Gebruik van GaN/Fe-nanodeeltjes om endotheele cellen in vitro magnetisch te sturen

Samenvatting

We rapporteren de synthese en cellulair opname van multifunctionele GaN/Fe-nanodeeltjes en demonstreren hun nut als magnetische gidsen voor endotheele cellen. De deeltjes worden geproduceerd door een GaN-schil te laten groeien op ZnO/Fe₂O₃-kernen via hydride dampfase epitaxie (HVPE), gevolgd door kerneontbinding bij hoge temperatuur. Transmissie-elektronenmicroscopie bevestigt dat varkens aortale endotheele cellen de GaN/Fe-nanodeeltjes in vesikels internaliseren zonder de celviabiliteit te compromitteren. Deze inerte, magnetisch responsieve deeltjes kunnen worden gebruikt om cellen in externe magnetische velden te sturen, wat een nieuwe strategie biedt voor gerichte celdelivery en weefselengineering.

Achtergrond

Nanotechnologie heeft zich ontwikkeld tot een krachtig hulpmiddel in de oncologie, voornamelijk door middel van nanodeeltjes-gebaseerde medicijndragers. Echter, ligantbekleding, medicijnencapsulatie en covalente binding kunnen de leveringsefficiëntie beperken en veiligheidskwesties oproepen. Een alternatieve strategie omvat het gebruik van nanodeeltjes als directe biologische modulatoren – het targeten en sturen van cellen zelf. Zo kunnen magnetische nanodeeltjes endotheele cellen naar plaatsen van arteriële letsel leiden wanneer ze worden blootgesteld aan een extern magnetisch veld. Naast therapeutische toepassingen kunnen dergelijk gestuurde cellen helpen bij in-vitro celsortering en scaffold-functionaliseringsprocessen. Hier presenteren we het eerste bewijs dat endotheele cellen GaN/Fe-nanodeeltjes kunnen internaliseren en dat deze opname gecontroleerde ruimtelijke positionering van de cellen mogelijk maakt.

Methoden

Nanodeeltjessynthese

Dunne GaN-lagen werden gegroeid op ZnO-nanodeeltjes geallieerd met Fe₂O₃ met behulp van een twee-staps HVPE-proces. Een initiële nucleatielaag werd gedeponeerd bij 600 °C gedurende 5 min, gevolgd door een groeifase bij 800 °C gedurende 10 min om de ZnO-kern te ontbinden en de kristallijne kwaliteit van GaN te verbeteren. Het proces gebruikte metaal gallium, NH₃, HCl en H₂ als draggassen met debieten van respectievelijk 20, 600 en 3500 sccm.

Celkweek

Primaire varkens aortale endotheele cellen werden geïsoleerd door zachte afschraping van de aortawand, daarna gekweekt in EGM™-2 (Lonza) bij 37 °C, 5% CO₂. Passages 3–8 werden gebruikt, en cellen werden getransduceerd met GFP via lentivirus. Celonthechting voor experimenten werd uitgevoerd met TrypLE™Select(1X) (Gibco®).

XTT-test

Celviabiliteit werd beoordeeld 24 uur na toevoeging van nanodeeltjes. XTT-reagens (0,1 ml in 5 ml XTT) werd gemengd met vers EGM2-medium (2:1) en geïncubeerd gedurende 4 uur bij 37 °C, 5% CO₂. Absorptie werd gemeten op een Paradigm multi-mode plaatlezer.

Celtelling

Na 48 uur blootstelling aan nanodeeltjes werden cellen gefixeerd in 4% paraformaldehyde, gewassen met PBS en gekleurd met DAPI (1:7500). Afbeeldingen werden vastgelegd uit zes putjes per conditie met behulp van een Zeiss fluoresentiemicroscoop en gekwantificeerd met DotCount v1.2.

Transmissie-elektronenmicroscopie

Cellen geïncubeerd gedurende 24 uur met 50 µg/ml GaN/Fe-nanodeeltjes werden gefixeerd in 2% glutaraldehyde/2% formaldehyde, post-gefixeerd in 1% OsO₄, gedeshydrateerd en ingebed in EPON. Ultradunne coupes (~50 nm) werden gekleurd met 4% uranylacetaat en loodcitraat, en vervolgens bekeken op een FEI Tecnai 20 (200 kV).

Resultaten en discussie

GaN/Fe-nanodeeltjes werden ontworpen door ZnO/Fe₂O₃-kernen te bekleden met GaN, gevolgd door kernverwijdering. De resulterende deeltjes vertonen een GaN-schil (~20–100 nm) ingesloten met Fe, wat magnetische responsiviteit verleiht terwijl de piezo-elektriciteit van GaN behouden blijft. SEM, TEM, XRD, Raman en EDX-analyses bevestigen kerneontbinding, GaN-groei en een Fe-gehalte van ~50%.

Bij incubatie met varkens aortale endotheele cellen werden de nanodeeltjes voornamelijk geïternaliseerd in vesikels, zonder cytoplasmatische of nucleaire lokalisatie. Opname gebeurde via klassieke paden – micropinocytose, clathrine-gemedieerde en caveoline-gemedieerde endocytose – waarschijnlijk gedomineerd door caveolen in endotheele cellen. Viabiliteitstesten toonden een bescheiden, concentratie-afhankelijke reductie in metabolische activiteit bij 50 µg/ml, terwijl lagere doses (<10 µg/ml) >90% viabiliteit handhaafden.

Gegeven de hoge Fe-lading vertonen de deeltjes sterke ferromagnetische eigenschappen, terwijl het GaN-schil de piezo-elektriciteit behoudt. Deze dubbele eigenschappen maken externe actuatie mogelijk via ultrasone-geïnduceerde polarisatie en magnetische manipulatie. Om magnetische sturing te valideren, werden endotheele cellen beladen met 50 µg/ml GaN/Fe ontspannen, opnieuw opgeschorst en geplateerd op EGM™-2. Toen de kweekplaat onder permanente magneten werd geplaatst, vertoonden de cellen een zeer niet-willekeurige verdeling die overeenkwam met de magnetische veldkaart, terwijl controlecellen willekeurige plaatsing lieten zien. Dit demonstreert dat GaN/Fe-nanodeeltjes gebruikt kunnen worden om cellen op een voorspelbare manier te sturen.

Conclusies

We hebben aangetoond dat GaN/Fe-nanodeeltjes veilig worden geïternaliseerd door endotheele cellen en opgeslagen worden in vesikels. Hun magnetische responsiviteit maakt nauwkeurige, veld-gestuurde positionering van de cellen mogelijk, wat wegen opent voor gerichte celdelivery en de fabricatie van geëngineerde weefsels. Daarnaast biedt de intrinsieke piezo-elektriciteit van GaN een platform voor externe elektrische stimulatie van cellulaire functies. Lopend werk zal in vivo toepassingen en de integratie van piezo-activering voor therapeutische modulatie onderzoeken.

Afkortingen

EDX:

Energie-dispersieve Röntgenanalyse

EGM™-2:

Endotheliale Groeimedium 2

Fe:

IJzer

Fe₂O₃:

IJzer(III)oxide

GaN:

Galliumnitride

GFP:

Groen fluorescerend proteïne

H₂:

Waterstof

HCl:

Waterstofchloride

NH₃:

Ammoniak

OsO₄:

Osmiumtetroxide

PBS:

Fosfaat-gebufferde zoutoplossing

SEM:

Scanning elektronenmicroscopie

TEM:

Transmissie elektronenmicroscopie

XRD:

Röntgendiffractie

ZnO:

Zinkoxide