Kwantitatieve studie naar de opname van PLGA-nanodeeltjes in larynxkanker- en immuuncellen ter verbetering van geneesmiddelafgifte

Samenvatting

De klinische vertaling van poly(lactide-co-glycolide) (PLGA)-gebaseerde nanogeneesmiddelen wordt belemmerd, deels door de lage afgifteefficiëntie als gevolg van niet-specifieke fagocytose door fagocyten. De interactie tussen nanodeeltjes, kankercellen en immuuncellen blijft grotendeels onbekend. In deze studie werd voor het eerst een kwantitatief onderzoek uitgevoerd naar de cellulaire internalisatie van fluorescentie PLGA-deeltjes (100 nm, 500 nm en 1 µm) in larynxcarcinoomcellen met of zonder monocyten/macrofagen in monocultuur- en co-cultuursystemen. PLGA-deeltjes in concentraties van 5–20 µg/mL bleken superieur biocompatibel, met uitzondering van 500 nm en 1 µm deeltjes bij 20 µg/mL die de cellevensvatbaarheid iets reduceren. Microscopische observatie toonde aan dat alle drie de deeltjesgroottes effectief worden ingenomen door zowel kankercellen als macrofagen; kwantitatieve fluorescentieanalyse onthulde echter dat de opname-index van kankercellen (gemiddelde intracellulaire deeltjesfluorescentie per kankercel genormaliseerd aan die per macrofaag) aanzienlijk daalde voor alle PLGA-deeltjes in co-culturen vergeleken met monoculturen (1,35–1,05, 1,50–0,59 en 1,4–0,47 voor 100 nm, 500 nm en 1 µm deeltjes respectievelijk). Stroomcytometrie bevestigde de verlaagde opname-index van kankercellen in co-culturen, maar een hoger deeltjesaantal per macrofaag. Bovendien nam de vorming van multinucleerde reuzencellen door fusie van macrofagen toe na PLGA-behandeling, wat potentiël benut kan worden voor tumorgerichte geneesmiddelafgifte. Deze bevindingen bieden nieuwe inzichten in de interactie tussen nanodeeltjes, immuuncellen en kankercellen, wat de toepassing van PLGA-gebaseerde nanodragers voor de behandeling van larynxcarcinoom kan bevorderen.

Inleiding

Kanker is wereldwijd een van de belangrijkste doodsoorzaken met ongeveer 10 miljoen nieuwe dodelijke gevallen in 2018. Larynxcarcinoom (kanker die ontstaat in de keelkop) is de op een na meest voorkomende maligniteit van plaveiselcelcarcinoomen van het hoofd-halsgebied (HNSCC), met ongeveer 180.000 nieuwe gevallen en 95.000 doden in 2018. Op dit moment worden gerichte geneesmiddelen ontwikkeld als optionele behandeling voor uitdagingen geïntroduceerd door traditionele therapieën zoals chirurgie, radiotherapie en chemotherapie. Wetenschappelijke inspanningen zijn versneld om geneesmiddeltargeting en effectiviteit te verbeteren en ongewenste bijwerkingen te verminderen door bijvoorbeeld nieuwe nanodragers (zoals micronadels), gepersonaliseerde antikankergeneesmiddelen en therapieën gericht op antilichaam-gemediëerde afgifte te ontwikkelen.

Nanodragers worden veel gebruikt om antikankergeneesmiddelen zoals cisplatine, paclitaxel en docetaxel te laden om hun wateroplosbaarheid, biobeschikbaarheid en stabiliteit te verbeteren voor een betere geneesmiddelafgifte en effectiviteit. In het algemeen stelt nanodeeltjes-gebaseerde geneesmiddelafgifte de levering van een breed scala aan stoffen (bijv. eiwitten, antilichamen, vaccins, nucleïnezuren) naar specifieke lichaamsregio's toe in zowel diermodellen als patiënten. Het versterkte permeabiliteits- en retentie-effect (EPR-effect) leidt echter tot aanzienlijk variërende targetingefficiëntie tussen verschillende kankertypen. Recente bewijzen suggereren dat de depositie van nanogeenmiddeldragers (hier goudnanodeeltjes) in tumoren preferentieel afhangt van transcytose, een type biologische transcellulaire transport waarbij stoffen/nanodeeltjes via endocytose, vesiculair transport en exocytose door cellen heen worden getransporteerd. De tegenstrijdige resultaten over de mechanismen van gerichte geneesmiddelafgifte benadrukken het kritieke belang van het begrijpen van de basis van cellulaire interactie met nanogeenmiddelen of nanodeeltjes door middel van meerdere experimentele strategieën, variërend van in vitro celcultuur tot ex vivo weefselcultuur en in vivo dierstudies.

Talrijke nanodragers zoals liposomen, albuminen nanodeeltjes, silice nanodeeltjes en poly(lactide-co-glycolide) (PLGA) zijn klinisch toegepast voor de behandeling van verschillende kankertypen, waaronder larynxcarcinoom. Polymere nanodeeltjes zoals micellen en PLGA hebben groot potentieel in biomedische toepassingen vanwege hun veelzijdige formuleringen, uitstekende zelfassemblage, hoge laadcapaciteit en biocompatibiliteit. Bijvoorbeeld tonen PEG-gecoate PLGA-nanodragers geladen met doxorubiccine en indocyaan groen synergistische chemo-fotothermale therapie voor borstkanker. Ook tonen zowel in vitro als in vivo studies dat cisplatine-geladen micellen uitstekende antikankeractiviteit vertonen tegen orthotope HNSCC-tumormodellen. Hoewel verschillende polymere nanogeenmiddeldragers zoals PLGA en micellen zijn goedgekeurd voor klinisch gebruik of in klinische studies worden geëvalueerd, zijn er veel meer polymere nanogeenmiddelen in preklinisch onderzoek met verschillende hoofd-hals kankercellijnen en xenotransplantatie tumor modellen.

Wetenschappelijke bewijzen benadrukken het belang van de immunologische reacties van de gastheer op nanogeenmiddeldragers, omdat deze nanodeeltjes zodra ze het lichaam binnenkomen onvermijdelijk worden herkend door het immuunsysteem. Macrofagen worden beschouwd als de eerste lijn van cellulaire afweer, gespecialiseerd in de neutralisatie en opschoning van allergenen, micro-organismen en vreemde deeltjes (bijv. nanodragers) via fagocytose en daaropvolgende priming van immuunreacties. De meeste nieuw ontworpen nanodragers slagen er niet in om specifiek ziektegebieden of tumoren in vivo te bereiken door de efficiënte accumulatie van nanodeeltjes in het mononucleaire fagocytose systeem (MPS), zoals Kupffercellen in de lever en rode pulp macrofagen in de milt. Het begrijpen van de mechanismen van cellulaire opname van nanodeeltjes door immuuncellen zoals monocyten en macrofagen is daarom cruciaal, omdat dit de levensduur van nanodragers in relevante weefsels en biologischvloeistoffen bepaalt. Het opkomende in vitro co-cultuursysteem heeft daardoor toenemende aandacht gekregen in de velden van nanogeneeskunde en toxicologie vanwege de groeiende vraag naar meer betekenisvolle resultaten die de in vivo situatie beter weerspiegelen. Co-cultuursystemen blijken inderdaad een realistische situatie na te bootsen van gezonde en ziekte weefseltoestanden en zijn betrouwbaar gebruikt in studies naar celopname van nanodeeltjes en geneesmiddelabsorptie. Het gebruik van co-cultuurmodellen van kankercellen en immuuncellen biedt doorgaans een geschikt platform om de opnameroutes en mechanismen van deze nanomaterialen in cellen te onderzoeken, wat het ontwerp van nanodragers kan vergemakkelijken die beter gericht zijn op kankerachtige cellen tegelijkertijd de fagocytose van nanodeeltjes verminderen. Het is daarom van essentieel belang om de opname-efficiëntie en het lot van nanodeeltjes in kankercellen in aanwezigheid van immuuncellen te bepalen. De meeste nanodragers zijn ontworpen met diameters van 50–200 nm om het EPR-effect te benutten en de bloedsomloop te verlengen, terwijl grotere nanodeeltjes (> 500 nm) efficiënt worden opgeruimd door het MPS. PLGA, een door de FDA goedgekeurde nanodrager, in verschillende groottes (100, 500 en 1000 nm) werd dus geselecteerd om de opnamecapaciteiten van UM-SCC-17A (een klassieke larynx plaveiselcel carcinoom cellijn) en THP-1 (een humane acute monocytaire cellijn) te onderzoeken. Verschillende in vitro studies hebben PLGA-nanodragers toegepast om geneesmiddelen af te leveren aan HNSCC-kankercellen in monoculturen; dit is de eerste studie die de opname-efficiëntie en het mechanisme van nanodeeltjesopname door immuuncellen en larynxkankercellen synchroon in een co-cultuursysteem onderzoekt met behulp van verschillende PLGA-groottes, wat een fundamentele basis kan bieden voor de ontwikkeling van nieuwe veilige nanogeneesmiddelen voor HNSCC-therapie.

Materialen en methoden

Materialen

Drie gecommercialiseerde PLGA-deeltjes (Sigma-Aldrich) met verschillende groottes, namelijk 100 nm, 500 nm en 1000 nm, werden in deze studie gebruikt. Alle deeltjes waren geladen met groene fluoroforen met optische excitatie- en emissiegolflengtes van respectievelijk 460 nm en 500 nm. Alle deeltjes werden in poedervorm ontvangen en in gedestilleerd water opgelost met een eindconcentratie van 10 mg/mL voor verder gebruik. Hydrodynamische diameters en zetapotentialen van de drie deeltjes werden bepaald door dynamische lichtverstrooiing (DLS) met een Malvern Zeta Sizer Nano instrument (Malvern Instruments Ltd., Malvern, VK). De voorraadsuspensies van elk deeltje werden 1:100 verdund in 80 µl gedestilleerd water voor DLS-meting. Volg de aanwijzing van de fabrikant, werden 3 herhaalde metingen per deeltje verkregen.

Celculturen van UM-SCC-17A en THP-1 en deeltjesblootstelling

De humane larynxcarcinoomcellijn UM-SCC-17A en de humane monocytaire/macrofagecellijn THP-1, aangeschaft bij respectievelijk Sigma-Aldrich, VS en Shanghai Hengya Biotechnology Company (Shanghai, China), werden gebruikt om het in vitro model in deze studie te bouwen. UM-SCC-17A-cellen en THP-1-cellen werden gekweekt in DMEM respectievelijk RPMI-1640 celcultuurmedium aangevuld met 10% FBS (Gibco, Duitsland) en 1% Penicilline-Streptomycine oplossing (Gibco, Duitsland) bij 37 °C met 5% CO2. THP-1-cellen werden 72 uur blootgesteld aan 100 nM Phorbol 12-myristate 13-acetaat (PMA) (Sigma, VS) oplossingen voor zaaiing om te differentiëren tot macrofagen. Beide celtypes werden elke 3 dagen doorgezet met 0,5% trypsine-EDTA, en de celmorfologie werd dagelijks gecontroleerd om de gezondheid van de cellen te waarborgen.

Cellen werden gezaaid in 24-putplaten met een dichtheid van 0,1 × 10⁶ cellen/put voor monocultuurcellen voor WST-1 en LDH-toets, of op steriele dekkerslipjes in 24-putplaten voor fluorescentiemicroscopie. Voor het co-cultuursmodel werden UM-SCC-17A-cellen eerst gezaaid in 24-putplaten met een dichtheid van 50.000/put overnachten en daarna toegevoegd met 50.000/put THP-1-cellen. Deeltjes werden opgelost in 500 µl respectievelijk celcultuurmedium voor monocultuur UM-SCC-17A en THP-1 cellen of 1:1 gemengd celcultuurmedium voor co-gekweekte cellen en blootgesteld aan celmonsters gedurende 24 uur met eindconcentraties van 5, 10 en 20 µg/mL voor WST-1 en LDH-toets of 10 µg/mL voor fluorescentiemicroscopie.

Voor FACS-meting werden cellen gezaaid in 12-putplaten op dezelfde manier zoals eerder beschreven met een dichtheid van 250.000 cellen/put, of 125.000 cellen/put elk voor het co-cultuursmodel. Cellen groeiden in 1 ml celcultuurmedium overnachten en werden blootgesteld aan PLGA-deeltjes met een eindconcentratie van 10 µg/mL gedurende 24 uur.

Cellevensvatbaarheidstoets

De cellevensvatbaarheid werd bepaald met de celproliferatiereagens WST-1 kit (Roche, Duitsland) volgens de instructies van de fabrikant. Kortom, de WST-1-oplossing werd 1:10 verdund in respectievelijk celcultuurmedium voor monocultuur UM-SCC-17A of THP-1, of 1:1 gemengd celcultuurmedium voor co-gekweekte cellen. Het supernatans werd afgegoten na de blootstelling, en cellen werden geïnculeerd met 500 µl werkoplossing van WST-1-toets bij 37 °C gedurende 30 min. Monsters werden verzameld en gecentrifugeerd met 14.000 toer/min gedurende 10 min om de deeltjes te verwijderen. De absorbantie (OD-waarde) van de oplossingen werd gemeten bij een golfengte van 450 nm met Infinite^®F200 (Tecan, VS). De absorbantiewaarden werden gecorrigeerd door de waarde van een blanco monster met alleen de WST-1-werkoplossing af te trekken, en de relatieve cellevensvatbaarheden werden vergeleken met het onbehandelde controlemonster.

Celmembraanlektoets

Lactaatdehydrogenase (LDH)-vrijzetting werd gemeten met een commerciële cytotoxiciteitsdetectiekit (LDH) (Roche, Duitsland) om de cytotoxiciteit door PLGA-deeltjes te bepalen. Het supernatans van de cellen werd 24 uur na de blootstelling verzameld, gecentrifugeerd met 14.000 toer/min gedurende 10 min, en 1:10 verdund in 200 µl complet celcultuurmedium. De positieve controle werd gedefinieerd als de totale LDH-vrijzetting door incubatie van de cellen met 0,2% Triton X-100 bij 37 °C gedurende 15 min, en 1:50 verdund in 200 µl complet celcultuurmedium. Monsters werden geïnculeerd met 100 werkoplossingen van LDH-toets gedurende 30 min bij kamertemperatuur, en de reactie werd gestopt met 50 µl 1% HCl. De absorbantie bij een golfengte van 492 nm werd gemeten met Infinite®F200 (Tecan, VS), en relatieve LDH-concentraties werden berekend volgens de volgende vergelijking:

$${\text{Relatieve LDH-concentratie}} = \left( {{\text{monster OD}}{-}{\text{blanco OD}}} \right)/\left( {{\text{positieve controle OD}}{-}{\text{blanco OD}}} \right) \times 5 \times 100\%$$

Fluorescentiemicroscopie

Cellen werden gevisualiseerd door Hoechst-kleuring voor lokalisatie van de deeltjes onder de fluorescentiemicroscoop. Cellen werden 3 keer gewassen met PBS na 24 uur blootstelling aan de deeltjes en geïnculeerd met 4% formaldehyde gedurende 10 min bij kamertemperatuur. Na fixatie met formaldehyde werden cellen vervolgens geïnculeerd met 200 µl kleuringsoplossing bevattende 1:1000 verdunde Hoechst en 1% BSA in PBS gedurende 30 min. Vervolgens werden de dekkerslipjes omgekeerd op een objectglas geplaatst en vastgehouden met een druppel DAKO fluorescentie anti-fade middel voor visualisatie. Vier optische kanalen werden ingesteld met een fluorescentiemicroscoop, waaronder helder veld voor celmorfologie, DAPI voor celkernen en GFP voor deeltjes. Bloottijden van het deeltjeskanaal voor elke fluorescentieafbeelding werden vastgelegd en gebruikt voor homogenisatie van de fluorescentie-intensiteit over verschillende deeltjes, en intracellulaire deeltjes werden berekend door fluorescentie-intensiteit met willekeurig geselecteerde gebieden via ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/). De opname-index over verschillende deeltjes werd vergeleken tussen mono- of co-gekweekte UM-SCC-17A-cellen. Kortom, de gemiddelde fluorescentie-intensiteit (MFI) van geïternaliseerde deeltjes werd berekend in bijvoorbeeld 50 cellen per celtype, wat bepaald werd als het verschil tussen de totale fluorescentie-intensiteit (I_totaal) van een specifiek gebied en de autofluorescentie (I_auto) van hetzelfde grote gebied in het deeltjesvrije gebied. De opname-index van kankercellen werd bepaald door de MFI van UM-SCC-17A genormaliseerd aan die van THP-1-cellen in zowel mono- als co-cultuursmodel. De berekening werd uitgevoerd volgens de onderstaande vergelijking:

$${\text{opname-index}} = \frac{{I_{{{\text{totaal1}}}} - I_{{{\text{auto1}}}} \left( {{\text{MFI}}_{{{\text{UM}} - {\text{SCC}} - 17A}} } \right)}}{{I_{{{\text{totaal2}}}} - I_{{{\text{auto2}}}} \left( {{\text{MFI}}_{{{\text{THP}} - 1}} } \right)}}$$

Fluorescentie-geactiveerde celsorting (FACS)

De fluorescentie-geactiveerde celsorting (FACS) werd uitgevoerd om de opnamecapaciteit van de drie deeltjes te meten. Cellen werden 3 keer gewassen met PBS om het celmedium en gedissocieerde deeltjes 24 uur na de blootstelling te verwijderen en geïnculeerd met 200 µl 0,5% trypsine-EDTA (Gibco, Duitsland) bij 37 °C gedurende 4 min om de cellen van de plaat te lösen. Vervolgens werd de reactie gestopt door 2 ml compleet celcultuurmedium toe te voegen, en de celsuspensie werd overgebracht naar een glasbuis voor FACS-meting en 5 min gecentrifugeerd met 300 × G, 4 °C. Het supernatans werd voorzichtig afgegoten, en cellen werden opgelost in 200 µl PBS en op ijs bewaard. Levende cellen werden eerst gegateerd van debris en dode cellen met voorwaartse (FSC-A) en zijwaartse (SSC-A) verstrooiing. Vervolgens werden de co-gekweekte cellen geanalyseerd met APC-kanaal versus FSC-A om UM-SCC-17A-cellen van macrofagen te scheiden op basis van celgrootte. In totaal werden 30.000 cellen per monster geanalyseerd, en de gemiddelde fluorescentie-intensiteit per cel werd berekend en genormaliseerd over verschillende deeltjes. Tegelijkertijd werden na 24 uur incubatie van deeltjes met cellen, het celcultuursupernatans, wasbuffer (drie keer wassen om residuele deeltjes aan het celoppervlak te verwijderen) en cellen (trypsine-verteering) verzameld om de fluorescentie-intensiteit te meten met een microplaatlezer (Infinite®F200, Tecan). Door deze benadering kan het percentage door cellen geïngeste deeltjes worden bepaald voor elke groep, bijvoorbeeld ongeveer 30.000 deeltjes blootgesteld aan een enkele cel in een 12-putplaat (250.000 cellen in totaal) bij een dosering van 5 µg 100 nm PLGA-deeltjes, resulterend in gemiddeld 13.000 deeltjes geïngeste door enkele cellen, wat ongeveer 43% van de toegepaste dosering is die aan de cellen wordt afgeleverd. Dit afgeleverde percentage kan verder worden gebruikt om de deeltjestellingen in het co-gekweekte systeem voor elk celtype in FACS te berekenen.

Kwantificering van celfusie

Macrofagefusie tot multinucleerde reuzencellen (MGC) werd gedefinieerd als een reuscel morfologisch met twee of meer kernen binnen een normaal cytoplasma, wat duidelijk en synchroon geïdentificeerd kan worden in helder-veldafbeeldingen en fluorescentieafbeeldingen na kleuring zoals beschreven in de literatuur. Het percentage celfusie werd berekend door het aantal MGC-kernen (handmatig geteld) genormaliseerd aan de totale celtelling, wat bepaald werd met een geautomatiseerde aanpak in ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/).

Statistische analyse

GraphPad V8.0 software (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, VS) werd gebruikt voor statistische analyse en resultaatvisualisatie. Na eenrichtingsvariatieanalyse (ANOVA) werd ofwel de Holm-Sidak-methode ofwel de t-toets uitgevoerd voor het vergelijken van respectievelijk meervoudige groepsresultaten of tweegroepsresultaten. Alle experimenten werden in onafhankelijke drievouden uitgevoerd, en data werden gepresenteerd als gemiddelde ± standaarddeviatie (SD). Resultaten met p-waarde < 0,05 (*) en p < 0,01 (**) werden als significant beschouwd.

Resultaten en discussie

Karakterisatie van poly(lactide-co-glycolide) deeltjes

Fluorescentiemicrografieken van PLGA-deeltjes (Fig. 1a,b,c) vertoonden robuuste fluorescentie-intensiteit en geen significante afname in fluorescentiesignalen gedurende 14 dagen na bereiding (Aanvullend bestand 1: S1), wat wijst op een relatief homogene grootteverdeling en hoge fluorescentiestabiliteit. Zoals aangegeven door de leverancier, vertoonden 100, 500 en 1000 nm PLGA-deeltjes groottes van ongeveer 80,6 ± 19,3 nm, 542,6 ± 128,3 nm en 951,9 ± 237,5 nm (Fig. 1d,e,f), respectievelijk. Volgens zetapotentiaalmetingen werden de gemiddelde oppervlakteladingen op de deeltjes gevonden van -20,6 ± 5,3, -17 ± 4,6 en -16,5 ± 3,5 met poly-dispersiteitsindex van 0,057, 0,056 en 0,062 voor 100, 500 en 1000 nm deeltjes, respectievelijk, wat de laatste aantoonde dat ze hoogst monodispers zijn. Alle deeltjes werden gevorteld en vervolgens 5 minuten gesonicatieerd in een waterbad om aggregatie van deeltjes grotendeels te elimineren. Echter, kleine pieken overeenkomend met 100 en 1000 nm deeltjes werden waargenomen met diameters van ongeveer 4-6 µm door de onvermijdelijke deeltjesaggregatie in zeer kleine hoeveelheden (ongeveer 3-4%).

Evaluatie van cellevensvatbaarheid en cytotoxiciteit

Vanwege hun uitstekende biocompatibiliteit en biologische afbreekbaarheid zijn PLGA-deeltjes goedgekeurd door de FDA en het Europees Geneesmiddelenagentschap voor biomedische toepassingen. PLGA-deeltjes worden daarom momenteel in de kliniek gebruikt en breed toegepast in preklinische studies als nanodragers die geneesmiddelen afgeven aan specifieke ziektegebieden of tumoren. De targetingefficiëntie en therapeutische effectiviteit van PLGA-deeltjes worden echter belemmerd, ten minste deels, door het immuunsysteem. Bijvoorbeeld, hoge deeltjesfagocytose door Kupffercellen in de lever beperkt nanogeenmiddeldragers sterk in het bereiken van de tumorplaats. Het is daarom van vitaal belang om geavanceerde in vitro modellen op te zetten om de interactie tussen kankercellen, immuuncellen en deeltjes te bestuderen om de in vivo situatie van geneesmiddelafgifte beter na te bootsen. UM-SCC-17A is een unieke larynx plaveiselcel carcinoom cellijn geïsoleerd uit een primair larynxkanker specimen. Informatie over de in vitro cellulaire opname-efficiëntie in co-cultuursystemen (bijv. co-incubatie van macrofagen en kankercellen) is echter nog onvoldoende, een kwestie die aangepakt moet worden om de voorspellende capaciteit van in vivo reacties te verbeteren. Bovendien is bewezen dat deeltjesgrootte en oppervlaktecoating een belangrijke rol spelen in de leveringscapaciteit aan solide tumoren, ziekteplaatsen en kankercellen in diermodellen en celculturen. Hier pasten we dus drie groottes PLGA toe op UM-SCC-17A carcinoomcellen om de effecten van deeltjesgrootte op cellulaire opname en intracellulaire distributie in monocultuur- en co-cultuursystemen te onderzoeken.

Deze studie bepaalde de cellevensvatbaarheid met de WST-1-methode voor monocultuur THP-1 en UM-SCC-17A cellen, evenals een co-cultuur van beide celtypes. Ondanks dat er geen duidelijke celdood optrad in groepen behandeld met 100 en 500 nm PLGA bij alle geteste concentraties, reducerden 500 nm en 1 µm PLGA-deeltjes bij de hoogste concentratie (20 µg/mL) de cellevensvatbaarheid significant in monocultuur UM-SCC-17A cellen (Fig. 2a). Zoals verwacht, werd de THP-1 cellevensvatbaarheid niet significant beïnvloed na 24 uur incubatie met alle drie PLGA-typen bij concentraties van 5-20 µg/mL (≥ 95% levensvatbaarheid vergeleken met onbehandelde cellen, wier levensvatbaarheid als 100% wordt beschouwd, Fig. 2b). Identiek aan de resultaten van monocultuur UM-SCC-17A cellen, werd de cellevensvatbaarheid in het co-cultuursysteem niet gewijzigd door de aanwezigheid van 100 en 500 nm PLGA-deeltjes in de drie gebruikte doseringen, terwijl het significant afnam in de groep behandeld met 20 µg/mL 1 µm PLGA (Fig. 2c).

Evaluatie van deeltjescytotoxiciteit met de LDH-toets dient om lekkage van het celmembraan te bepalen door het meten van de hoeveelheid extracellulaire LDH. De vrijzetting van dit cytoplasmatische enzym in het celcultuursupernatans is kenmerkend voor celmembraanschade, wat leidt tot onomkeerbare celdood. Ondanks een lichte toename van LDH-niveaus met hogere doseringen in monocultuur UM-SCC-17A cellen behandeld met verschillende doseringen 1 µm PLGA, werd geen duidelijke cytotoxiciteit waargenomen zelfs bij de hoogste concentratie van 20 µg/mL (Fig. 3a). Niet verrassend, waren alle drie PLGA-grootten die hier gebruikt werden bij verschillende doseringen niet in staat om substantiële LDH-vrijzetting in het supernatans te induceren, wat wijst op onbetekenisvolle toxische effecten op monocultuur THP-1 cellen, wat ook zeer consistent is met de hierboven beschreven cellevensvatbaarheidsresultaten (Fig. 3b). In de co-cultuurexperimenten vertoonden alle deeltjes met verschillende concentraties uitstekende biocompatibiliteit ten aanzien van beide cellen in termen van vrijgezette LDH-niveaus (Fig. 3c). In het algemeen dekt de brede deeltjesgrootterange, van 100 nm tot 1 µm, die hier gebruikt werd, de typische groottes van nanodragers (50-200 nm), zoals liposomen, micellen, dendrimeren, polymeren en minicellen. Deze range dekt ook submicron-grootte deeltjes (500 nm deeltjes kunnen nog steeds als nanodeeltjes worden beschouwd, bijv. deeltjes met groottes van ongeveer 500 nm hebben dezelfde clearance-routes in de long als nanodeeltjes van 10-100 nm en micron-grote 1 µm deeltjes). Geen van deze PLGA-deeltjes vertoonde duidelijke cytotoxiciteit ten opzichte van THP-1 en/of UM-SCC-17A cellen in monocultuur- en co-cultuursystemen, met uitzondering van 500 nm en 1 µm PLGA-deeltjes bij de hoogste concentratie tegen UM-SCC-17A en co-cultuurcellen (maar meer dan 85% van de cellen overleeft), wat aangeeft dat ze gunstig zijn voor toepassingen in geneesmiddelafgiftesystemen.

Cellulaire opnamecapaciteiten van PLGA in monocultuur- en co-cultuursystemen

Figuur 4 toont de celmorfologie (Fig. 4a,d,g), celkernen en 100 nm nanodeeltjes (Fig. 4b,e,h), en samengevoegde vergrote afbeeldingen (Fig. 4c,f,i) in monocultuur- en co-cultuursystemen. Geen deeltjes werden waargenomen in onbehandelde cellen van de controlegroep (Aanvullend bestand 1: S2). Massale groot-grootte 100 nm PLGA-nanodeeltjes agglomeraten werden waargenomen in het cytoplasma van de macrofaag monocultuurcellen (Fig. 4c). Tegenovergesteld, monocultuur UM-SCC-17A vertoonde een uitstekende opnamecapaciteit van 100 nm PLGA, bewezen door de heldere groene fluorescentiesignalen waargenomen binnen het celmembraan (Fig. 4f). Om de intracellulaire accumulatie van PLGA-deeltjes in THP-1 of UM-SCC-17A cellen en extracellulaire deeltjes in de co-culturen beter te illustreren, werden overlays van helder-veldafbeeldingen met fluorescentieafbeeldingen toegepast (zoals in Aanvullend bestand 1: S3). In het co-cultuursysteem zijn beide celtypes te differentiëren in termen van morfologie en celgrootte in de helder-veldafbeeldingen, waarin macrofagen een ronde vorm en kleine grootte vertoonden, terwijl de kankercellen een grote grootte en uitgerekte vorm hadden. De kankercellen vertoonden echter onvoldoende cellulaire opname door de hoge opname van 100 nm PLGA door macrofagen in het co-gekweekte systeem. Dit is verwacht omdat macrofagen worden beschouwd als een efficiënt en specifiek type immuuncellen die de fagocytosefunctie uitvoeren voor het opschonen van vreemde micro-organismen, allergenen en deeltjes. Op dezelfde manier tonen Fig. 5 en Fig. 6 een kwalitatieve analyse van de cellulaire opnamecapaciteit van 500 nm en 1 µm PLGA-deeltjes in enkelvoudige of gemengde celculturen, respectievelijk. Het is opvallend dat beide celmorfologieën niet gewijzigd werden na behandeling met verschillende PLGA-grootten bij de hier gebruikte concentratie van 10 mg/mL (Fig. 4a,d,g, Fig. 5a,d,g en Fig. 6a,d,g). 500 nm en 1 µm PLGA-deeltjes vertoonden sterkere fluorescentie-intensiteit in enkelvoudige UM-SCC-17A cellen (Fig. 5e,f en Fig. 6e,f) dan in enkelvoudige THP-1 cellen (Fig. 5b,c en Fig. 6b,c). In co-cultuurincubaties (Fig. 5h,i en Fig. 6h,i) zijn duidelijke signaaldalingen in kankercellen waarneembaar, waarin de deeltjesfluorescentie-intensiteit lager was dan die van de macrofagen. Macrofagen fagocyteren alle typen deeltjes snel en effectief, zodat kankercellen in co-cultuursysteem niet voldoende deeltjes kunnen opnemen. Om het effect van fagocytose op de opnamecapaciteit door kankercellen voor verschillende PLGA-grootten te kwantificeren, werd een semi-kwantitatieve optische analyse uitgevoerd. Kortom, de deeltjesfluorescentie-intensiteiten werden berekend op basis van bijvoorbeeld 50 individuele deptjesbeladen cellen om een gemiddelde waarde voor beide celtypes te verkrijgen, en de opname-index van kankercellen werd bepaald door de intracellulaire deeltjesfluorescentie-intensiteit per kankercel te gemiddelden genormaliseerd aan die van macrofagen (Fig. 7). In monocultuur werd de opname-index van kankercellen voor 100 nm PLGA als ongeveer 1,34 ± 0,19 gevonden, wat suggereert dat de kankercellen meer deeltjes hebben geïngeste dan die geïngeste door macrofagen in de enkelvoudige celcultuur (Fig. 7). Dit is niet verrassend vanwege het hoge viscositeitsniveau van PLGA-deeltjes en de grotere grootte van larynxkankercellen. Op dezelfde manier werden 500 nm en 1 µm PLGA ook in grote mate geïngeste door kankercellen met opname-indices van ongeveer 1,5 ± 0,25 en 1,4 ± 0,31, respectievelijk, in monocultuur. De opname-indices voor grote deeltjes daalden aanzienlijk (0,59 ± 0,12 en 0,47 ± 0,1) in aanwezigheid van macrofagen in co-cultuursystemen. Tegelijkertijd, identieke cellulaire internalisatiecapaciteiten voor beide celtypes na 24 uur incubatie van 100 nm PLGA-deeltjes in de gemengde celcultuur. Over het algemeen suggereerden de hier geaccumuleerde resultaten dat de opname van deeltjes door kankercellen en macrofagen kan afhangen van verschillende opnameroutes in enkelvoudige celcultuur- en co-culturomgeving. Bovendien verlaagde de aanwezigheid van macrofagen de cellulaire internalisatie van PLGA-deeltjes door kankercellen, met name voor grote deeltjes, een biologisch fenomeen dat is waargenomen in in vivo nanogeneesmiddelafgiftestudies.

Kwantificering van cellulaire opname door stroomcytometrie

Stroomcytometrie wordt veel gebruikt om de deeltjes-cel-interactie op kwantitatieve wijze te bepalen, bijvoorbeeld de grootte-afhankelijke opname van polystyreen deeltjes met groottes variërend van 20 tot 1000 nm door dendritische cellen in vivo. FACS werd dus gebruikt voor analyse van het percentage NP-positieve cellen en deeltjesaantal in die NP-positieve cellen in monocultuur- en co-cultuursystemen. Vervolgens werd het gemiddelde NP-aantal in een enkele cel berekend door de totale fluorescentie-intensiteit in de deptjesbeladen cellen te normaliseren aan de fluorescentie van de totale toegepaste dosering. Bijvoorbeeld, ongeveer 70% van 500 nm PLGA werd gedeponeerd in de kankercellen, terwijl de rest in het supernatans van de celculturen bleef (Aanvullend bestand 1: S4). Deze fluorescentie-intensiteit gemeten met een Tecan-lezer werd vergeleken met de gemiddelde/totale FACS-signalen (FITC-signaalwaarden van P5 en P6 in Fig. 8) om het deeltjesaantal in het co-cultuursysteem te schatten. Zoals gezaaid in de co-gekweekte cellen, werden ongeveer de helft van de cellen herkend als macrofagen en de rest als kankercellen. Er werd waargenomen dat ongeveer 13.000 enkele 100 nm PLGA-deeltjes geaccumuleerd waren in kankercellen en 9700 deeltjes in macrofagen (Fig. 8i) in de monocultuur, consistent met de bovenstaande microscopische onderzoeken. Een veel lager deeltjesaantal (164 ± 30 en 45 ± 15) werd geïngeste door monocultuur kankercellen voor 500 nm en 1 µm PLGA, met een iets lager deeltjesaantal in de respectieve macrofagen (Fig. 8i). Het aantal deeltjes dat door enkele cellen wordt geïngeste, is in grote overeenstemming met literatuurgegevens; bijvoorbeeld werd een gemiddelde van 2500 goudnanodeeltjes gecoateerd met cetyltrimethylammoniumbromide gedeponeerd in epitheele cellen, terwijl PEG-gemodificeerde goudnanodeeltjes slechts enkele tientallen per cel hadden. In co-cultuursystemen was er onverwacht een lichte toename van 100 nm deeltjesaantal in kankercellen, ondanks een hogere toename van NP-internalisatie door macrofagen. Vergeleken met de opname-index in de enkelvoudige tot gemengde celcultuur, daalde deze ook ongeveer 25% voor 100 nm PLGA-deeltjes. De opname-indices daalden significant met ongeveer 2,5 en 3 vouwen reductie in het co-gekweekte systeem voor 500 nm en 1 µm PLGA, respectievelijk (Fig. 8i). In het algemeen werd gevonden dat het bestaan van macrofagen de opnamecapaciteit van kankercellen in grote mate beïnvloedt, met name voor grote deeltjes, wat ook in uitstekende overeenstemming is met de bovenstaande waarnemingen.

Inductie van celfusie door PLGA-nanodeeltjes

Uitgebreide wetenschappelijke bewijzen tonen aan dat de fusie van monocyten/macrofagen tot multinucleerde reuzencellen (MGC's) optreedt in een breed scala aan biologische processen. In het algemeen veroorzaakt de implantatie van biomaterialen in het lichaam een vreemde-lichaamreactie gekenmerkt door de fusie van macrofagen tot MGC's en fibrotische encapsulatie. Een breed scala aan humane en muriene primaire cellen zoals alveolaire macrofagen, splenische macrofagen, microglia, botmerg-gederiveerde macrofagen en bloedmonocyten, alsook cellijnen zoals RAW264.7 en UG3, werden ook vaak waargenomen om MGC's in vitro te vormen. Het is bekend dat macrofagen een fusogeen fenotype vormen wanneer ze niet in staat zijn om vreemde materialen via fagocytose op te nemen vanwege de grote grootte van deeltjes of implantaten. Tot nu toe is het onduidelijk of in vitro macrofaagcelfusie gerelateerd is aan de deeltjesgrootte in het bereik 100-1000 nm, dat gemakkelijk kan worden gefagocyteerd. Hier werd celfusie waargenomen in alle groepen door microscopisch onderzoek (Fig. 9). De cellulaire fusie werd alleen bevestigd wanneer meerdere kernen werden gevonden die hetzelfde cytoplasma deelden in zowel fluorescentieafbeeldingen als helder-veldafbeeldingen. Spontane vorming van reuzencellen door THP-1-cellen trad op in de controlegroep zonder deeltjesbehandeling (Fig. 9a), met een fusiepercentage van ongeveer 10% van de totale cellen (Fig. 9h), zoals gerapporteerd in de literatuur. Grootte-afhankelijke cellulaire fusie werd gevonden voor 100 en 500 nm PLGA-deeltjes, terwijl 1 µm PLGA geen significante toename van fusies in monocultuur induceerde. Dit kan te wijten zijn aan het kleine aantal 1 µm PLGA-deeltjes dat aan cellen wordt blootgesteld (ongeveer 60 deeltjes per cel bij een concentratie van 10 µg/mL). Toen de macrofagen co-gekweekt werden met kankercellen, namen de percentages MGC-vorming toe in alle groepen vergeleken met de corresponderende monocultuurgroepen. In het bijzonder was er een significante toename van cellulaire fusie voor 1 µm PLGA (19%) in de gemengde celcultuur. De meest uitgesproken toename in fusie trad op in co-gekweekte 500 nm PLGA-deeltjes, wat toegeschreven kan worden aan de grote grootte van deeltjes en voldoende deeltjesaantal geïngeste per cel.

De moleculaire machinerie betrokken bij macrofaagfusie is breed onderzocht, met substantiële vooruitgang. Bijvoorbeeld, de vorming van macrofaagfusie-receptoren CD47 en CD44 maakte samen de macrofaagfusie mogelijk, en de daaropvolgende differentiatie van reuzencellen, en miR-223-afgifte door een NP-vesikel maakte het mogelijk om dit te verzwakken. Daarom moet verder onderzoek zich richten op de bepaling van sleutelmoleculen die de deeltjes-geïnduceerde macrofaagfusie reguleren en de dominante receptoren die tot uiting komen in het reuzencelmembraan. Een ander belangrijk aspect is het lot van MGC's. Men neemt aan dat MGC's gevormd met deeltjes of stimuli vervolgens het proces van apoptose of necrose kunnen doormaken. Dit kan leiden tot de vrijgave van niet-verteerde deeltjes of andere grote materialen aan andere cellen in vitro of biologische weefsels in vivo, wat langdurige inflammatoire reacties of granulomen kan induceren. Aan de andere kant kan de macrofaagfusie zelf gunstig zijn voor NP-geneesmiddelafgifte, bijvoorbeeld in tumorweefsels kan de herafgifte van geneesmiddelen van macrofagen naar kankercellen een verhoogde tumor-dodende capaciteit vertegenwoordigen. Belangrijker nog, toekomstige nanogeneeskundestudies moeten adresseren hoe de toepassing van macrofaagfusie voor nanodrager-geneesmiddelafgifte kan worden benut voor verbeterde ziekte-diagnose en therapie. Dit is niet alleen omdat macrofagen een veelvuldig voorkomend type immuuncellen in het lichaam zijn met een uitstekende opnamecapaciteit van nanogeenmiddelen, maar ook omdat ze kunnen worden gebruikt in gerichte gendelivery voor herstel van beschadigde weefsels.

Conclusie

Voor zover we weten, rapporteert deze studie voor het eerst de competitieve cellulaire opname van PLGA-deeltjes met groottes variërend van 100 nm tot 1 µm in co-gekweekte UM-SCC-17A larynxkankercellen en THP-1 monocyten/macrofagen. De hier verzamelde gegevens bewijzen dat immuuncellen de deeltjesinternalisatie door kankercellen in vitro kunnen veranderen/verlagen, wat vergelijkbaar is met eerdere bevindingen in in vivo nanodrager-geneesmiddelafgiftestudies. Grootte-afhankelijke en celcultuur-gerelateerde macrofaagcelfusie veroorzaakt door PLGA-deeltjes is hier ook aangetoond. Toekomstige studies moeten het opnamemechanisme in co-gekweekte systemen onderzoeken en nieuwe benaderingen ontwerpen om een hogere opname-index voor larynxkankercellen in aanwezigheid van fagocyten te bereiken. Bovendien is een uitgebreide evaluatie van intracellulaire verkeersroutes en het lot van nanogeenmiddeldragers in co- of tri-gekweekte systemen in 3D, die de in vivo omstandigheden beter nabootsen, nodig voorafgaand aan de uitvoering van in vivo dierstudies en zelfs klinische studies.