Effecten van 15-nm goud-nanopartikels op proliferatie, apoptose en spheroide-vorming in HT29 darmkanker en SPEV embryonale niercellen

Samenvatting

Celcultuur-modellen bieden een betrouwbaar platform om de potentiële toxiciteit van nanomaterialen te beoordelen en hun mechanistische impact op kankerbiologie te ontrafelen. Hier evalueren we hoe 15-nm citraat-gestabiliseerde goud-nanopartikels (AuNPs) twee epitheliale cellijnen van verschillende oorsprong beïnvloeden: de continue varkens-embryonale nierlijn SPEV en de humane colorectal-carcinoomlijn HT29. Blootstelling aan AuNP-concentraties van 1 tot 12 µg mL⁁¹ liet ons celadhesie, proliferatie, apoptose/necrose en de capaciteit om multicellulaire spheroiden te vormen monitoren. We vonden dat 6–12 µg mL⁻¹ AuNPs de celproliferatie significant verminderden en vroege en late apoptotische/necrotische populaties in beide lijnen verhoogden. Integen, lage AuNP-doses (1–3 µg mL⁻¹) stimuleerden spheroide-vorming, terwijl hogere doses cytotoxische en anti-cohesieve effecten uitoefenden in suspensiecultuur. Deze resultaten benadrukken de dosis-afhankelijke dubbele rol van AuNPs en steunen hun voortgezette verkenning als gerichte anticanker-strategie.

Achtergrond

Goud-nanopartikels (AuNPs) worden gewaardeerd voor hun biocompatibiliteit, optische eigenschappen en opkomend therapeutisch potentieel over een spectrum van maligniteiten, inclusief borst-, lever-, maag-, darm- en longkanker. De unieke fysico-chemische kenmerken van AuNPs – grootte, vorm, oppervlaktelading en concentratie – regelen hun cellulaire opname, distributie en biologische effecten. Terwijl veel studies zich richten op de anticanker-efficiëntie van AuNPs, blijft uitgebreide toxiciteitsprofielering in klinisch relevante modellen essentieel voor veilige vertaling.

Gerichte aflevering van AuNPs aan tumorweefsel blijft een uitdaging; differentiele opname-snelheden zijn gerapporteerd onder epitheliale cellen van diverse oorsprong. Variaties in membraamsamenstelling, glycoproteïne-expressie en endocytose-capaciteit liggen waarschijnlijk ten grondslag aan deze verschillen, wat de noodzaak benadrukt voor vergelijkende studies in normale en maligne epitheliale lijnen.

Celcultuur-assays bieden een gecontroleerde omgeving om de cellulaire responsen op AuNPs te ontrafelen, wat zowel veiligheidsbeoordelingen als therapeutische optimalisatie informeert. In deze studie vergeleken we de effecten van AuNPs op een normaal-achtige embryonale nierlijn (SPEV) en een colorectal-carcinoomlijn (HT29) met adhesie, proliferatie, apoptose/necrose en spheroide-vorming als readouts.

Methoden

Cultuur van SPEV-cellen

SPEV-cellen werden onderhouden in DMEM (Sigma, VS) aangevuld met 5% FCS (HyClone, VS), penicilline/streptomycine (PAA, Oostenrijk) en amphotericine B (5 µg mL⁻¹). Cellen wurden gezaaid bij 0,5–2 × 10⁴ cellen cm⁻² en gecultiveerd in 5% CO₂ bij 95% vochtigheid. Medium werd elke 48 uur ververst, en passages werden uitgevoerd bij bereiken van confluentie, met behoud van de monolagen-morfologie over passages.

Cultuur van HT29-cellen

HT29-cellen werden gekweekt in RPMI-1640 (Sigma, VS) met 10% FCS, 2 mM L-glutamine en 40 mg mL⁻¹ gentamicine (Sigma, VS). De werkdichtheid was 0,5–4 × 10⁴ cellen cm⁻². Cellen werden verkregen van de Bank van Cellijnen bij het RE Kavetsky Instituut voor Experimentele Pathologie, Oncologie en Radiobiologie, NAS van Oekraïne.

Manipulatie met AuNPs

AuNPs werden gesynthetiseerd via de citraatreductiemethode en geleverd door het Instituut voor Biochemie en Fysiologie van Planten en Micro-organismen, Russische Academie van Wetenschappen. De deeltjes hadden een gemiddelde diameter van 15 nm, met een voorraadconcentratie van 57 µg mL⁻¹. Donker-veld elektronenmicroscopie en extinctiespectra bevestigden de grootteverdeling (Fig. 1). Cellen werden behandeld met 1, 3, 6 of 12 µg mL⁻¹ AuNPs gedurende 24–48 uur; onbehandelde culturen dienden als controles.

Adhesie- en Proliferatie-assays

Adhesie werd gekwantificeerd door afgeplatte cellen te tellen na 30, 60, 120, 180 en 1440 min na zaaien, met een omgekeerde microscopie. Proliferatie over 1–4 dagen werd beoordeeld door trypsine-EDTA losmaking en tellen in een Goryaev-kamer. Data werden uitgedrukt als gemiddelde ± SE.

Apoptose/Necrose Beoordeling

Na 4 dagen AuNP-blootstelling werden cellen gekleurd met Annexine-V en 7-AAD en geanalyseerd door flowcytometrie (FACS Calibur, BD). Resultaten werden verwerkt met WinMDI v2.8.

Multicellulaire Spheroide-vorming

Om spheroiden te genereren, werden 5 × 10⁴ cellen cm⁻² gezaaid in 24-putplaten bedekt met 1% agar en gecultiveerd in 0,24% carboxymethyl-cellulose (CMC) met 80 toer/min rotatie. Spheroiden werden 24 uur gevormd, daarna 48 uur extra onderhouden in aanwezigheid van AuNPs. Spheroide-grootte en -aantal werden gemeten door donker-veld microscopie en geanalyseerd met Axio Vision 4.7, volume berekend via V = 0,4 × a × b² (a, b = diameters). Aggregaten werden gegroepeerd op volume (1 × 10⁻⁴–1 × 10⁻² mm³) om mediaan volumes en aantallen te bepalen.

Statistische Analyse

Data werden geanalyseerd met eenrichtingsvariantie-analyse (ANOVA) en Student's t-toets (Statistica 8). Significantie was gesteld op p ≤ 0,05, gepresenteerd als gemiddelde ± SE.

Resultaten

Adhesie van SPEV- en HT29-cellen

Figuur 2 illustreert de impact van AuNPs op SPEV-adhesie. Na 1 uur verlaagden 1, 3 en 6 µg mL⁻¹ AuNPs de gehechte cel-aantallen ten opzichte van controle, met 12 µg mL⁻¹ een 1,8-voudige afname die 24 uur aanhield. HT29-cellen toonden een vergelijkbare trend: lage concentraties hadden verwaarloosbare effecten, terwijl 6 en 12 µg mL⁻¹ adhesie verlaagden met 1,16- en 1,28-voud respectievelijk (Fig. 3).

Proliferatie van SPEV- en HT29-cellen

Figuur 4 toont dat 1–6 µg mL⁻¹ AuNPs de SPEV-proliferatie niet veranderden tijdens dagen 2–4, terwijl 12 µg mL⁻¹ cel-aantallen verlaagde tot 1,5-voud (Fig. 4). HT29-proliferatie bleef onveranderd tot dag 3; op dag 4 verlaagden 6 en 12 µg mL⁻¹ cel-aantallen met 1,33- en 1,44-voud respectievelijk (Fig. 5).

Apoptose/Necrose Inductie

Lage AuNP-doses (1–3 µg mL⁻¹) veranderden Annexine-V/7-AAD-profielen niet significant in beide lijnen (Tabellen 1–2). Bij 6–12 µg mL⁻¹ toonden zowel SPEV als HT29 toegenomen vroege en late apoptotische/necrotische populaties. Voor SPEV verhoogde 12 µg mL⁻¹ Annexine-V⁺/7-AAD⁺ cellen met 7,8% (p ≤ 0,05); voor HT29 verhoogden 6 µg mL⁻¹ en 12 µg mL⁻¹ deze fractie met 3,2% en 4,8% respectievelijk.

Spheroide-vorming

Figuur 6 en 7 laten zien hoe AuNPs spheroide-aantal en -volume modelleren. Controle HT29-spheroiden gemiddeld 5,19 × 10⁻³ mm³, terwijl SPEV-spheroiden gemiddeld 0,79 × 10⁻⁵ mm³. 1–3 µg mL⁻¹ AuNPs versterkten SPEV-spheroide-volume met 9,7- en 7,4-voud, en HT29-volume met 1,4- en 1,2-voud. Verhoging van AuNP-concentratie tot 12 µg mL⁻¹ verlaagde spheroide-volume in beide lijnen (HT29: 7,18 → 4,24 × 10⁻³ mm³; SPEV: 7,69 → 4,58 × 10⁻⁵ mm³) terwijl het aantal HT29-spheroiden steeg van 3 naar 10 per veld en SPEV-spheroiden daalde van 32 naar 19.

Discussie

Onze data bevestigen een dosis-afhankelijk cytotoxisch profiel van 15-nm AuNPs in zowel SPEV- als HT29-cellen. Concentraties van 6–12 µg mL⁻¹ remden proliferatie, verhoogden apoptose/necrose en stoorden celcohesie in suspensie, zoals bewijs door gewijzigde spheroide-grootte en -aantal. De verhoogde gevoeligheid van HT29 (6 µg mL⁻¹) ten opzichte van SPEV (12 µg mL⁻¹) stemt overeen met eerdere rapporten over differentiele opname en cytoskeletale verstoring door AuNPs.

Mechanistisch kunnen AuNPs interfereren met focale adhesie-complexen, actine-dynamica modelleren en mitochondriale oxidatieve stress triggeren – pathways die culmineren in celdelingstilstand en geprogrammeerde celdood. Het waargenomen anti-cohesieve effect bij hogere doses reflecteert waarschijnlijk verstoring van cel-celjuncties, wat leidt tot verhoogde spheroide-fragmentatie.

Hoewel in-vitro bevindingen veelbelovend zijn, is in-vivo validatie essentieel om therapeutische efficiëntie en veiligheid te bevestigen. Niettemin biedt onze studie een rigoureuze benchmark voor het ontwerpen van AuNP-gebaseerde anticanker-strategieën die hun dubbele capaciteit benutten om tumorgroei te remmen en cellulaire micro-omgevingen te modelleren.

Conclusies

15-nm AuNPs vertonen duidelijke, concentratie-afhankelijke effecten op zowel normaal-achtige SPEV- als maligne HT29-cellen: verminderde proliferatie, verhoogde apoptose/necrose en gewijzigde spheroide-dynamiek. Lage doses (1–3 µg mL⁻¹) bevorderen spheroide-vorming, terwijl hogere doses (6–12 µg mL⁻¹) cytotoxische en anti-cohesieve acties uitoefenen. Deze bevindingen steunen verder onderzoek naar AuNPs als gerichte anticanker-modaliteit, met aandacht voor dosis-optimalisatie voor maximaal therapeutisch voordeel en minimaal off-target toxiciteit.