te verifiëren, werden cellen verdeeld in de volgende 5 groepen: controle, CPDP NPs, LIFU, Ce6 + LIFU, CPDP NPs + LIFU. Na 24-u conventionele cultuur, werd het medium vervangen door CPDP NPs (200 μL, 0,8 mg/mL) of Ce6-oplossing (200 μL), respectievelijk, en de cellen werden nog 3 uur geïncubeerd. Daarna werd LIFU-bestraaling (2 W/cm², 120 s) respectievelijk uitgevoerd volgens de verschillende groepen. Na co-incubatie en LIFU-behandeling, werd 100 μL vervaagde DCFH-DA oplossing toegevoegd, en elke groep werd in de vorige incubator 15 min gecultiveerd. Een confocal laser scanning microscoop (CLSM) werd gebruikt om het resultaat van reactieve zuurstofsoorten productie te bevestigen, en de corresponderende fluorescentie-intensiteiten werden gemeten met ImageJ-software.

In vitro cytotoxiciteit en gezamenlijke behandelingscapaciteit van CPDP NPs

Een CCK-8 assay werd toegepast om de in vitro cytotoxiciteit van CPDP NPs te beoordelen. In dit opzicht werden verschillende groepen ontworpen met of zonder LIFU-bestraaling bij verschillende concentraties. De resultaten toonden aan dat na een 24-u co-incubatie zonder LIFU-blootstelling, er geen duidelijke invloed was op de overlevingscijfer van CPDP NPs zelfs bij de hoogste concentratie (0,8 mg/mL), wat de gewenste biosafety van CPDP NPs aantoont. Daartegenover stond dat er een opvallende afname van celviabiliteit was na LIFU-bestraaling, wat aantoont dat de combinatie van CPDP NPs en LIFU 4T1 celdood opmerkelijk heeft getriggerd, consistent met de in vitro ROS-generatie.

Om de celapoptose-efficiëntie van de gezamenlijke behandeling te evalueren, werden 4T1 cellen zoals eerder gecultiveerd voor 24 u en vervolgens verdeeld in vijf groepen: (1) controle (geen behandelingen), (2) LIFU (alleen LIFU-blootstelling bij 2 W/cm²), (3) CPDP NPs (alleen CPDP NPs oplossing bij 0,8 mg/mL), (4) PDP NPs + LIFU en (5) CPDP NPs + LIFU. Na diverse nanopartikel co-incubatie (200 μL) en LIFU-blootstelling, werd elke groep behandeld met annexine V (5 μL) en propidium iodide (5 μL) dubbele kleuring voor 20 min en geanalyseerd via een flow cytometry protocol.

In vitro inhibitie van celmetastase

Om de inhibitie van de metastaserende capaciteit van cellen te onderzoeken, werden wondheal-assay en transwell-assay ontworpen. Voor wondheal-assay, werden 4T1 cellen conventioneel gecultiveerd zoals eerder in de 6-put plaat. Na celdgroei tot 80% confluentie, werd een pipetpunt (10 μL) toegepast om een kunstmatige scheur langs het midden van de 6-put plaat aan te brengen. Vervolgens werden cellen behandeld in de dezelfde groepen als hierboven genoemd. Na een continue co-incubatie van 24 u, werden de cellen 3 keer met PBS gewassen en waargenomen onder optische microscoop (Olympus, Japan).

Voor transwell-assay, werd het bovenste compartiment van de transwell-kamer (Corning, San Diego, VS) primair toegepast om de extracellulaire matrix in vivo na te bootsen. 4T1 cellen met een dichtheid van 1 × 10⁵ cellen per put werden gezaaid in de bovenkamer in een serumvrij RPMI 1640 medium, terwijl het onderste compartiment gevuld werd met een compleet cultuurmedium gemengd met 10% FBS. Vervolgens werden cellen verdeeld zoals de bovengenoemde groepen en 24 u behandeld, respectievelijk. Daarna werden cellen op de bodem vastgemaakt met paraformaline en gekleurd met kristalviolet. De resultaten werden waargenomen met lichtmicroscopie (Olympus, Japan).

In vivo ultrasone imaging

Gezonde vrouwtjes BALB/c muizen (4 weken) en Kunming muizen (4 weken) werden verkregen van het Ningxia Medical University Laboratory Animal Center. Alle dierproeven werden uitgevoerd onder de richtlijn goedgekeurd door het Animal Welfare Ethics Review Committee van Ningxia Medical University. Om het muizen tumor-dragend model te vestigen, werden BALB/c muizen geïnculeerd met 4T1 borstkankercellen (1 × 10⁷/mL) aan de rechterflank. Nadat de tumorvergroting 60–80 mm³ bereikte, werden BALB/c muizen intraveneus via de staartvleet geïnjecteerd met CPDP NPs (200 μL, 1 mg/mL). 24 uur later werden de tumorlocaties van de muizen behandeld met LIFU (2 W/cm², 120 s), en daarna werden de 2D en CEUS imaging verkregen via het eerder genoemde Philips EPIQ5 ultrasone diagnostische instrument. De grijswaardeanalyse werd gemeten met ImageJ-software.

In vivo synergistische therapeutische efficiëntie van CPDP NPs

Na 4T1 kankercel inoculatie, werd de tumorvergroting elke twee dagen vastgelegd, en het tumorvolume berekend door de formule: Volume = 1/2 × Lengte × Breedte². Tumorvergroting en muizen lichaamsgewicht werden elke 2 dagen vastgelegd, terwijl foto's van tumorgroei elke 3 dagen vastgelegd werden. Toen het tumorvolume 60–80 mm³ bereikte, werden muizen met vergelijkbare tumorvergroting willekeurig verdeeld in de dezelfde vijf groepen: controle, LIFU, CPDP NPs, PDP + LIFU, en CPDP NPs + LIFU (n = 3). Elke groep werd intraveneus geïnjecteerd met diverse NPs (200 μL) via staartvleet behalve controle groep (200 μL PBS in plaats daarvan). Vierentwintig uur later werd de tumorlocatie blootgesteld aan LIFU-bestraaling (2 W/cm²) gedurende 120 s. De gehele SDT-administratie werd elke 3 dagen herhaald en duurde 18 dagen. Het lichaamsgewicht en tumorvolume van de muizen werden gemeten en berekend. Na de behandeling werden de muizen gedood en tumorweefsels gezonden naar H&E, TUNEL, en PCNA voor verdere histologische analyse.

Biosafety van CPDP NPs in vivo

Om de biosafety van CPDP nanopartikelen in vivo te onderzoeken, werden gezonde vrouwtjes Kunming muizen (n = 3) verdeeld in de volgende 4 groepen: controle, 5 mg/mL, 10 mg/mL, en 20 mg/mL. De CPDP NPs (200 μL) werden via de staartvleet van de muizen geïnjecteerd; daarna hadden de muizen vrije toegang tot voedsel en water zonder verdere administratie. Het lichaamsgewicht van de muizen werd elke 2 dagen gemeten. Na 30 dagen werden de muizen gedood en bloedmonsters verzameld voor bloedcel- en biochemieanalyse. De belangrijke organen (hart, lever, milt, long, en nieren) werden verzameld en onderzocht voor H&E-kleuring, respectievelijk.

In vivo inhibitie van longmetastase

Om de longmetastase-inhibitie van elke groep te evalueren, werd het hele proces uitgevoerd door het aantal metastatische knopen in de long te observeren alsook een H&E-kleuring histologische beoordeling. Na alle muizen euthanasiëren, werden de longweefsels verwijderd en vastgemaakt; vervolgens werden foto's van kankerknopen genomen en longweefsels verder geanalyseerd met H&E-kleuring.

Statistische analyse

Meetdata werden alle 3 keer uitgevoerd en uitgedrukt als gemiddelde ± standaarddeviatie (SD) en geanalyseerd door one-way ANOVA of een standaard Student's t-toets via SPSS-software (versie: 19.0), terwijl p-waarde < 0,05 als statistisch significant werd beschouwd.

Resultaten

Karakterisatie van CPDP NPs en medicijn-afgifte-efficiëntie

Een dubbele emulsiemethode werd toegepast bij het fabriceren van CPDP NPs, die zowel faseverschuivend materiaal PFP, sonosensitizer Ce6, en chemotherapeutisch middel DTX gelijktijdig encapsuleerden. Bij dispersie in PBS of gedemineraliseerd water, presenteerde de oplossing een lichtgrijze uitstraling. CPDP NPs vertoonden een homogene spherische vorm en een duidelijke kern-schil structuur, of ze nu waargenomen werden via optische microscopie of transmissie-elektronenmicroscopie (Fig. 1a, b). De gemiddelde diameters van CPDP NPs en PDP NPs waren 249,5 ± 77,46 nm en 246,6 ± 81,01 nm, en de gemiddelde oppervlakte zeta-potentialen waren −18,47 ± 0,55 mV en −3,987 ± 0,66 mV, respectievelijk (Fig. 1c, d). De grootte van CPDP NPs garandeerde dat het passief in de tumorlocatie kon accumuleren via het EPR-effect. Het verschillende lading tussen CPDP NPs en PDP NPs is voornamelijk te wijten aan het negatief geladen Ce6. Daarnaast duidde het negatieve zeta-potentiaal van CPDP NPs op een lagere plasma-eiwitaadsorptie, wat de relatieve stabiliteit van nanopartikelen bevestigde. De deeltjesgrootteverdelingen bleven tussen een bereik van 249,5 en 385,1 nm in 7 dagen (Fig. 1e), wat de relatieve stabiliteit van CPDP NPs aantoont. Volgens de standaardcurve was de encapsulatie-efficiëntie van DTX en Ce6 respectievelijk 83,84 ± 1,39% en 60,54 ± 3,79%.

Zoals de medicijn-afgifteefficiëntie van Ce6 en DTX uit CPDP NPs aangegeven in Fig. 1f, g, werd een bijna tweevoudige toename van DTX-afgifte-index vastgelegd bij pH 5,5 vergeleken met nanopartikelen opgelost in pH 7,4, wat aantoonde dat de redelijke medicijn-afgiftesnelheid van DTX effectief bereikt kon worden in een zure tumormicro-omgeving. De bovenstaande resultaten toonden allemaal aan dat de verfijnd ontworpen CPDP NPs een stabiele en tijdige chemotherapeutische medicijnafgifte in de zure tumoromgeving kunnen uitoefenen, en fundamenteel gewenst zijn om voorbereid te zijn voor SDT.

Zoals de UV–Vis toonde, onthulden DTX en Ce6 unieke absorptiepieken bij 229 nm en 403 nm, respectievelijk, en omgekeerd toonde PFP/PLGA geen van de pieken. Het moet worden opgemerkt dat het spectrum van CPDP NPs gelijke pieken vertoonde zowel nabij de bovengenoemde twee golflengtes, terwijl de rest dezelfde tendens van PFP/PLGA spectrum vertoonde, wat de succesvolle encapsulatie van de diverse materialen aangeeft (Fig. 1h). Om de effectieve encapsulatie verder te verifiëren, toonde Fig. 1i aan dat PFP/PLGA nanopartikel een veel dunner schil en een ronde kern bezit, terwijl het CPDP nanopartikel een relatief dikker schil en een ovaalvormige kern onthult door de encapsulatie van zowel DTX als Ce6.

In vitro ultrasone imaging

Het is benadrukt dat PFP een uitstekende faseverschuivingscapaciteit bezit. De vloeistof-naar-gas transformatie helpt niet alleen nanopartikelen te aggregeren binnen de tumorlocatie, maar verleent ook de capaciteit om de efficiëntie van ultrasone imaging te verbeteren. Om dit te demonstreren, werd LIFU-bestraaling toegepast als trigger om de fasetransformatie van PFP te induceren, namelijk het akoestische druppelverdampings (ADV) effect. De resultaten toonden aan dat de grijswaarde-intensiteiten op een relatief laag niveau bleven voor LIFU-bestraaling, terwijl na toename van de intensiteit en bestralingstijd van LIFU, de neiging van verbeterde ultrasone imaging zichtbaar werd zowel in 2D als in CEUS (Fig. 2a). De akoestische analyse van ImageJ bevestigde het resultaat door verhoogde grijswaarde (Fig. 2b, c), wat consistent was met de imaging-bevindingen. Het moet worden opgemerkt dat het meest significante resultaat van 2D en CEUS behaald werd toen LIFU-intensiteit 2 W/cm² bereikte en 120 s duurde. De bovenstaande resultaten toonden aan dat PFP met succes in CPDP NPs geencapsuleerd was, en de ultrasone imaging capaciteit significant was verbeterd onder hogere intensiteit alsook langere tijd van LIFU-administratie.

Cellulaire opname en in vitro ROS-generatie van CPDP NPs door LIFU-bestraaling

Zoals het CLSM-resultaat toonde in Fig. 3, vertoonde de cellulaire opname van CPDP NPs een verbeterde trend in verschillende tijdsintervallen, bereikend de meest significante aggregatie bij de 8-u co-incubatie.

De hoofstrategie van sonodynamische therapie (SDT) is de generatie van ROS—een reeks eenelektron-reductieproducten—om kankercelapoptose te induceren en celproliferatie te remmen. Het is benadrukt dat wanneer blootgesteld aan ultrasone, de sonosensitizer geneigd is ROS-productie te triggeren; tegelijkertijd wordt een aanzienlijke hoeveelheid energie vrijgemaakt tijdens het hele proces. Gezien zowel ultrasone als sonosensitizer onmisbare elementen zijn om SDT te bevorderen, werd de intracellulaire ROS-generatie ontworpen en geanalyseerd om de verschillen tussen verdeelde groepen te onderzoeken. Volgens Fig. 4a, was de hoeveelheid ROS gegenereerd door de vrije Ce6 plus LIFU-bestraaling groep verwaarloosbaar, wat kan liggen aan de snelle metabolisering van vrije Ce6 leidend tot onvoldoende ROS-productie. Integenstelling, de sterkste fluorescentie-intensiteit werd onthuld door CPDP NPs + LIFU groep. Er werd aangenomen dat de geencapsuleerde Ce6 goed beschermd was en dus bewaard gebleven was van metabolisering. Als gevolg, na LIFU-stimulatie, werd Ce6 vrijgemaakt om overvloedige ROS te produceren. Comparatief, werden er geen significante fluorescente signalen gevonden in andere groepen (Fig. 4b).

In vitro cytotoxiciteit en gezamenlijke behandelingscapaciteit van CPDP NPs

Cell Counting Kit-8 (CCK-8) assay werd geïntroduceerd om de in vitro cytotoxiciteit van CPDP NPs te testen. In dit opzicht werden verschillende groepen ontworpen met of zonder LIFU-bestraaling bij verschillende concentraties. De resultaten toonden aan dat na een 24-u co-incubatie zonder LIFU-blootstelling, er geen duidelijke invloed was op de overlevingscijfer van CPDP NPs zelfs bij de hoogste concentratie (0,8 mg/mL), wat de gewenste biosafety van CPDP NPs aantoont (Fig. 5a). Daartegenover stond dat er een opvallende afname van celviabiliteit was na LIFU-bestraaling, wat aantoont dat de combinatie van CPDP NPs en LIFU 4T1 celdood opmerkelijk heeft getriggerd, consistent met de in vitro ROS-generatie.

Om de SDT-efficiëntie verder te evalueren, werd een flow cytometry assay geïntroduceerd. Zoals de resultaten getoond in Fig. 5b, c, was de index van celnecrose en apoptose het hoogst waargenomen in CPDP NPs + LIFU groep, terwijl andere groepen geen duidelijke necrose en apoptose toonden. Opvallend was dat de necrose- en apoptosesnelheid van CPDP NPs + LIFU groep driedubbel hoger was dan die van CPDP NPs alleen groep, wat de significante tumorceldood-efficiëntie van SDT vanuit een ander perspectief bevestigde. Intrigerend, vergeleken met PDP NPs + LIFU groep, was de celnecrose- en apoptosesnelheid in CPDP NPs + LIFU groep significant toegenomen, wat de synergistische therapie-efficiëntie van SDT en chemotherapie toont.

In vitro inhibitie van celmetastase

De invasieve en migratoire capaciteit van tumorcellen zijn onmisbaar in tumorprogressie. Zoals getoond in Fig. 6a, was de sluiting tussen de fysieke kluft van CPDP NPs + LIFU groep significant breder dan andere groepen, wat een relatief langzamere migratiesnelheid aanduidt. Volgens de ImageJ-software analyse (Fig. 6c), was de migratiesnelheid van CPDP NPs + LIFU groep ook opmerkelijk verlaagd vergeleken met andere groepen.

Vergelijkbaar in de transwell-assay, vergeleken met de snelle migratiesnelheid van andere groepen, onthulde CPDP NPs + LIFU groep een significante reductie van celaantal (Fig. 6b), wat een uitstekende anti-migratie capaciteit van de synergistische therapie aantoont. Specifiek, bij afwezigheid van SDT (CPDP NPs alleen en LIFU alleen groep), was het aantal tumorcellen lichtjes verminderd (Fig. 6d). Over het algemeen, door de combinatie van SDT alsook chemotherapie, is metastase van 4T1 cellen opmerkelijk geremd in vitro.

In vivo ultrasone imaging

Omdat PFP in CPDP NPs geencapsuleerd was, is het ook noodzakelijk om de karakteristieke ultrasone imaging capaciteit in vivo te evalueren. Na de injectie via de staartvleet van CPDP NPs, werd LIFU vervolgens toegepast op de tumorlocatie om zowel 2D als CEUS imaging te verkrijgen (Fig. 7a). Het duidelijke grafische verschil tussen de twee groepen toonde aan dat na LIFU-bestraaling, de corresponderende intensiteit van CPDP NPs duidelijk verhoogd was vergeleken met de pre-bestraaling groep. Verdere data van de gemiddelde echo-intensiteit bevestigde dit resultaat ook, wat consistent was met de eerdere in vitro imaging resultaten (Fig. 7b, c).

In vivo synergistische therapeutische efficiëntie van CPDP NPs

Uit Fig. 8a, b bleek dat het tumorvolume van CPDP NPs + LIFU groep na 18 dagen behandeling significant kleiner was dan die van andere groepen, wat toegeschreven kan worden aan de effectiviteit van ROS afkomstig van SDT-behandeling alsook chemotherapie om een geldige synergistische therapie-efficiëntie uit te oefenen. Vergelijkbaar toonden foto's van tumor-dragende muizen (Fig. 8a) dezelfde trend, wat de coöperatieve behandelings-efficiëntie van CPDP NPs getriggerd door LIFU-blootstelling verifieerde. Verder was er geen duidelijke gewichtsverlies van muizen tussen verschillende groepen (Fig. 8c). De bovenstaande resultaten gaven allemaal een veel hogere inhibitie-ratio van CPDP NPs + LIFU groep aan, wat onthulde dat de synergistische therapie de tumorgroei significant kan voorkomen.

Om de therapeutische resultaten van alle groepen verder te getuigen, werden zowel H&E, PCNA, als TUNEL-kleuringen gebruikt (Fig. 8d). De proliferatiesnelheid van PCNA in CPDP NPs + LIFU groep was slechts 20,50%, wat viervoudig lager was dan controle groep, driedubbel lager dan LIFU en CPDP NPs alleen groep en tweevoudig lager dan PDP + LIFU groep, respectievelijk, wat een significante anti-tumor proliferatiesnelheid aantoont (Fig. 8e). Zoals getoond in Fig. 8d, f, gaven de TUNEL-resultaten aan dat CPDP NPs + LIFU groep een duidelijke apoptose-index van 72,86% vertoonde, wat veel hoger was dan controle (9,66%), LIFU (12,86%), CPDP NPs (19,59%), en PDP NPs + LIFU (37,06%) groep. De bovenstaande resultaten toonden allemaal de effectiviteit van synergistische therapie uitgeoefend in vivo, wat ook bewezen consistent was met de eerdere in vitro resultaten.

Biosafety van CPDP NPs in vivo

Ondanks de effectieve therapeutische uitkomst, is het van groot belang om de biosafety van de nieuw vastgestelde nanopartikelen te verkennen. Namens de veilige distributie van CPDP NPs in vivo, werd de metabolische veiligheid uitgevoerd. De resultaten toonden aan dat in plaats van duidelijke lichaamsgewichtsverlies, het muizen lichaamsgewicht geleidelijk steeg in alle groepen muizen (Fig. 9a), wat een verwaarloosbare negatieve invloed van CPDP NPs aanduidde. Daarnaast, zoals diverse organen en bloedmonsters toonden in Fig. 9b, werden geen significante veranderingen waargenomen in bloedcel, biochemie analyse-index, en H&E-kleuring (Fig. 9c) onder verschillende behandelgroepen, wat de uitstekende biosafety van CPDP NPs in vivo aangeeft.

In vivo inhibitie van longmetastase

Het is goed vastgesteld dat de long het hoofddoelorgaan is voor ver metastasis van borstkanker. Om de onderdrukkingsefficiëntie van metastase te evalueren, werden longweefsels van muizen gebruikt voor anti-metastatisch onderzoek. Zoals te zien in Fig. 10a, b, vergeleken met controle, LIFU, CPDP NPs, en PDP + LIFU groep, vertoonde CPDP NPs + LIFU groep de meest opvallende afname van longknopen, wat de gewenste longmetastase-inhibitie-efficiëntie suggereerde. Een vergelijkbare trend van afname werd verder aangegeven door H&E-kleuring (Fig. 10c), wat allen aantoonde dat deze synergistische therapie strategie effectieve inspanning kan uitoefenen in het elimineren van longmetastase in muizen.

Discussie

Er is algemeen erkend dat de metastase van borstkanker de prognose uitgebreid beïnvloedt. Als een gewenste therapeutische benadering, kan SDT dienen voor zijn hoge efficiëntie en diep-penetrerende capaciteit is uitgebreid overtuigd. Toegestaan, aangezien bepaalde beperkingen bestaan in de enkele toepassing van sonosensitizers, kan het gebruik van SDT alleen nog steeds onvoldoende zijn in verdere kankeronderzoek. De ontwikkeling van nanotechnologie gecombineerd met klinische geneeskunde is in de laatste jaren aanzienlijk bevorderd, dankzij de inspirerende voordelen zoals verwaarloosbare toxiciteit, non-invasiviteit en uitstekende biocompatibiliteit. Met deze nieuwe benadering hebben onderzoekers veel inspanningen gedaan in het verkennen van multifunctionele therapeutische strategieën om de antitumor-efficiëntie te verbeteren.

De biosafety is de prioriteit van nano-agenten. Als een breed geaccepteerd materiaal goedgekeurd door de Food and Drug Administration (FDA) certificering, is het benadrukt dat PLGA kan functioneren als een gewenste drager in toepassing. Gebaseerd op zijn voordelen, hebben we een nano-systeem opgezet om multifunctionele therapie-efficiëntie te realiseren, door PLGA als de buitenstructuur te exploiteren om sonosensitizer Ce6, faseverschuivend materiaal PFP en chemotherapeutisch middel DTX te encapsuleren. De CPDP nanopartikelen (CPDP NPs) werden primair waargenomen door de kern-schil structuur en geschikte grootte zodat een gewenste aggregatie via het EPR-effect kon worden bereikt. De celviabiliteit van CPDP NPs is bewezen boven de 80% na 24-u co-incubatie, wat de veiligheid van dit nanoplatform aangeeft. Bovendien heeft de fasetransformatie van geencapsuleerde PFP ook gegarandeerd dat CPDP NPs als een contrast-versterkend middel fungeert wanneer geactiveerd door LIFU. De verbeterde ultrasone imaging capaciteit zal niet alleen het ideale therapeutische venster waarborgen, maar ook de veelbelovende toekomst voor CPDP NPs bevorderen om een integratie van accurate diagnostiek en nauwkeurige behandeling te realiseren.

De sleutelstrategie in SDT is de generatie van ROS. Vergeleken met de enkele toepassing van Ce6, oefende de geencapsuleerde Ce6 in PLGA een gewenste bescherming uit, wat geverifieerd kon worden door het ROS-resultaat. In onze studie werd er slechts een verwaarloosbare hoeveelheid ROS gegenereerd door enkel gebruik van Ce6, terwijl nanopartikel-geencapsuleerde Ce6 een aanzienlijke hoeveelheid ROS produceerde, wat verder bewezen werd door SDT-efficiëntie. Het resultaat wijst erop dat ROS-generatie bewaard werd door de geencapsuleerde Ce6 in CPDP NPs, wat een stevige basis kan leggen voor latere tumorinhibitie. Bovendien toonde de medicijn-afgiftesnelheid aan dat zelfs bij pH 5,5, weinig Ce6 vrijkwam uit nanopartikelen, wat een goede bescherming van sonosensitizer door PLGA aantoont, wat verder bewezen werd door de ROS-productie en SDT-uitkomst met hoge efficiëntie. Interessant, de medicijn-afgifte-efficiëntie van DTX en Ce6 bij pH 5,5 was heel verschillend volgens de resultaten (meer dan 40% en rond 20%, respectievelijk), wat mogelijk veroorzaakt kan worden door de diverse encapsulatie-efficiëntie van de twee middelen. De geringe vrijkomstsnelheid van Ce6 toonde aan dat het effectief beschermd kon worden in PLGA zodat substantiële ROS-generatie door LIFU-stimulatie bereikt kon worden voor een meer overtuigende SDT-efficiëntie. Een andere reden voor dit verschil kan te wijten zijn aan de verschillende oplosmiddelen van de twee middelen tijdens het bereidingsproces. Specifiek, DTX en PLGA werden direct opgelost in dichloormethaan, terwijl Ce6 eerst in methanol opgelost moest worden en daarna druppelgewijs aan dichloormethaan toegevoegd werd, vanwege de slechte oplosbaarheid in het laatstgenoemde. Aangezien medicijnafgifte in nanopartikelen direct gerelateerd is aan de effectiviteit van de daaropvolgende combinatietherapie, heeft de beoordeling van medicijnafgiftesnelheid alsook ROS-generatieresultaat dit punt wederzijds bewezen. Huidig onderzoek heeft gesuggereerd dat het gebruik van chemotherapie alleen de tumorprogressie niet significant kan omkeren. In deze studie toonde het door ons ontworpen nanoplatform sterke bewijzen dat, vergeleken met de enkele toepassing van chemotherapie, de synergistische behandeling de therapeutische efficiëntie opmerkelijk heeft verhoogd zowel in vitro als in vivo. Omdat LIFU-stimulatie de therapeutische strategie optimaliseerde, was een verhoogde celapoptosesnelheid opmerkelijk verhoogd. Het is de moeite waard op te merken dat door deze synergistische strategie, longmetastase significant geremd kon worden zowel op tumorcelniveau als geïnculeerd muizenmodel, wat consistent is met eerdere rapporten.

Conclusie

Concluderend, de veilige en stabiele CPDP NPs die we ontworpen en bereidden plus LIFU-bestraaling konden borsttumorprogressie en zijn longmetastase opmerkelijk elimineren. Met een verbeterde imaging capaciteit, werd dit nanoplatform ook beschouwd als een veelbelovend contrast-versterkend middel in de kliniek. Daarom kan de nieuwe synergistische strategie gecombineerd met LIFU beschouwd worden als een effectieve behandeltoepassing om de slechte uitkomst van gemetastaseerde borstkanker om te keren.