Antiproliferatief en apoptose-triggerend potentieel van op paclitaxel gebaseerde gerichte lipide nanodeeltjes met verbeterde cellulaire internalisatie door transferrinereceptoren - een onderzoek in leukemiecellen

Resultaten en discussie

Leukemie is een typische bloedkanker die wordt gekenmerkt door de talrijke verdubbeling en proliferatie van witte bloedcellen. In deze studie hebben we een multifunctioneel nanodeeltje ontwikkeld dat bestaat uit met transferrine versierde vaste lipidenanodeeltjes ingekapseld met paclitaxel. Om het transferrine in de SLN op te nemen, hebben we een Tf-PEG-oliezuurconjugaat gesynthetiseerd door de conjugatie van PEG en oliezuur dat vervolgens werd geconjugeerd met het transferrine (figuur 1). Het PEG-oliezuur-Tf wordt voor meerdere doeleinden gebruikt bij de bereiding van deeltjes. De aanwezigheid van Tf-ligand op het deeltjesoppervlak zal de doelspecificiteit van deeltjes ten opzichte van de door receptor tot overexpressie gebrachte kankercellen verhogen. De aanwezigheid van PEG op het buitenoppervlak zal de broodnodige sterische balans verschaffen die de individuele deeltjes stabiliteit zal verlenen. We hebben deze notitie aan het manuscript toegevoegd.

Schematische weergave van de bereiding van met PTX beladen, met transferrine versierde vaste lipidenanodeeltjes

Fysicochemische karakterisering van nanodeeltjes

Het met geneesmiddel beladen nanodeeltje werd bereid door middel van oplosmiddelverdamping gevolgd door homogenisatie. De gemiddelde deeltjesgrootte van met PTX geladen lipidenanodeeltjes (PLN) was ~ -140 nm, terwijl de uiteindelijke deeltjesgrootte van met transferrine versierde PTX-geladen lipidenanodeeltjes (TPLN) ~ -160 nm was (figuur 2a). De lichte toename van de deeltjesgrootte werd toegeschreven aan de conjugatie van transferrine aan het oppervlak van de nanodeeltjes. Er is gemeld dat deeltjeskenmerken, waaronder grootte en lading, belangrijke factoren zijn voor de systemische prestaties. De grootte en lading spelen een belangrijke rol bij de cellulaire opname en het toxische effect op de cellen. Een deeltjesgrootte van minder dan 200 nm, zoals waargenomen in de huidige studie, is naar verluidt het gunstigst voor de kankertargeting, omdat het de specifieke accumulatie van de deeltjes in het kankerweefsel mogelijk maakt dankzij het verbeterde permeatie- en retentieeffect (EPR). 9, 20, 21]. Evenzo bepaalt de oppervlaktelading van nanodeeltjes de interactie van het colloïdale stabiliteitsdeeltje met het celoppervlak. De gemiddelde oppervlaktelading van TPLN was − 22,5 ± 1,56 mV, wat aangeeft dat het potentieel voor kankertargeting is. De morfologie van het deeltje werd op zijn beurt bestudeerd door TEM (figuur 2b). De deeltjes waren perfect bolvormig en gelijkmatig verdeeld in het TEM-rooster. De uniforme verdeling van de deeltjes geeft het succes van de bereidingsmethode aan.

een Deeltjesgrootteverdeling van TPLN gemeten door dynamische lichtverstrooiing (DLS) analyse. b Meting van de deeltjesvorm door transmissie-elektronenmicroscoop (TEM). De DLS-experimenten werden in drievoud uitgevoerd (n = 3)

Drug laden en in vitro geneesmiddelafgifte

Er werd waargenomen dat de invangefficiëntie van PTX in nanodeeltjes 92,5 ±   1,35% was met een actieve laadefficiëntie van 8,6% w /w . De in vitro kenmerken van geneesmiddelafgifte van PLN en TPLN werden bestudeerd met behulp van de dialysemethode. De PLN en TPLN lieten een aanhoudende afgifte van het geneesmiddel uit het dragersysteem zien, wat erop wijst dat het geschikt is voor kankergerichte toepassingen. Bijvoorbeeld ~  30% van het geneesmiddel dat vrijkomt uit beide nanodeeltjes aan het einde van de onderzoeksperiode van 24 uur (Fig. 3). Evenzo werd de afgifte van het geneesmiddel aangehouden tot het einde van 75 uur, waarbij een gemiddelde afgifte van ongeveer ~ -65% werd waargenomen. Opgemerkt moet worden dat TPLN veel meer langdurige afgifte van geneesmiddelen vertoonde in vergelijking met PLN. Een iets lagere afgifte van het geneesmiddel werd voornamelijk toegeschreven aan de conjugatie van transferrineligand aan het oppervlak van het nanodeeltje. Het hoge molecuulgewicht van transferrine zou de afgifte van het geneesmiddel in hoge mate kunnen remmen. Over het algemeen geeft aanhoudende en langdurige afgifte van het geneesmiddel uit het nanodeeltje aan dat het geneesmiddel goed is gedispergeerd met de lipidenmatrix, waardoor de initiële burst-afgifte of het bifasische afgiftepatroon werd vermeden. Over het algemeen kan een gecontroleerde afgifte van het geneesmiddel uit het dragersysteem de kankerbehandeling versterken.

In vitro geneesmiddelafgiftekenmerken van PTX uit PLN en TPLN uit fosfaatgebufferde zoutoplossing (pH 7,4). De geneesmiddelafgifte werd bestudeerd door middel van de dialysemethode en het geneesmiddel werd gekwantificeerd door middel van de HPLC-methode. De meting is uitgevoerd n = 3

Cellulaire opname van de nanodeeltjes

Het targetingpotentieel van de nanodeeltjes naar de leukemiekankercel werd getest door confocale laser scanning microscopie (CLSM). De nanodeeltjes werden blootgesteld aan de kankercellen en gedurende 3 uur geïncubeerd. Rhodamine B werd gebruikt als een fluorescerende kleurstof om de verdeling van nanodeeltjes in de kankercellen te volgen. Zoals getoond in Fig. 4, was de rode fluorescentie-intensiteit relatief minder in PLN vergeleken met die in de TPLN. De resultaten toonden duidelijk de opmerkelijk hogere fluorescentie in het celcytoplasma in vergelijking met die van de PLN, wat wijst op het superieure targetingpotentieel van TPLN op de kankercellen. Een opmerkelijk hogere fluorescentie-intensiteit werd voornamelijk toegeschreven aan de conjugatie van transferrine aan het oppervlak van de nanodeeltjes. De Tf bond bij voorkeur aan de Tf-receptoren die tot overexpressie worden gebracht in de kankercellen en resulteerde in een hogere accumulatie van de nanodeeltjes in de kankercellen [22].

Cellulaire opnameanalyse van TPLN en PLN met behulp van confocale laserscanningmicroscoop (CLSM) bij 37 ° C. Rhodamine B werd gebruikt als een fluorescerende kleurstof en 3 uur geïncubeerd. De cellulaire opname-analyse werd uitgevoerd nadat de nanodeeltjes 3 uur onder 37 ° C in de incubator waren geïncubeerd. Schaalbalk is 20 μm

In vitro cytotoxiciteitstest

Het in vitro cytotoxische effect van vrij PTX, PLN en TPLN in HL-60-cellen werd geëvalueerd met MTT-assay. Zoals getoond in Fig. 5 vertoonden alle formuleringen een typisch dosisafhankelijk cytotoxisch effect in de leukemiekankercellen. Het kan worden gezien dat hoewel PTX een dosisafhankelijk effect vertoonde, PLN echter een relatief hoger cytotoxisch effect vertoonde, wat mogelijk te wijten is aan de hogere intracellulaire opname en aanhoudende afgifte van het geneesmiddel uit de nanodeeltjes. Om specifiek te zijn, TPLN vertoonde een significant hoger cytotoxisch effect in de kankercellen in vergelijking met dat van de PLN, wat wijst op de superieure doelefficiëntie van het met Tf versierde nanodeeltjessysteem. De IC50-waarde van TPLN was 0,45 g/ml vergeleken met 2,8 μg/ml voor PLN. Een zesvoudige afname van de IC50-waarde werd voornamelijk toegeschreven aan de hogere intracellulaire opname van TPLN in de Tf-receptor tot overexpressie gebrachte kankercellen. Een hoger afgiftepotentieel van TPLN in vergelijking met PLN en aanhoudende afgifte van het geneesmiddel aan het nucleaire doelwit zou de belangrijkste reden kunnen zijn voor het hogere cytotoxische effect in de kankercellen. Met Tf versierde nanodragers zijn onderzocht als een doelwit voor het afleveren van geneesmiddelen tegen kanker in kankercellen, waardoor de effectieve concentratie van het toegediende geneesmiddel wordt verlaagd en de multidrug-resistentie (MDR)-gerelateerde factoren worden overwonnen [23].

Cytotoxiciteitsanalyse van vrij geneesmiddel en met geneesmiddel geladen nanodeeltje door MTT-assay. Na behandeling van de cellen met verschillende concentraties geneesmiddelen en 24 uur geïncubeerd, werden cellen geanalyseerd met MTT-assay en met behulp van een plaatlezer. De meting is uitgevoerd n = 6. *p < 0,05 is het statistische verschil tussen TPLN en PTX

Hoechst 33342 Apoptose-assay

Het cytotoxische potentieel van nanodeeltjes werd verder geëvalueerd door Hoechst 33342 apoptose-assay. De cellen werden na behandeling met de respectievelijke formulering gekleurd met Hoechst 33342 en gedurende 15 minuten geïncubeerd. Zoals te zien is in figuur 6, waren onbehandelde controlecellen bolvormig met typische kenmerken voor gezonde cellen. De met PTX behandelde cellen vertoonden echter onregelmatigheden in de celvorm. Een typische celbeschadiging en apoptose kon worden gezien in de met PLN behandelde groep die te wijten zou kunnen zijn aan de verhoogde opname in de kankercellen. TPLN veroorzaakte een zeer opmerkelijke apoptose van de kankercellen en veel van de cellen waren vervormd met een enorme aanwezigheid van de apoptotische lichaamsvorming. De opmerkelijke celsplitsing en apoptose-inductie was consistent met de patenten op de levensvatbaarheid van de cellen, zoals beschreven in de voorgaande paragraaf.

Hoechst 33342-gebaseerde apoptose-assay. De cellen werden gekleurd met Hoechst 33342 en de apoptose werd geanalyseerd met een fluorescentiemicroscoop. De cel werd gedurende 24 uur met respectieve formuleringen geïncubeerd. Schaalbalk is 50 μm

Flowcytometer-gebaseerde apoptose-assay

De kwantitatieve analyse van de apoptose-assay werd uitgevoerd met een flowcytometer na kleuring met Annexin V- en PI-kleuringskit. De cellen werden behandeld met respectieve formuleringen en 24 uur geïncubeerd. De cellen werden vervolgens gekleurd met Annexine V en PI. Zoals getoond in Fig. 7 waren onbehandelde controlecellen levensvatbaar met meer dan 99% van de cellen in de levensvatbare kamer. De PTX-behandeling verminderde het aandeel levensvatbare cellen tot 90% met ongeveer ~ 9% van de apoptose. De PLN toonde ongeveer ~ 10% apoptosecellen met ~ 7% necrotische cellen. Belangrijk is dat TPLN een significante (p <-0,05) vermindering van de levensvatbare cellen in verhouding tot ~-65% met ongeveer ~-30% apoptosecellen (vroege en late apoptose). Het opmerkelijke apoptosepotentieel van TPLN werd toegeschreven aan de receptor-gemedieerde cellulaire opname en hogere accumulatie van antikankergeneesmiddel in de kankercellen die het antikankereffect in de tumorcellen zouden kunnen versterken [24, 25].

Op flowcytometer gebaseerde apoptose-assay. De cellen werden behandeld met de respectievelijke formulering en na 24 uur werden de cellen 15 gekleurd met Annexine V en PI. De cellen werden vervolgens gesorteerd met behulp van een flowcytometer. De cellen werden gedurende 24 uur met respectieve formuleringen geïncubeerd. De meting is uitgevoerd n = 3. *p < 0,05 is het statistische verschil tussen TPLN en PTX

Kolonievormingstest

Het kolonievormende vermogen in aanwezigheid van de respectievelijke formulering werd getest door kolonievormingsassay Fig. 8. Zoals getoond hebben PTX en PLN een klein potentieel om het kolonievormende vermogen van kankercellen te remmen. Belangrijk is dat TPLN een opmerkelijk vermogen vertoonde om het kolonievormende vermogen van de kankercellen te beheersen. TPLN vertoonde ~ 20% kolonievorming vergeleken met ~ 70% kolonievorming voor PTX, wat wijst op het superieure antikankereffect van TPLN. Het in stand houden van acute myeloïde leukemie is afhankelijk van een kleinere populatie leukemische stamcellen en voorlopercellen die het vermogen hebben kolonies te vormen; het is belangrijk om te testen of TPLN zich kan richten op de pool van kolonievormende cellen. Zoals de resultaten laten zien, kan het het risico op leukemiekanker aanzienlijk verminderen, wat suggereert dat het de ontwikkeling van kanker kan voorkomen en/of kwaadaardige cellen in een vroeg stadium kan elimineren. Daarom geeft de kolonievormingstest cruciale informatie over de potentiële werkzaamheid tegen kanker van de formuleringen.

Kolonievormingstest. De cellen werden na respectieve behandeling onderworpen aan een kolonievormingstestprotocol. De cellen werden gedurende 24 uur met respectieve formuleringen geïncubeerd. **p < 0,001 is het statistische verschil tussen PTX en PTLN