Lithocholzuur-gefunctionaliseerde goudnanodeeltjes induceren selectieve apoptose in leverkankercellen

Samenvatting

Goudnanodeeltjes (AuNPs) zijn bekend om hun biocompatibiliteit, optische eigenschappen en potentieel voor geneesmiddelverabreding. In deze studie ontwikkelden we AuNPs met een polyethyleenglycol (PEG) spacer en lithocholzuur (LCA) ligand via carboxylaatkoppeling, resulterend in AuNP@MPA-PEG-LCA. Cytotoxiciteitstoetsen toonden aan dat AuNP@MPA-PEG-LCA een duidelijke selectiviteit vertoonde, met een sterke remming van meerdere hepatocellulaire carcinoom-cellijnen (HepG2, SMMC-7721) terwijl normale hepatocyten (QSG-7701) en borstkankercellen (MCF-7) gespaard bleven. Apoptose-inductie werd bevestigd door kerncondensatie (Hoechst 33342), annexine V-FITC binding, verlies van mitochondriale membraanpotentiaal (MMP) (JC-1) en acridine orange/ethidiumbromide (AO/EB) kleuring. De nanodeeltjes induceerden accumulatie van reactieve zuurstofvormen (ROS), wat leidde tot mitochondriale dysfunctie en geprogrammeerde celdood. Deze resultaten tonen aan dat AuNP@MPA-PEG-LCA een veelbelovende, gerichte nanotherapeutische benadering is voor leverkanker.

Achtergrond

Goudnanodeeltjes bezitten unieke optische resonantie, chemische stabiliteit en een grote oppervlakte die ze aantrekkelijk maken voor biomedische toepassingen, waaronder geneesmiddelverabreding, imaging en fotothermische therapie. Hun sferische geometrie vergemakkelijkt efficiënte cellulaire opname en minimaliseert off-target effecten. Functionalisatie van AuNPs met targeterende liganden of polymeren verbetert hun therapeutische index verder, met name in de oncologie.

Lithocholzuur (LCA), een secundaire galzuur, is gerapporteerd om krachtige antitumoractiviteit tegen leverkanker uit te oefenen via apoptose. Als een natureel voorkomend molecuul kan LCA dienen als ligand om AuNPs naar leverweefsel te leiden, de oplosbaarheid te verbeteren en intracellulaire signaleringsroutes te modelleren.

De combinatie van de biocompatibiliteit van AuNPs met de tumorremmende eigenschappen van LCA kan een selectief anticancermiddel opleveren dat ROS-gemedieerde mitochondriale pathways benut om apoptose in hepatocellulaire carcinoomcellen te triggeren.

Methoden

Materialen

Alle reagentia werden gekocht bij Sigma-Aldrich, tenzij anders aangegeven. Celcultuurmiddelen (RPMI-1640, FBS) werden verkregen van Invitrogen. Humane hepatocellulaire carcinoom-cellijnen (HepG2, SMMC-7721), normale hepatocyten (QSG-7701) en borstkankercellen (MCF-7) werden afkomstig van het Shanghai Institute for Biological Sciences.

Synthese van AuNP@MPA

Citraat-gekapselde AuNPs (gemiddelde diameter 4,0 ± 0,5 nm) werden gesynthetiseerd volgens de Turkevich-methode met HAuCl₄ en NaBH₄. De resulterende nanodeeltjes werden vervolgens gekapt met 3-mercaptopropionzuur (MPA) bij pH 11 om carboxylgroepen voor verdere conjugatie te voorzien.

Conjugatie met PEG

AuNP@MPA (0,0875 mmol) werd geactiveerd met NHS (0,0875 mmol) en EDC (0,035 mmol) in 50 mM MES-buffer, gevolgd door toevoeging van NH₂-PEG₁₀₀₀-NH₂ (0,045 mmol). Na 24 uur bij 25 °C werden de PEGyleerde nanodeeltjes (AuNP@MPA-PEG) geïsoleerd door centrifugatie.

Hechting van lithocholzuur

AuNP@MPA-PEG werd gemengd met LCA (0,045 mmol) in anhydre DMF en 24 uur gerold bij 25 °C. Het eindproduct, AuNP@MPA-PEG-LCA, werd gezuiverd door herhaalde centrifugatie.

Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM)

Deeltjesmorfologie en -grootte werden onderzocht op een JEOL JEM-200CX TEM werkend op 200 kV. Nanodeeltjessuspensies werden op 300 mesh koperen grids gedroogd.

Cytotoxiciteitstoetsen

Cellevensvatbaarheid na 48 uur blootstelling aan AuNPs (0,2–1,0 mg mL⁻¹) werd gemeten met de MTT-toets. Absorptie bij 570 nm werd vastgelegd op een Tecan Infinite M200 platereader.

Apoptotische morfologie (Hoechst 33342)

HepG2-cellen werden behandeld met 0,5 mg mL⁻¹ AuNP@MPA-PEG-LCA gedurende 24 en 48 uur, vervolgens gekleurd met 10 µg mL⁻¹ Hoechst 33342 gedurende 30 min. Kernmorfologie werd gebeeld met een Leica-SP8 confocalemicroskoop.

Vroegere apoptose (Annexine V-FITC)

Na 6 uur behandeling met 0,5 mg mL⁻¹ AuNP@MPA-PEG-LCA werden HepG2-cellen gekleurd met annexine V-FITC en geanalyseerd door stroomcytometrie (FACSCalibur, BD). Confocale beelden werden ook verkregen.

Mitochondriale membraanpotentiaal (MMP)

JC-1 kleurstof (10 µg mL⁻¹) werd gebruikt om MMP-veranderingen in HepG2-cellen te beoordelen die behandeld waren met AuNP@MPA-PEG-LCA (6 uur). Zowel stroomcytometrie als confocalemicrocopie werden toegepast.

Reactieve zuurstofvormen (ROS)

Intracellulaire ROS werden gekwantificeerd met H₂DCF-DA (10 µM) na 6 uur blootstelling aan 0,5 mg mL⁻¹ AuNP@MPA-PEG-LCA. Fluorescentie werd gemeten door stroomcytometrie en confocalemicrocopie.

Resultaten en discussie

Nanodeeltjeskarakterisering

De AuNP@MPA-PEG-LCA behield een sferische vorm met een gemiddelde diameter van 16,0 ± 1,2 nm, bevestigd door TEM. De PEG- en LCA-lagen droegen bij aan de verhoogde hydrodynamische grootte ten opzichte van de kern AuNP@MPA (4,0 nm). Deze afmetingen zijn ideaal voor het verbeterde permeabiliteits- en retentie-effect (EPR) in tumorweefsel.

Selectieve cytotoxiciteit

MTT-toetsen toonden verwaarloosbare cytotoxiciteit van AuNP@MPA over alle cellijnen. Integen, AuNP@MPA-PEG-LCA verlaagde dose-afhankelijk de levensvatbaarheid van HepG2- en SMMC-7721-cellen, met IC₅₀-waarden onder 0,6 mg mL⁻¹, terwijl QSG-7701- en MCF-7-cellen minimaal beïnvloed werden. Dit selectieve profiel benadrukt het targeterend vermogen dat wordt verleend door LCA.

Apoptotische morfologie

Hoechst-kleuring onthulde progressieve kerncondensatie, fragmentatie en chromatine-marginering in HepG2-cellen behandeld met AuNP@MPA-PEG-LCA over 48 uur, wat wijst op late apoptose. Controlecellen en AuNP@MPA-behandelde cellen behielden een uniforme kernmorfologie.

Annexine V-FITC bevestiging

Annexine V-kleuring toonde een duidelijke translocatie van fosfatidylserine naar het uiterste blad van de plasmamembraan in met AuNP@MPA-PEG-LCA behandelde cellen. Stroomcytometrie kwantificeerde een apoptosegraad van 38,45% versus 8,16% in controles, wat vroege apoptose-inductie bevestigt.

Mitochondriale depolarisatie

JC-1 analyse onthulde een verlies van rode aggregaatfluorescentie en een toename van groen monomeer signaal, wat MMP-instorting in behandelde cellen aangeeft. Stroomcytometrie bevestigde een significante reductie in de rood/groen ratio, wat mitochondriale dysfunctie als een downstream-gebeurtenis van apoptose bevestigt.

ROS-generatie

H₂DCF-DA kleuring toonde een duidelijke toename van groene fluorescentie in met AuNP@MPA-PEG-LCA behandelde HepG2-cellen, wat verhoogde ROS-productie weerspiegelt. Stroomcytometrische kwantificering bevestigde de trend, wat suggereert dat oxidatieve stress voorafgaat aan mitochondriale depolarisatie en apoptose.

Conclusies

We synthetiseerden met succes AuNP@MPA-PEG-LCA nanodeeltjes (~16 nm) die selectief de groei van hepatocellulaire carcinoomcellen remmen door apoptose te induceren. Uitgebreide toetsen - kernmorfologie, annexine V binding, JC-1 MMP-verlies, en ROS-stijging - bevestigen dat de therapeutische werking gemedieerd wordt door ROS-geïnduceerde mitochondriale dysfunctie. Deze resultaten positioneren AuNP@MPA-PEG-LCA als een veelbelovende, gerichte nanogeneesmiddel voor de behandeling van leverkanker.

Afkortingen

AuNPs:

Goudnanodeeltjes

DMF:

Dimetylformamide

EDC:

1-(3-dimetylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride

FBS:

Fetaal kalverseerum

H₂DCF-DA:

2′,7′-dichloorfluoresceïne diacetaat

HepG2:

Humane hepatocellulaire levercarcinoomcellen

JC-1:

5,5′,6,6′-tetrachloor-1,1′,3,3′-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodide

LCA:

Lithocholzuur

MCF-7:

Humane borstkankercellen

MES:

4-morfolineethaanzuur

MMP:

Mitochondriale membraanpotentiaal

MPA:

3-mercaptopropionzuur

MTT:

3-(4,5-dimetyl-2-thiazolyl)-2,5-difenyltetrazoliumbromide

NHS:

N-hydroxysuccinimide

PEG:

Polyethyleenglycol

PS:

Fosfatidylserine

QSG-7701:

Humane normale hepatocytencellen

ROS:

Reactieve zuurstofvormen

SMMC-7721:

Humane hepatocellulaire levercarcinoomcellen

TEM:

Transmissie-elektronenmicroscopie