Stabiele Koolstofdot-Frameworks met Superieure Antibacteriële Werking

Samenvatting

Koolstofdots (CDs) worden veel gebruikt als antimicrobiële middelen vanwege hun actieve oppervlak, maar sommige CDs lijden onder instabiliteit. Hierdoor kunnen toepassingen zoals antibacteriële activiteit onbetrouwbaar zijn voor langdurig gebruik. In deze studie synthetiseren we CDs met blauwe fluorescentie via een hydrothermaal proces. Vervolgens wordt polyethylenimine (PEI) toegepast voor de assemblage van CDs tot op CDs gebaseerde frameworks (CDFs). De CDFs vertoonden gedempte fluorescentie, maar toonden stabielere eigenschappen op basis van scanning-electronmicroscopie en zeta-potentiaalonderzoeken. Zowel CDs als CDFs tonen antibacteriële activiteit tegen Gram-negatieve Escherichia coli (E. coli) en Gram-positieve Staphylococcus aureus (S. aureus), maar CDFs presteerden beter. S. aureus kon volledig worden geïnhibeerd met een minimale inhibitieconcentratie (MIC) van 30 µg/mL. Dit toont aan dat CDFs zowel de stabiliteit als de antibacteriële activiteit vergroten, wat ze veelbelovender maakt voor praktische toepassingen.

Inleiding

Bacteriële infecties vormen een ernstige dreiging voor de menselijke gezondheid, en de ontwikkeling van effectieve middelen om bacteriën te bestrijden is in hoge mate gewenst. Verschillende antibiotica worden gebruikt voor de behandeling van bacteriële infecties, maar overmatig gebruik leidt tot bijwerkingen en medicamentenresistentie. Nanomaterialen zoals antimicrobiële polymeren, metalen nanomaterialen en koolstofnanomaterialen worden als alternatieven voor klassieke antibiotica onderzocht. Zo kunnen zowel resistentie- als toxiciteitsproblemen worden verlicht. Recentelijk worden CDs en nanoclusters (NCs) succesvol ingezet tegen bacteriële infecties vanwege hun biocompatibiliteit, activiteit en de gemakkelijke clearance door circulatie door hun ultra-kleine afmetingen. Onderzoekers ontdekten dat CDs een uitstekende vrije-radicaal-afvangende capaciteit vertonen, die sterker kan zijn dan veel traditionele anti-infectiemiddelen. Echter, sommige ultra-kleine antimicrobiële middelen lijden onder slechte stabiliteit door hun grote oxidatieve oppervlakte. Er is daarom een grote behoefte aan effectievere antibacteriële middelen voor langdurig gebruik.

Voor praktische toepassingen moeten antimicrobiële middelen voldoen aan drie criteria: (a) uitstekende stabiliteit die onveranderd blijft gedurende een bepaalde tijd in een omgevingsomgeving; (b) uitstekende biocompatibiliteit en lage toxiciteit; (c) hoge antibacteriële activiteit. Grotere nanomaterialen zijn doorgaans stabieler, maar kunnen een zwakkere antibacteriële activiteit vertonen door een kleiner actief oppervlak. Om de zwaktes van zowel kleine als grote nanomaterialen aan te pakken, rapporteert deze studie de assemblage van kleine CDs tot grote CDFs door simpelweg polyethylenimine (PEI) toe te voegen. De CDs smelten niet samen, maar behielden hun morfologie als bouwstenen. Hierdoor vertoonden de CDFs grotere afmetingen, maar toonden ze een uitstekende stabiliteit zonder de actieve eigenschappen van de CDs in te boeten. Bovendien bleken CDFs een versterkte antibacteriële activiteit te hebben tegen zowel Gram-negatieve E. coli als Gram-positieve S. aureus in vergelijking met CDs, wat hun breed-spectrum antibacteriële prestaties bevestigt, aangezien veel CDs alleen Gram-positieve bacteriën bestrijden. Daarnaast stimuleerden CDFs de proliferatie van PC12-cellen (een cellijn afkomstig van een feochromocytoma van de bijnierschors van de rat), wat hun potentieel voor zenuwhersteltoepassingen benadrukt. Dit werk suggereert dat de assemblage van kleine CDs tot grote CDFs niet alleen de stabiliteit verbetert, maar ook de antibacteriële activiteit versterkt.

Materialen en Methodes

Materialen en Instrumenten

Röntgenphoto-elektronspectroscopie (XPS) werd uitgevoerd met een ESCALAB250Xi-instrument. Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) werd gedaan met een JEM-2100-microscoop bij 200 kV. Fluorescentie werd gemeten met een F97-fluorescentiespectrometer. FDA/PI-kleuring van bacteriële cellen werd vastgelegd in tapping-modus met een Leica DFC450C-microscoop. Fluorescentielevensduur werd gemeten met een tijdgecorreleerde enkele-foton-tellingssysteem (TCSPC) met een Nanolog-spectrofluorometer (Horbia JY, Japan). UV-vis-spectra werden verkregen met een UV-1600-instrument. Bacteriële imaging werd waargenomen met een confocalemicroskoop (Olympus FLUOVIEW FV1000 c). Alle reagenties waren van analytische graad. Gedeioniseerd water werd doorheen de experimenten gebruikt. Cell Counting Kit-8 werd verkregen van Beyotime Biotechnology.

Bereiding van CDs en CDFs

L-cysteine (1,0 g) werd opgelost in 10,0 mL gedeioniseerd water en goed gemengd. De pH van de oplossing werd ingesteld op 9,0 met 1,0 M NaOH. De oplossing werd overgebracht naar een hydrothermale reactor en 24 uur verwarmd bij 160 °C. Na afkoeling tot kamertemperatuur werd de resulterende oplossing gedialyseerd met een dialysezak (MW 7000 afsnijwaarde) gedurende één dag. De verkregen CDs werden gebruikt voor verdere karakterisatie en experimenten. Voor de bereiding van CDFs werd 40 µL van 1% PEI toegevoegd aan 1 mL van de CDs. Het mengsel werd 1 uur in rust gelaten. Het product werd gezuiverd door dialyse volgens dezelfde methode als voor de CDs. Voor HR-TEM-karakterisatie werden de monsters geconcentreerd tot een klein volume, overgebracht op een silicagelkolom en geeluëerd met methanol en dichloormethaan om verder gezuiverde producten te verkrijgen.

Toxiciteitsevaluatie

PC12-cellen werden gezaaid in 96-puttenplaten gedurende 12 uur en vervolgens geïncludeerd met CDs en CDFs in verschillende concentraties. Het aantal levende cellen werd onderzocht met een Cell Counting Kit-8 assay (CCK-8). 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromide (MTT) (5 mg/mL in PBS) werd toegevoegd met 1/10 van het cultuurvolume, en de cellen werden teruggeplaatst in de incubator. Daarna werden de supernatanten verwijderd en 200 µL dimethylsulfoxide (DMSO) toegevoegd aan elke put. De kristallen werden opgelost door de platen 10 minuten te schudden. De absorbantie bij 490 nm werd gemeten met een Microreader (Varioskan LUX Multimode Reader). Lege controleputten werden bij alle absorbantiemetingen meegenomen.

Antibacteriële Experimenten

E. coli en S. aureus werden geïncludeerd in afwezigheid en aanwezigheid van CDs en CDFs bij 37 °C met 250 rpm schudden. De groei van de bacteriële cellen in Lysogeny-bouillon (LB)-cultuur werd gemeten met de Microreader bij 600 nm golflengte (OD600). LB-medium werd gebruikt als blanco-controle. De OD600 staat voor de celdichtheid, en de relatieve cellevensvatbaarheid werd berekend op basis van de vergelijking tussen de gekweekte bacteriële cellen in aanwezigheid van de materialen en de controlegroep (OD600 van de bacteriële cellen in afwezigheid van CDs of CDFs). Levende/dode bacteriën werden geëvalueerd met het FDA/PI-kleuringsprotocol.

Detectie van Reactieve Zuurstofsoorten (ROS)

Intracellulaire ROS-productie werd gemeten in bacteriële cellen voor en na behandeling met CDs en CDFs gedurende 12 uur, met een 2',7'-dichlorofluoresceïne diacetaat (DCFH-DA) sonde volgens de instructies. De fluorescentie werd gedetecteerd bij een emissiegolflengte van 525 nm met excitatie bij 488 nm.

Resultaten en Discussie

Karakterisatie van de Materialen

Grootteonderzoek

Figuur 2 toont de SEM van het poeder voor CDFs met relatief lagere (Fig. 2a0) en hogere vergroting (Fig. 2b0) na blootstelling aan de lucht gedurende enkele uren. De CDFs waren goed verdeeld en vertoonden een gemiddelde grootte van ca. 25 nm. CDs vertoonden monodisperse kleine afmetingen op basis van TEM- en AFM-studie (Aanvullend bestand 1: Figuur S1), maar deze kleine deeltjes toonden aggregatie na blootstelling aan lucht gedurende een bepaalde tijd (Aanvullend bestand 1: Figuur S2). CDFs behielden hun morfologie na blootstelling aan de omgevingsomgeving, wat aangeeft dat de verkregen CDFs veelbelovender zijn voor praktische toepassingen. CDFs werden verder gekarakteriseerd met TEM (Fig. 2b1), wat assemblage-structuren met kleine CDs als bouwstenen toonde. HR-TEM-analyse (Fig. 2b2) onthulde dat de bouwstenen van CDFs roosterfranjes vertoonden met een d-afstand van 0,21 nm, overeenkomend met het (100) roostervlak van grafit, vergelijkbaar met klassieke CDs. De assemblage-CDFs verliezen dus niet de kenmerken van CDs, wat de voordelen van zowel de grote frameworks als de kleine bouwstenen kan combineren.

Zeta-potentiaal

Zeta-potentiaalonderzoeken maatten de mate van elektrostatische afstoting tussen CDs en CDFs in het gedispergeerde systeem (Fig. 3). Het zeta-potentiaalpiek van CDs was niet goed gedefinieerd na blootstelling aan de omgevingsomgeving. Bovendien werden meerdere zeta-potentiaalpieken met grote afwijkingen verkregen (Tabel 1), wat wijst op instabiliteit en slechte reproduceerbaarheid van CDs. Het zeta-potentiaalpiek voor CDFs lag in een relatief stabiel bereik, met veel kleinere afwijkingen over drie metingen, wat aantoont dat CDFs stabieler zijn en de gedispergeerde systemen een hogere zuiverheid hebben.

Fluorescentie-eigenschappen

Fluorescentie-emissiespectra werden gebruikt om het assemblageproces van CDs naar CDFs te monitoren (Fig. 4). Bij toename van PEI nam de fluorescentie-emissie bij 350 nm geleidelijk af (Fig. 4a). Er werd geen significante verschuiving in fluorescentiespectra waargenomen, wat aangeeft dat geen aggregatie plaatsvond. De assemblagestructuur van CDFs verandert de totale grootte van CDs, wat de fluorescentie beïnvloedt. Daarnaast dempen naburige CDs elkaars fluorescentie. De oppervlaktechemie speelt een belangrijke rol in fluorescentie-eigenschappen. Stikstof- en zwavelatomen op het oppervlak van CDs kunnen energievallen creëren. De heldere fluorescentie van CDs wordt toegeschreven aan het defecte oppervlak met veel carbonyl- en aminogroepen. Na functionalisatie met PEI werd het oppervlak van CDFs gedomineerd door aminogroepen, wat samen met de toename in grootte de fluorescentie dempte. De vergelijking van het fluorescentiegedrag van CDs en CDFs werd verder onderzocht met TCSPC om de fotogegenereerde ladingsrecombinatiepaden te begrijpen (Fig. 4b). Emissie werd gemonitord bij 430 nm. De fluorescentieverval vereiste een twee-componenten exponentiële fit. De tijdsconstanten en relatieve amplitudes zijn samengevat in Tabel S1. De levensduur van de dominante component voor CDs was 2,45 ns, terwijl de andere component 7,47 ns was. Voor CDFs was de dominante component 1,98 ns en de andere 7,30 ns. Er werd geen significante levensduurverandering waargenomen, wat aangeeft dat de eigenschappen van CDs niet wezenlijk veranderen tijdens assemblage tot CDFs.

Toxiciteit

Voor de veiligheidsevaluatie werd de toxiciteit van CDs en CDFs tegen PC12-cellen onderzocht. MTT-assays werden uitgevoerd om de invloed op de cellevensvatbaarheid te bepalen (Fig. 5). Na incubatie van PC12 met CDs en CDFs werd de cellevensvatbaarheid binnen 24 uur nauwelijks beïnvloed. Interessant genoeg stimuleerden beide koolstofmaterialen de proliferatie van PC12-cellen, wat een belangrijke rol speelt in de therapie van zenuwschade. Deze resultaten tonen de lage toxiciteit van de materialen en hun potentieel voor zenuwbescherming met PC12-cellen.

Antibacteriële Onderzoekingen

De antibacteriële activiteit van CDs en CDFs werd initieel geëvalueerd door de bacteriële dichtheid te meten in aanwezigheid van deze middelen bij 600 nm. Figuur 6 toont een substantiële antibacteriële werking van zowel CDs als CDFs tegen zowel S. aureus als E. coli. Bijna 0% levensvatbaarheid werd waargenomen voor S. aureus bij meer dan 30 µg/mL CDFs. Ook E. coli werd gedesinfecteerd door zowel CDs als CDFs. CDs vertoonden meerdere ladingen (Fig. 3a), terwijl CDFs onbetekenende ladingen hadden (Fig. 3b), wat de bacteriële adhesie onder zwakke afstoting kan onderdrukken en de interactie met het bacteriële oppervlak vergemakkelijkt. In vergelijking tonen CDFs een hogere antibacteriële activiteit, aangezien een groter deel van de cellen wordt gedood bij concentraties boven 6 µg/mL. De versterkte antibacteriële activiteit van CDFs wordt waarschijnlijk toegeschreven aan het synergistische effect van CDs als bouwstenen en de stabielere oppervlakteladingen. Om het antibacteriële mechanisme dieper te begrijpen, werd ROS gemeten dat non-fluorescerend DCFH kan oxideren tot fluorescerend DCF (Fig. 6c). Beide koolstofmaterialen induceerden geen significante ROS-productie na behandeling van E. coli. Echter, CDFs versterkten de intracellulaire ROS aanzienlijk tijdens interactie met S. aureus. Aangezien ROS bacterieel DNA, RNA en eiwitten kan beschadigen, vergemakkelijkt de verhoogde waarde de desinfectie. Verder werd ROS gestimuleerd met H₂O₂. Opvallend was dat ROS-productie dramatoos werd verhoogd vergeleken met alleen H₂O₂-behandeling, met de hoogste versterking voor CDFs. Dit duidt erop dat de combinatie van H₂O₂ met deze koolstofmaterialen de antibacteriële activiteit kan verbeteren, met name voor CDFs.

Sommige CDs werden eerder gerapporteerd voor desinfectie van S. aureus, vermeld in Tabel 2 ter vergelijking. De huidige CDFs tonen een competitieve MIC. Daarnaast, in plaats van alleen de cellevensvatbaarheid te verlagen, stimuleren CDFs de proliferatie van PC12-cellen, wat hun veelzijdigheid bij de behandeling van bacteriële infecties benadrukt.

De integriteit van het bacteriële membraan na behandeling met CDs en CDFs werd onderzocht met levend/dood-kleuring (Fig. 7). Groene FDA-kleuring toont alleen levende cellen, terwijl rode PI-kleuring specifiek dode bacteriën met beschadigde membranen kleurt; levende cellen met intacte membranen blijven ongekleurd. Zichtbare rode fluorescentie werd waargenomen in CDs-behandelde monsters, en een veel hogere dichtheid dode cellen in CDFs-behandelde monsters.

Op basis van de bovenstaande vergelijkingen concluderen we dat CDFs veelbelovend zijn voor het doden van zowel Gram-positieve als Gram-negatieve bacteriële cellen. Daarom werden E. coli en S. aureus voor en na behandeling met 30 µg/mL CDFs gekarakteriseerd met SEM (Fig. 8). Onbehandelde bacteriën vertoonden een regelmatig oppervlak. Na incubatie met CDFs veranderde de morfologie van zowel S. aureus (Fig. 8b) als E. coli (Fig. 8d) drastisch. De membranen van veel bacteriële cellen braken. Kleine materialen werden waargenomen op het oppervlak van de bacteriën, afkomstig van gehechte CDFs. Dit wijst erop dat CDFs bacteriële cellen desinfecteren door de membranen te beschadigen.

Omdat zowel CDs als CDFs fluorescent zijn, werd 6 µg/mL van de middelen onderzocht voor bacteriële imaging tijdens desinfectie. De imaging van S. aureus werd onderzocht en getoond in Fig. 9. Zowel CDs als CDFs konden gebruikt worden voor imaging van S. aureus. CDFs toonden echter een hogere opname-efficiëntie, aangezien de bacteriële cellen in heldere en donkere velden bijna volledig overlapten. Bij CDs werd slechts een deel van de S. aureus-cellen gekleurd. Bovendien waren de bacteriële celdichtheden lager na behandeling met CDFs, wat aantoont dat CDFs S. aureus efficiënter desinfecteerden dan CDs bij dezelfde doseringen. Deze resultaten tonen ook aan dat CDFs als alternatieve kleurstoffen voor imaging van diverse bacteriële cellen kunnen dienen.

Conclusies

De assemblage van CDs tot CDFs resulteert in robuustere antibacteriële activiteit. Geconcludeerd wordt dat de assemblagestructuur stabielere eigenschappen oplevert, maar de antibacteriële activiteit van CDs versterkt. Dit werk biedt een nieuwe aanpak voor de assemblage van kleine nanomaterialen tot frameworks voor praktischere toepassingen.

Beschikbaarheid van Data en Materialen

Alle data die de conclusies van dit artikel ondersteunen, zijn in het artikel opgenomen.

Afkortingen

CDs:

Koolstofdots

CDFs:

Op koolstofdots gebaseerde frameworks

PEI:

Polyethylenimine

E. coli:

Escherichia coli

S. aureus:

Staphylococcus aureus

TEM:

Transmissie-elektronenmicroscoop

HR-TEM:

Hoge-resolutie TEM

XPS:

Röntgenphoto-elektronspectroscopie

MIC:

Minimale inhibitieconcentratie

NCs:

Nanoclusters

TCSPC:

Tijdgecorreleerde enkele-foton-telling

CCK-8:

Cel-telling Kit-8 assay

ROS:

Reactieve zuurstofsoorten

SEM:

Scanning-elektronenmicroscoop

ZP:

Zeta-potentiaal