Vergelijking tussen foliumzuur en op gH625 peptide gebaseerde functionalisering van Fe3O4 magnetische nanodeeltjes voor verbeterde celinternalisatie

Resultaten en discussie

Synthese en karakterisering van MNP's

De algemene strategie die is geïmplementeerd om gH625@MNP's en PEG,FA@MNP's van Fe₃ voor te bereiden O₄ nanodeeltjes, verkregen door co-precipitatie, omvat twee stappen zoals geïllustreerd in Fig. 1. De eerste stap, die hetzelfde is voor beide klassen nanodeeltjes, is gebaseerd op de MNP-functionalisatie met een fosfonzuur dat een aminogroep draagt ​​(NH₂ -VADER). In de tweede stap, de NH₂ -PA-voorgefunctionaliseerde MNP's (NH₂ @MNP's) worden verder geconjugeerd met specifieke functionele moleculen via NHS-koppelingsreacties. In het bijzonder de N -hydroxysuccinimide-geactiveerde vorm van gH625 gelabeld met NBD werd gebruikt voor de bereiding van gH625@MNP's, en N -hydroxysuccinimide geactiveerde vormen van PEG, FA en Rhod werden gebruikt om PEG,FA@MNP's te verkrijgen. Merk op dat zowel gH625@MNP's als PEG,FA@MNP's zijn gelabeld met luminescente sondes (d.w.z. respectievelijk NBD en Rhod) om confocale laser scanning microscopie studies uit te voeren.

Reactie schema. Reactiestappen voor de bereiding van gefunctionaliseerde MNP's

De röntgendiffractometrische (XRD) karakterisering van kale MNP's verkregen na de co-precipitatiestap is vergelijkbaar met die gerapporteerd in onze eerdere artikelen [34, 35]. In het kort toont een typisch patroon (Fig. 2a) vier diffractiepieken (2θ = 30,16 °, 35,48 °, 43,10 ° en 57,04 °) wat consistent is met de aanwezigheid van magnetiet, maghemiet of een tussenliggende samenstelling tussen de twee fasen. De roosterconstante, a , waarvan werd gevonden dat het 8,389 (4) Å was in goede overeenstemming met de roosterparameter van bulkmagnetiet (8,396 ), evenals de gemiddelde kristalgrootte van 11,2, bepaald met behulp van de Debye-Scherrer-vergelijking, zijn vergelijkbaar met de waarden eerder gemeld [34, 35].

Typische XRD- en XPS-spectra van MNP's. XRD-patroon van a) kale MNP's en hoge resolutie Fe 2p_3/2 XPS spectrale regio's van b) kale MNP's en c) NH₂ @MNP's

Merk op dat aangezien de kristalstructuur van Fe₃ O₄ magnetiet lijkt erg op dat van γ-Fe₂ O₃ maghemiet, is het erg moeilijk om de twee fasen te onderscheiden met XRD. Om deze reden werd röntgenfoto-elektronspectroscopie (XPS) gebruikt om de MNP's verder te analyseren. Afbeelding 2b toont Fe 2p_3/2 hoge resolutie XPS-spectra van kale MNP's. Het zwaartepunt van de band, waargenomen bij 710,9 eV, komt overeen met de Fe 2p_3/2 hoogtepunt. Deze waarde is lager dan die gerapporteerd voor Fe ³⁺ ofwel in octaëdrische gaten van α-Fe₂ O₃ (711.6 eV) [36, 37] of in gemengde tetraëdrische en octaëdrische gaten van γ-Fe₂ O₃ (711.4 eV), en het is consistent met de gemengde oxidatietoestand van Fe in Fe₃ O₄ [37, 38].

Ten slotte wordt een gedetailleerde magnetische karakterisering van vergelijkbare MNP's gerapporteerd in onze eerdere artikelen [34, 35].

Het functionaliseringsproces werd geëvalueerd door FT-IR en XPS. Na functionalisering met fosfonische monolagen, werd de Fe 2p_3/2 band (Fig. 2c) laat geen relevante wijzigingen zien, wat bevestigt dat de Fe₃ O₄ fase blijft behouden. Er is echter een kleine verschuiving (0,4 eV) van de Fe 2p_3/2 zwaartepunt naar lagere bindingsenergie (B.E) werd waargenomen, wat geassocieerd was met de verankering van de fosfonmonolaag. Soortgelijke verschuivingen werden in feite waargenomen in fosfaatadsorptie van verschillende ijzeroxiden [39] en kunnen worden toegeschreven aan enige ladingsoverdracht van adsorbaat naar Fe-atomen. De Fe 2p_3/2 positie van 710,5 eV bleef behouden na alle functionaliseringsstappen voor de verankering van PEG en FA.

Afbeelding 3 geeft de vergelijking weer van P2p, N1s en C 1s spectrale regio's van NH₂ respectievelijk @MNP's, PEG,FA@MNP's en gH625@MNP's. De P2p-piekpositie (133,2 eV) van NH₂ @MNP's wordt typisch geassocieerd met de aanwezigheid van het fosfonzuur dat op een tweetandige manier aan het oppervlak is verankerd [40,41,42,43]. De P2p-bandpositie in de spectra van gH625@MNP's en PEG,FA@MNP's is dezelfde als die waargenomen in NH₂ @MNP's spectrum, waardoor wordt onthuld dat de fosfonmoleculen niet worden verwijderd tijdens de koppelingsreacties voor de peptide- en foliumzuurimmobilisatie.

XPS-karakterisering van gefunctionaliseerde MNP's. Hoge resolutie P 2p, C 1s en N 1s XPS spectrale gebieden van a) NH₂ @MNP's, b) PEG,FA@MNP's en c) gH625@MNP's

De vorm en de piekpositie van N1s-spectra van NH₂ @MNP's komen overeen met de aanwezigheid van de verankerde NH₂ -VADER. De band bestaat uit twee verschillende componenten:de eerste bij 399,9 eV is geassocieerd met de -NH-groepen van het verankerde aminopropylfosfaat, en de tweede component gecentreerd bij 401,5 eV is te wijten aan de aminogroepen die een interactie aangaan met het oppervlak van Fe₃ O₄ door protonering of vorming van –H-bindingen.

Na de verankering van gH625-peptide of FA, PEG en Rhod neemt de N1s-component bij 399,8 eV toe vergeleken met de component bij 401,8 eV gerelateerd aan geprotoneerde aminogroepen van NH₂ @MNP's. Deze toename is te wijten aan de overlappende signalen van de N-atomen die betrokken zijn bij de amidische binding (400,2 eV) tussen het verankerde aminopropylfosfaat en de geconjugeerde moleculen (bijv. gh625, FA, PEG en Rhod), evenals van de N-atomen van gh625 en FA (bij 399,1 en 400,6 eV).

De C 1s-band van NH₂ Het spectrum van @MNP bestaat uit een enkele piek bij 285,0 eV toegewezen aan alifatische koolstoffen, zoals eerder gerapporteerd [40].

In de C1s-spectra van gH625@MNP's en PEG,FA@MNP's is de aanwezigheid van een C 1s-component bij 288,3 eV te wijten aan de carboxyl- en amidische groepen van gh625-, FA- en Rhod-moleculen.

FT-IR-spectra van NH₂ @MNP's, gH625@MNP's en PEG,FA@MNP's worden gerapporteerd in Fig. 4. In alle monsters laten de spectra de banden niet zien op 1250 cm ^− 1 vanwege P=O en de scherpe pieken in de 900-1050 cm ^− 1 bereik als gevolg van P–O–H rekken [44,45,46], maar een brede en sterke band bij 1040 cm ^− 1 , die wordt geassocieerd met de trillingen van de PO₃ ²⁻ groep gebonden aan het ijzeren oppervlak. Deze band geeft, volgens XPS-resultaten, aan dat de fosfonzuren gedeprotoneerd zijn en aan het oppervlak zijn verankerd door P-O-Fe-bindingen zoals eerder gerapporteerd [34, 40, 41]. Het IR-spectrale gebied tussen 1500 en 1700 cm ^− 1 laat zien dat de banden behoorden tot de amino- en amidegroepen van gH625 en FA. In het bijzonder spectrum van NH₂ @MNPs vertoont een scherpe piek rond 1650 cm ^− 1 gekoppeld aan de NH₂ buigen [47]. Na PEG-, Rhod- en FA-verankering, 1700-1500 cm ^− 1 regio van PEG,FA@MNP's vertoont bredere banden vanwege de convolutie van de trillingen van niet-gereageerd NH₂ , amidegroepen en benzeenringen van FA en Rhod (1630-1600 cm ^− 1 ) [35]. Analoog, na peptideverankering, de brede banden op ongeveer 1650-1600 cm ^− 1 kan te wijten zijn aan de bijdrage van verschillende trillingen als gevolg van niet-gereageerd NH₂ en amineresten van de peptidezijketens en op het C=O-stuk van de peptide-amidebindingen [48]. Bovendien is een component van ongeveer 1540 cm ^− 1 vanwege de gecombineerde δ (N–H)/ν(C–N) trillingen van het peptide [48] zijn ook aanwezig.

FT-IR-karakterisering van gefunctionaliseerde MNP's. FT-IR-spectraalgebied in de 850–1900 cm ⁻¹ bereik  van a) NH₂ @MNP's, b) gH625@MNP's, en c) PEG,FA@MNP's

De FA-verankering op MNP's is ook bewezen door de UV/Vis-spectra van een PEG,FA@MNP's colloïdale oplossing. Figuur 5 vergelijkt de spectra van NH₂ @MNP's en PEG,FA@MNP's colloïdale dispersies. Het spectrum van een FA-oplossing (5 μM) is als referentie toegevoegd. Een duidelijke band bij 274 nm typisch voor de FA is duidelijk zichtbaar in zowel de referentie als de PEG,FA@MNP's colloïdale oplossing, waarmee de aanwezigheid van FA in de MNP's wordt bevestigd. Merk op dat de lichte verschuiving is van de FA-NHS-absorptie bij 280 nm naar de waarde van 274 nm nadat verankering waarschijnlijk te wijten is aan de verandering van de omgeving van vrije FA-NHS en nanodeeltjes-verankerde FA. De aanwezigheid van variabele verschuivingen van de absorptieband bij 280 nm na FA-oppervlakverankering of conjugatie met andere moleculen is al waargenomen in de literatuur [49,50,51].

UV/Vis-karakterisering van gefunctionaliseerde MNP's. UV/Vis-spectra van een 5 μM FA-NHS-oplossing en van NH₂ @MNP's en PEG,FA@MNP's colloïdale dispersies. Merk op dat de hoge achtergrond waargenomen in de spectra van NH₂ @MNP's en PEG,FA@MNP's is te wijten aan de verstrooiing van de colloïdale dispersie van nanodeeltjes

De gemiddelde hydrodynamische diameter, de polydispersiteitsindex (PDI) en het zeta-potentieel van gefunctionaliseerde MNP's werden bepaald door DLS in PBS-buffer bij pH 7,4 op MNP-dispersies zoals bereid en na 72 uur veroudering (tabel 1). De hydrodynamische diameters van NH₂ -PA@MNP's, gH625@MNP's en PEG,FA@MNP's waren respectievelijk 73,0 ± 3,0 nm, 104,0 ± 4,0 nm en 51 ± 2 nm, en PDI-waarden geven een voldoende smalle verdeling van de deeltjesgrootte aan. Zoals verwacht verhoogde de conjugatie met gH625 de grootte van nanodeeltjes, terwijl de afname in de grootte van PEG,FA@MNP's te wijten is aan een betere dispersie dan de NH₂ @MNP's, gerelateerd aan de aanwezigheid van de PEG-ketens.

Merk in ieder geval op dat voor alle systemen een zeer negatieve zeta-potentiaal (< − 30 mV) werd waargenomen. Dergelijke negatieve zeta-potentiaalwaarden zorgen voor stabiliteit op lange termijn en voorkomen uitgebreide deeltjesaggregatie [52, 53]. De negatieve oppervlaktelading was inderdaad slechts in geringe mate afhankelijk van de coating, maar was voornamelijk het gevolg van de combinatie van de negatief geladen kern van Fe₃ O₄ nanodeeltjes [54] en het effect van fosfonzuurgroepen zoals waargenomen voor vergelijkbare systemen [52, 34]. Daarom, in vergelijking met andere synthetische strategieën die worden gebruikt om MNP's te functionaliseren, maakt het gebruik van fosfonzuurmonolagen als linkers niet alleen de vorming van stabiele binding tussen het oppervlak en de functionele groepen mogelijk, maar induceert het ook een zeer negatief zeta-potentieel. Na 72 uur veroudering, de grootte en het zeta-potentieel van NH₂ -PA@MNP's, gH625@MNP's en PEG,FA@MNP's blijven ongeveer hetzelfde, wat suggereert dat alle gedecoreerde oppervlakken in de loop van de tijd stabiel zijn.

Levensvatbaarheid van de cel

De levensvatbaarheid van HBMEC- en A-172-cellen geïncubeerd met gH625@MNP's en FA,PEG@MNP's werd geëvalueerd met behulp van MTT-assay op verschillende incubatietijden en in aanwezigheid van verschillende concentraties nanodeeltjes (10 en 20 μg/ml). Zoals weergegeven in Fig. 6, werd geen concentratie- en/of tijdsafhankelijk (24-48-72 uur) cytotoxisch effect van de gedecoreerde systemen op HBMEC- en A-172-cellen waargenomen.

Levensvatbaarheid van de cel. Levensvatbaarheid van de cel van a HBMEC en b A-172-cellen 24, 48 en 72 uur geïncubeerd met gH625@MNPs 10 g/ml (zwarte balk), gH625@MNPs 20 μg/ml (rode balk), PEG,FA@MNPs 10 g/ml (blauwe balk ), en PEG,FA@MNPs 20 μg/ml (magenta balk)

Intracellulaire opname

Om te bepalen of het celpenetrerende vermogen van gH625-peptide behouden blijft na immobilisatie op het oppervlak van nanodeeltjes, en om het vermogen van gH625 en FA om de BBB te kruisen te vergelijken, de internalisatie in endotheelcellen van de menselijke hersenen van NBD-gelabelde gH625@MNP's en Rhod-gelabelde PEG,FA@MNP's zijn onderzocht met confocale laser scanning microscopie.

Na 24 uur incubatie is de opname van PEG-FA@MNP's niet duidelijk, terwijl de internalisatie van gH625@MNP's duidelijk zichtbaar is (Fig. 7). De conjugatie met gH625 leidt tot een snellere opname en een bijna twee keer hogere intensiteit van de intracellulaire fluorescentie (Fig. 8).

LSM-fluorescentiemicrofoto's van HBMEC. LSM-fluorescentiemicrofoto's van HBMEC gedurende 24 uur geïncubeerd (b , v ) en 72 u (d , u ) met NBD-gelabelde gH625@MNPs 15 μg/ml (b , d ) en hun bedieningselementen (a , c ) of rhod-gelabelde PEG,FA@MNPs 15 μg/ml (f , u ) en hun bedieningselementen (e , g ). Schaalbalk = 20 μm

Genormaliseerde intensiteiten van intracellulaire fluorescentie. Kwantitatieve analyse van intracellulaire fluorescentie na HBMEC-incubatie na 24 en 72 uur met NBD-gelabelde gH625@MNP's en Rhod-gelabelde FA,PEG@MNP's

Voor langere incubatietijden (72 uur) worden de verschillen tussen de internalisatie van de twee systemen verminderd. Dit gedrag is niet onverwacht, aangezien bij lange incubatietijden niet-specifieke internalisatieprocessen van FA,PEG@MNP's kunnen optreden en onze resultaten verder bevestigen wat we eerder hebben gerapporteerd voor de opname van gefunctionaliseerde en niet-gefunctionaliseerde polystireennanodeeltjes [55].

Om de mogelijkheid van het gebruik van gH625@MNP's als therapeutisch middel voor hersentumoren verder te onderzoeken, werd de cellulaire opname van gH625@MNP's en FA,PEG@MNP's onderzocht met behulp van de A-172 glioblastoomcellijn. Glioblastoom is een van de meest voorkomende primaire hersentumoren en ook een van de meest dodelijke kankers.

De cellulaire opnames van gH625@MNP's en FA,PEG@MNP's na 24 uur incubatie zijn vergelijkbaar, zoals weergegeven in figuur 9.

LSM-fluorescentiemicrofoto's van glioblastomacellen. LSM-fluorescentiemicrofoto's van glioblastomacellen. Samengevoegde blauw-groene afbeeldingen:controlecellen (a ) en cellen die zijn geïncubeerd met 15 μg/ml NBD-gelabelde gH625@MNP's (b ). Samengevoegde blauw-rode afbeeldingen:controlecellen (c ) en cellen geïncubeerd met 15 μg/ml rhod-gelabelde PEG,FA@MNP's (d ). Schaalbalk = 20 μm

This behavior suggests that the gH625 is capable of targeting brain tumor with the same efficiency of the more often adopted FA targeting unit.