Chondroitinesulfaat-versterkte gelatine/polycaprolacton nanovezels: antitrombogeen scaffold met superieure endotheliale affiniteit voor bloedvatweefseltechniek

Samenvatting

Elektrogesponnen polymere nanovezels hebben veel aandacht gekregen in bloedvatweefseltechniek. Echter, conventionele nanovezelmaterialen met de tekortkomingen van langzame endothelialisatie en trombose zijn niet effectief in het bevorderen van bloedvatweefselherstel en regeneratie. Hierbij werden biomimetische gelatine (Gt)/polycaprolacton (PCL) composiet nanovezels die een verschillend bedrag chondroitinesulfaat (CS) incorporeren, ontwikkeld via elektrospintechnologie om hun effecten op antitrombogeniteit en endotheliale celaffiniteit te onderzoeken. Variërende CS-concentraties in PG nanovezels beïnvloeden vezelmorfologie en diameter. De CS/Gt/PCL nanovezels hebben een geschikte porositeit (~ 80%) en PBS-oplossingsabsorptie (tot 650%). De introductie van CS in Gt/PCL nanovezels verbetert hun anticoagulante eigenschappen aanzienlijk, verlengt hun stollingstijd en vergemakkelijkt celresponsen. Met name 10%CS/Gt/PCL nanovezels tonen gunstige celhechting, utrekking en proliferatie. Dus zouden de Gt/PCL nanovezels die een bepaalde hoeveelheid CS bevatten, uitstekende kandidaten kunnen zijn als veelbelovende weefseltechnische scaffold in bloedvatherstel en regeneratie.

Inleiding

De ontwikkeling van nanovezelmaterialen heeft veel aandacht gewekt als biomimetische scaffolds in weefselherstel en regeneratie vanwege hun unieke (bio)fysico-chemische kenmerken, waaronder hun extracellulaire matrix (ECM)-achtige ultrafijne vezelstructuur, uitstekende mechanische eigenschappen, groot specifiek oppervlak, en hoge porositeit met interconnectiviteit [1, 2]. Het is aangetoond dat nanovezelstructuren een sleutelrol spelen in het mediëren van cellulaire responsen, zoals celadhesie, morfologie (bijv. spreiding, uitlijning, utrekking, etc.), rangschikking, migratie, proliferatie, fenotype, en differentiatie via contactgeleiding [3,4,5]. Terwijl talloze nano-fabricatiestrategieën (bijv. nanoskiving, templatesynthese, fasesscheiding, etc.) een beschikbare technologie hebben geboden om nanovezelmaterialen te fabriceren, is elektrospinnen een van de meest effectieve methoden om nanovezels van verschillende materialen (metalen, keramiek, polymer, composietmaterialen, etc.) op industriële schaal te fabriceren [6,7,8].

Naast (bio)fysische signalen, kan de selectie van geschikte biomaterialen de celactiviteiten en weefselherstel en regeneratie significant beïnvloeden [9]. Enkele sleutelkenmerken, zoals biocompatibiliteit, bioafbreekbaarheid, mechanische eigenschappen, en bio-functie, moeten overwogen worden [9, 10]. Vergeleken met natuurlijke/natuurlijke en synthetische/synthetische composieten, hebben composiet nanovezelmaterialen bestaande uit natuurlijke en synthetische polymeren meer aandacht gekregen vanwege de combinatie van de uitstekende biologische kenmerken van natuurlijke polymeren en de mechanische sterkte van synthetische polymeren [9]. Onder hen is de gelatine (Gt)/polycaprolacton (PCL) combinatie een van de meest representatief onderzochte natuurlijk-synthetische hybride systemen en wijd gebruikt in bloedvatweefseltechniek [11,12,13,14]. Echter, Gt/PCL composiet nanovezels hebben nog steeds enkele beperkingen, zoals langzame endothelialisatie en trombose. Recentelijk is chondroitinesulfaat (CS) een gesulfateerd polysaccharidet dat glycosaminoglycaan en galactosamine bevat, wat is aangetoond om hoge adhesie aan endotheliale cellen (ECs), zwakke interactie met proteïnen en bloedplaatjes, alsmede elektrostatische afstoting van negatief geladen bloedcomponenten te bezitten [15,16,17]. Bovendien kan CS cellulaire apoptose remmen en het genezen van vaatwonden vergemakkelijken [18, 19]. Daarom zouden Gt/PCL (PG) elektrogesponnen nanovezels die CS incorporeren, uitstekende kandidaten zijn als een bio-instructieve weefseltechnische scaffold voor bloedvatherstel en regeneratie.

In het huidige werk werden biomimetische PG composiet nanovezels die verschillende CS-verhoudingen bevatten, ontwikkeld via één-staps elektrospinnen. De morfologie, chemische eigenschap, porositeit en afbraak van CS/PG composiet nanovezels werden gedetecteerd door verschillende karakterisatietechnieken. De anticoagulante werking van PG/CS composiet nanovezels werd geëvalueerd. Verder werden deze composiet nanovezels met verschillende CS-verhoudingen gezaaid met humane aortale endotheliale cellen (HAECs) om hun effecten op cellulaire responsen te onderzoeken.

Materialen en methoden

Materialen

CS (rundtrachea, type A, zuiverheid: 95%) werd geleverd door Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd. (China). PCL werd verkregen van Aladdin Biochemical Polytron Technologies Inc. (China). Gt (rundervel, type B) werden verkregen van Sigma-Aldrich Biochemical Technology Co., Ltd., (China). De geactiveerde partiële tromboplastine tijd (APTT) kit werd gekocht van Leigen Biotechnology Co., Ltd (China). Azijnzuur (zuiverheid: 99,5%) werd gekocht van Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. (China). De humane aortale endotheliale cellen (HAECs) werden verkregen van het geaffilieerde ziekenhuis van Qingdao Universiteit (China). Kweekmedium Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F-12), fetale runderserum (FBS), 0,25% trypsine–EDTA werden gekocht van Biological Industries (Israel). Alle reagentia werden gekocht van Sigma Aldrich (China) tenzij anders vermeld. Het water dat in alle experimenten gebruikt werd, was gedemineraliseerd.

Elektrospinnen van nanovezels

PCL (10% w/v) werd opgelost in azijnzuur onder mechanische roeren bij kamertemperatuur gedurende 4 uur. Gt (10% w/v) werd opgelost in 90% azijnzuur met constante roering gedurende 2 uur. CS in verschillende concentraties werd toegevoegd aan de Gt-oplossing en zacht gerold bij kamertemperatuur gedurende 1 uur om homogene oplossingen te verkrijgen die 5, 10 en 15 wt.% CS bevatten ten opzichte van de totale polymere concentratie. Vervolgens werd PG-oplossing bereid door de twee bovengenoemde oplossingen te mengen in een gewichtsverhouding van 50/50 (w/w) onder roeren gedurende 2 uur, genoemd als 5%CS@PG, 10%CS@PG en 15%CS@PG.

De bereide homogene oplossingen werden onderworpen aan het elektrospinfproces, uitgerust met een 1 mL spuit met 21 G naald en een collector bedekt met aluminiumfolie. In deze studie was de afstand tussen de collectorplaat en de naaldpunt vastgezet op ongeveer 18 cm, de spanning was ingesteld op 23 kV, en de polymere oplossingen werden uitgepompt met een snelheid van 1 mL/u. Alle oplossingen werden elektrogesponnen in een elektrospininstrument (Technology, Tk602TH, China) bij kamertemperatuur en zorgvuldig gecontroleerde vochtigheid (< 40%). Voor verdere experimenten werden de monsters in een vacuüm droogoven geplaatst gedurende ten minste 72 uur om eventuele overgebleven oplosmiddel te verwijderen.

Scanning Elektronenmicroscopie (SEM) en Transmissie Elektronenmicroscoop (TEM)

De morfologie van CS@PG nanovezel-scaffolds werd onderzocht door een SEM (VEGAS, TESCAN, Tsjechië) bij een versnellingsspanning van 20 kV bij kamertemperatuur. De diameter van nanovezels (n = 100) werd verder gemeten uit SEM-afbeeldingen met behulp van beeldanalysesoftware (Image J).

De TEM-waarnemingen en energiedispersieve Röntgenspectroscopie (EDS) analyses werden uitgevoerd met behulp van een JEOL JEM-2100 plus (Japan).

Fourier Transform Infrarood Spectroscopie (FTIR)

FTIR werd uitgevoerd door een Nicolet iN10 FTIR spectrometer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) om de karakteristieke functionele groepen van CS, PG nanovezel, en CS@PG nanovezels te evalueren. De spectra van monsters werden opgenomen met de transmissiemodus over een golflengtebereik van 4000–500 cm⁻¹ met een resolutie van 2 cm⁻¹.

Porositeit en de Absorptie van Fosfaat-gebufferde Zoutoplossing (PBS)

De porositeit van nanovezels werd uitgevoerd met behulp van de vloeistofverplaatsingsmethode. Ten eerste werd het droge gewicht van nanovezels gewogen als W₁. Vervolgens werden vier groepen nanovezels gedompeld in ethanol gedurende 2 uur bij 25 °C en gewogen als W₂. De ethanol op het monsteroppervlak werd verwijderd door filterpapier, en de gewichten van monsters werden genoteerd als W₃. De porositeit van de nanovezels werd berekend door de volgende formule:

$$\text{Porositeit} (\%) = \frac{W_{3} - W_{1}}{W_{3} - W_{2}} \times 100$$

Voor de PBS-oplossingsabsorptietest werden de verkregen nanovezels in een droge toestand gewogen en genoteerd als Wd. Vervolgens werden de nanovezels in PBS gedoopt gedurende 24 uur bij 25 °C en het gewicht in natte toestand genoteerd als Ww na het verwijderen van het overmatige vloeistof op het monsteroppervlak. De zwelverhouding kan gemeten worden door de volgende vergelijking:

$$\text{PBS absorptie} (\%) = \frac{W_{W} - W_{d}}{W_{d}} \times 100$$

Alle waarden in de bovengenoemde experimenten worden uitgedrukt als het gemiddelde ± SD (n = 3).

In Vitro Afbreekbaarheidsgedrag

Om de verkregen nanovezels' resistentie tegen lysozym te bepalen, werd de afbreekbaarheid van de monsters gemeten op een geplande tijd (1, 4, 7, 10 en 14 dagen). Het initiële gewicht van de nanovezels werd genoteerd als W_i. Vervolgens werden de monsters gedompeld in PBS-oplossing (pH 7,4) bevattende lysozym (500 µg/mL) en in vitro geïncludeerd bij 37 °C. Op de vooraf bepaalde afbraakintervallen werd elke groep monsters verwijderd en gewassen met gedemineraliseerd water, en vriesgedroogd om het eindgewicht (W_f) te verkrijgen. De lysozymoplossing werd drie keer per week ververst. De massa resterend (%) van de nanovezel-scaffolds werd geschat zoals gedefinieerd in de volgende formule:

$$\text{Massa resterend} (\%) = \left( 1 - \frac{w_{i} - w_{f}}{w_{i}} \right) \times 100\%$$

Om het afbraakgedrag van het monster na 7 dagen te evalueren, werd de morfologie van nanovezels waargenomen door SEM.

Bloedcompatibiliteitsanalyse

Stollingstijden

Geactiveerde partiële tromboplastine tijd (APTT) werd gebruikt om de activiteit van intrinsieke en gemeenschappelijke routes van stolling te beoordelen door de stollingstijden van bloedplaatje-arme plasma (PPP) te testen na incubatie met elektrogesponnen nanovezels op dekkleertjes. Hiervoor werd geanticoaguleerd bloed (ongeveer 10 mL) verzameld en gecentrifugeerd bij 3000 rpm gedurende 20 min om bloedplaatje-arme plasma (PPP) te verkrijgen. Elk monster werd geïncludeerd met 200 µL PPP gedurende 10 min bij 37 °C en geanalyseerd met APTT-kit volgens de fabrikantsinstructies (n = 3).

Hemolyse Testen

De hemolysesnelheid werd geëvalueerd door de concentratie hemoglobine vrijgekomen in de oplossingsfase uit erythrocyten in uitgezonden volbloed blootgesteld aan de elektrogesponnen nanovezels te meten. De monsters op dekkleertjes werden afzonderlijk in 24-puttenplaten geplaatst en gedompeld in 2 mL PBS bij 37 °C gedurende 30 min. De negatieve controlegroepen bevatten alleen 2 mL PBS, terwijl positieve controlegroepen bestonden uit 2 mL gedemineraliseerd water met het doel om maximale lyse van erythrocyten te induceren (n = 3 voor elke testgroep). Vervolgens werd 40 µL van bovengenoemd geanticoaguleerd vers volbloed aan elke put toegevoegd en geïncludeerd gedurende 60 min bij 37 °C, waarna de suspensies in centrifugebuizen werden verwijderd en gecentrifugeerd bij 100× g gedurende 5 min. De supernatanten werden onderworpen aan het meten van de absorbantie bij 570 nm met een microplaatlezer (SynergyH1/H1M, BioTek, China).

Trombogeniciteit

Het trombogeen potentieel werd in vitro geëvalueerd na incubatie van elektrogesponnen monsters met bloedplaatje-rijk plasma (PRP). PRP werd bereid door centrifugatie (1500 rpm, 20 min) en de bovenste helft van plasma werd weggegooid. Vervolgens werden de nanovezels op dekkleertjes geïncludeerd in 100 µL PRP bij 37 °C gedurende 2 uur en zacht afgespoeld met PBS drie keer voor opeenvolgende experimenten. Om de bloedplaatjesactiviteit na incubatie met PRP te evalueren, werden elektrogesponnen nanovezels bewaard in DMEM aangevuld met 10% FBS gedurende 2 uur en 24 uur, en vervolgens werd een CCK-8 assay kit gebruikt om trombocytlevensvatbaarheid op de nanovezels te meten. CCK-8 (20 µL) werd toegevoegd aan 200 µL serumvrij DMEM medium in 24-puttenplaten en geïncludeerd gedurende 1 uur. Ten slotte werden suspensies gemeten door een microplaatlezer bij een golflengte van 450 nm.

Celkweek en Cel Levensvatbaarheid

Humane aortale endotheliale cellen (HAECs) werden gekweekt in DMEM aangevuld met FBS (10%, v/v), en streptomycine/penicilline (1%, v/v) in een atmosfeer van 37 °C en 5% CO₂. Het kweekmedium werd drie keer per week ververst. De cellen werden doorgaans geïsoleerd door 0,05% trypsine/EDTA gedurende 3 min, gecentrifugeerd bij 1000 rpm, en heropgelost in het verse medium om celdraag of celzaaiing uit te voeren.

Voor celzaaiing werden alle nanovezelmaterialen in een 24-puttenplaat gesteriliseerd onder UV-bestraling gedurende 1 uur en gedompeld in 75% ethanol (v/v, %) gedurende 1 uur. Vervolgens werden de nanovezels vier keer afgespoeld met PBS-oplossing en in DMEM geweek gedurende 12 uur in CO₂ incubator. De cellen werden gezaaid met een dichtheid van 1 × 10⁴ cellen per put op nanovezels en het medium werd elke dag ververst. Na 24 uur co-kweek, werden cellen gewassen met PBS-oplossing drie keer en vervolgens gekleurd met een Calcein-AM/PI Dubbele kleur Kit (YEASEN Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, China). PI werd gebruikt om dode cellen te kleuren en Calcein-AM voor levende cellen.

Cel Morfologie op de Nanovezels

Om de celadhesie op de nanovezels te observeren, werd de morfologie van de cellen waargenomen na 24 uur co-kweek door Fluorescentiemicroscoop (Nikon A1 MP, Japan). Ten eerste werden de cellen gefixeerd met 4% paraformaldehyde bij kamertemperatuur gedurende 30 min. Vervolgens werd 0,5% Triton X-100 oplossing gebruikt gedurende 5 min om het celmembraan te permeabiliseren. Ten slotte werd 4'6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) gebruikt om celkernen te kleuren en rhodamine-phalloïdine om het F-actine te kleuren. Kwantitatieve analyse (celdichtheid, enkelceloppervlak, celuitrekking) werd verder uitgevoerd met Image J.

Cel Proliferatie

Celproliferatieactiviteit op de composiet nanovezels werd uitgevoerd met een CCK-8 Assay Kit. De HAECs werden gezaaid op nanovezels met een dichtheid van 8 × 10³ cellen/put. Het kweekmedium werd elke twee dagen ververst. Na 1, 4, 7 dagen co-kweken, werden de cellen gewassen met PBS-oplossing om niet-gehechte cellen te verwijderen. Vervolgens werd 20 µL CCK-8 en het complete medium met een volumeverhouding van 1:10 aan de 24-puttenplaat toegevoegd gedurende 1 uur in de incubator. De absorbantie werd getest door Elisa Reader bij 450 nm.

Celkleuring met DAPI en rhodamine-phalloïdine werd uitgevoerd met Fluorescentiemicroscoop om direct de veranderingen in celaantallen na co-kweek met verschillende nanovezels voor twee dagen en zes dagen te observeren.

Statistische Analyse

Alle monsters in de experimenten werden in driploop verwerkt. Alle data worden voorgesteld als gemiddelde ± standaarddeviaties (SD). Statistische analyse van monsters werd bepaald door eénrichtings variantieanalyse (ANOVA) om verschillen te vergelijken met significantie toegewezen bij p < 0,05.

Resultaten en Discussie

Voorbereiding en Karakterisering van CS@PG Nanovezels

Figuur 1 toonde het schematische diagram van het elektrospinfproces voor CS@PG nanovezel-scaffolds en in vitro evaluatie van anticoagulatie en cytocompatibiliteit. Om geïnjineerde vaatweefsel-scaffolds te ontwikkelen voor het bevorderen van de proliferatie van endotheliale cellen, werden verschillende verhoudingen van CS (5, 10 en 15 wt%) geïncorgeerd in PG (10%, v/v) oplossingen om composiet nanovezels te fabriceren via elektrospinfproces.

SEM werd uitgevoerd om de structuur van CS@PG elektrogesponnen nanovezels te observeren. Zoals getoond in Fig. 2, vertoonden de SEM-afbeeldingen van PG, 5%CS@PG, 10%CS@PG, 15%CS@PG nanovezels de dichte vezelarchitectuur, die continue, gladde en nanoschaalvezels bevatten door elektrospintechniek. De PG nanovezels (Fig. 2a) vertoonden veel onregelmatige kralen op nanovezels door het elektrospinfproces, met een gemiddelde diameter van 406,01 ± 146,28 nm. Het kan worden verklaard dat 10% w/v van elektrogesponnen oplossing lage viscositeit vertoonde, wat resulteerde in de vorming van inhomogene nanovezels die kralen bevatten [20]. Met de toename van de hoeveelheid CS in de polymere oplossing van 5 tot 10% wt., konden homogene nanovezels zonder kralen worden bereikt door de verhoogde oplossingsviscositeit (Fig. 2b, c). Daarbij vertoonden 5%CS@PG en 10%CS@PG een kleinere gemiddelde diameter van respectievelijk 382,35 ± 152,99 nm en 300,29 ± 100,85 nm. Dit resultaat is primair omdat de toename van CS-inhoud de geleiding van de elektrospinoplossing overeenkomstig verbeterde [20]. Echter, toen de polymere concentratie op 15% was, was de viscositeit van de polymere oplossing te hoog om in het elektrische veld uitgerekt te worden. Bij dezelfde flowsnelheid van 1 mL/u als de vorige groepen, observeerden we dat onder de toegepaste spanning van 23 kV, de naaldpuntobstructie verschenen en de Taylor-kegel niet waargenomen kon worden. Daarom werden de flowsnelheid van de elektrogesponnen oplossing en de toegepaste spanning aangepast tot respectievelijk 0,9 mL/u en 20 kV. De 15%CS@PG nanovezels werden succesvol geproduceerd met een gemiddelde diameter van 266,92 ± 105,43 nm.

Zoals afgebeeld in Fig. 3a, werd gevonden dat CS uniform verdeeld was in de 5%CS@PG en 10%CS@PG nanovezels. Echter, CS-aggregatie werd gedetecteerd in de 15%CS@PG vezels. Zoals aangegeven in Fig. 3b, werd EDX elementaire analyse uitgevoerd om de zwavelinhoud van de bereide vezels te detecteren. Zoals verwacht, steeg de zwavelinhoud met een verhoogde concentratie van CS in de verkregen vezels.

FTIR Spectra Analyse

FTIR spectra analyse werd uitgevoerd om de karakteristieke absorptiepieken van de chemische groep van de bereide nanovezel-scaffolds te bepalen. Het FTIR spectrum van PG en CS werden beschouwd als de controlegroep om te vergelijken met CS@PG nanovezelgroepen. In PG spectrum, sterke absorptiebanden die verschenen bij 3300 cm⁻¹ en 2935 cm⁻¹ kunnen toegeschreven worden aan de –NH₂ en –OH rektrilling, en CH₂ asymmetrische rektrilling, respectievelijk. Verscheidene karakteristieke absorptiepieken verschenen bij 1652 cm⁻¹ (amide I) voor C=O rektrilling, 1542 cm⁻¹ (amide II) voor N–H buigtrilling, 1441 cm⁻¹ voor CH₂ rek, en 1267 cm⁻¹ (amide III) voor C–N rektrilling [21, 22]. Het CS spectrum vertoonde een karakteristieke absorptieband bij 1245 cm⁻¹, die de S=O rektrilling in negatief geladen SO₄²⁻ vertegenwoordigt [23, 24].

Zoals getoond in Fig. 4, vertoonden de FTIR spectra van 5%CS@PG, 10%CS@PG en 15%CS@PG nanovezels karakteristieke pieken van PCL, Gt en CS samen. Vergeleken met de spectra van PG-groep, vertoonden CS@PG-groepen de karakteristieke band van CS bij 1245 cm⁻¹, en de intensiteit van CS-band nam toe door de aanwezigheid van CS in nanovezels. Deze bevinding bevestigde de aanwezigheid van variërende inhoud van CS in de CS@PG elektrogesponnen nanovezels.

Porositeit, Zwelverhouding en Afbreekbaarheid van Nanovezels

De hoge porositeit van de vezel geeft aan dat het materiaal uitstekende interconnectiviteit heeft, wat gunstig is voor de diffusie van zuurstof en nutriënten in de poriën en celinfiltratie bevordert [25, 26]. Figuur 5a toonde de porositeit van nanovezelfilms. De porositeit van verkregen nanovezels die verschillende CS-verhoudingen bevatten, was ongeveer tot 80%. De hoge poreuze architectuur verkregen door elektrogesponnen nanovezels kan de natuurlijke ECM nabootsen, wat een gunstige 3D micro-omgeving voor cellen biedt [27]. Het is gerapporteerd dat scaffolds in weefseltechniek met een porositeit tot 80% gunstig was voor het transport van nutriënten en metabolieten.

De PBS absorptieverhouding van de CS@PG nanovezel-scaffolds werd vergeleken om het effect van CS op de PBS-opname van de films te evalueren. Zoals aangegeven in Fig. 5b, was de PBS absorptieverhouding van de PG scaffold 586,34 ± 49,44%, en de 5%CS@PG en 10%CS@PG nanovezels waren respectievelijk 492,86 ± 21,99% en 510,04 ± 69,55%. De PBS absorptieverhouding van 15%CS@PG groepen (665,07 ± 59,81%) was significant hoger dan die van 5% CS@PG en 10%CS@PG. Dit resultaat gaf aan dat de verhoogde inhoud van CS in de composiet nanovezels de PBS-opname-eigenschap van de films kon verbeteren, wat zou kunnen zijn door de hoge hydrofiliciteit in CS-moleculen die hydrofiele groepen (carboxyl en hydroxyle) bevatten [28].

De data van het in vitro afbreekbaarheidsexperiment werd afgebeeld in Fig. 5c, en er werd gevonden dat met de toename van CS-verhouding, de afbraaksnelheid van CS@PG nanovezel-scaffolds ook toegenomen was. Dit kan worden toegeschreven aan de aanwezigheid van SO₄²⁻ groepen [29]. Zoals gedemonstreerd in Fig. 5c, begon de afbraaksnelheid van de meeste scaffolds na 7 dagen te stijgen, en de afbraakresultaten op dag 14 waren 8,45%, 11,39%, 13,97% en 15,10% voor PG, 5% CS@PG, 10%CS@PG en 15%CS@PG nanovezel-scaffolds, respectievelijk. De SEM-afbeeldingen van nanovezel-scaffolds (Fig. 5d) toonden lichte zwelling na dompelen in PBS-oplossing gedurende 7 dagen. De SEM-afbeeldingen geven aan dat de ontwikkelde nanovezels stabiel genoeg waren om ernstige afbraak en expansie tot 7 dagen te vermijden, wat de celrespons in vivo of in vitro beïnvloedt.

Hemocompatibiliteitsevaluatie

APTT is een eenvoudige en betrouwbare methode voor het detecteren van bloed of plasma via het intrinsieke stollingsmechanisme. APTT werd getest om de invloed van de elektrogesponnen nanovezels op de mogelijke vertraging van bloedstolling te meten. Stollingstijd gedetecteerd door APTT vertoonde een statistisch significante afname van stollingstijden tussen controle PG en 5%CS@PG en 10%CS@PG nanovezels. In tegenstelling, verlengde APTT werd gevonden na incubatie van 15%CS@PG nanovezels met PPP, wat de verbeterde anticoagulante eigenschap aangeeft. Zoals gepresenteerd in Fig. 6a, was de impact van bloedstolling afhankelijk van de diameter van nanovezelmonsters. De laagste APTT stollingstijd werd gevonden na interactie met 5%CS@PG nanovezelmat en de hoogste APTT met elektrogesponnen 10%CS@PG, vergelijkbaar met de graad van hemolyse. De stollingstijd werd verlengd met de toename van CS-verhouding.

Volgens de ASTM F756-00 (2000), is de hemolysesnelheid van de biomaterialen vereist om < 5% te zijn [30]. De graad van hemolyse in deze studie werd uitgevoerd met behulp van een colorimetrische assay van vrijgekomen hemoglobine uit erythrocyten en kan berekend worden door de vergelijking: Hemolyse (%) = (OD_sam − OD_neg)/(OD_pos − OD_neg) × 100%. Zoals aangegeven in Fig. 6b, waren alle monsters niet-hemolytisch en resulteerden niet in enige gemarkeerde hemolyse (hemolysesnelheid is minder dan 5%).

De data van het bloedplaatjes levensvatbaarheidsexperiment zijn getoond in Fig. 6c. Na 2 uur was de metabolische activiteit van gehechte trombocyten het hoogst met maximaal bereikte waarden na interactie van PRP met nanovezels, met name PG nanovezels. Interessant, na 24 uur, daalde de bloedplaatjesactiviteit in alle monsters. Dit resultaat kan zijn door de snelle trombocytactivatie door de structuur van nanovezels, wat resulteert in snelle consumptie en vrijstelling van groeifactoren vergeleken met stabiele en langdurige bloedplaatjesactivatie bij contact met glad oppervlak [31]. De normale levensduur van trombocyten is ongeveer 8–10 dagen, en zal verkort worden als bloedplaatjes beginnen te activeren.

Levend/Dode Cel Kleuring

De invloed van CS op de cytocompatibiliteit van de nanovezels werd verkend door cel levensvatbaarheid, adhesieve morfologie en proliferatie van HAECs evaluatie op nanovezels gedurende 6 dagen. De gehechte cellen werden beoordeeld met behulp van de Calcein-AM/PI dubbele kleur kit, DAPI kleuring en CCK-8 assay kit.

Figuur 7a–e toonde de fluorescentieafbeeldingen van levende en dode HAECs gehecht aan de verschillende nanovezels. Calcein-AM (groen) en PI (rood) werden gebruikt om respectievelijk levende cellen en dode cellen te kleuren. Het kon worden waargenomen dat levende cellen gehecht waren aan de CS@PG composiet nanovezels, wat aangeeft dat de nanovezels die verschillende verhoudingen van CS bevatten, geen toxiciteit hadden voor HAECs. Verdere kwantitatieve analyse van het levend/dode celaantal op de nanovezels werd onderzocht door Image J (Fig. 7f). Vergeleken met de verhouding van levende en dode cellen op PG nanovezels, vertoonden de andere drie groepen van PG die verschillende CS-verhoudingen bevatten, met name 10%CS@PG en 15%CS@PG groepen een groter percentage levende cellen, en het percentage nam toe met de toename van CS-concentratie. Dit resultaat toonde aan dat de aanwezigheid van CS in de nanovezels gunstig was voor het handhaven van cellevensvatbaarheid [32].

Cel Adhesie Gedrag op Nanovezels

Nanovezel-scaffolds met goede biocompatibiliteit worden beschouwd als de primaire vereiste voor de generatie van bloedvaten. PCL met goede bioafbreekbaarheid en natuurlijke Gt met uitstekende biocompatibiliteit werden wijd gebruikt in weefseltechniek met verschillende structuren, waaronder hydrogelen, elektrogesponnen nanovezels en driedimensionale scaffolds [21, 33, 34]. De morfologie van HAECs op de composiet nanovezels en cel-materiaal interactie na 24 uur werd waargenomen door fluorescentiemicroscoop. De celdichtheid 10%CS@PG en 15%CS@PG was statistisch significant dan PG en 5%CS@PG, wat aangeeft dat de toevoeging van CS op een hoger niveau celadhesie bevordert. Zoals getoond in Fig. 8c, was het enkelceloppervlak van 5%CS@PG en 15%CS@PG groter dan de andere groepen nanovezels. Echter, de celuitrekking van 10%CS@PG was significant hoger dan PG, 5%CS@PG en 15%CS@PG (Fig. 8d). Dit resultaat kan worden verklaard dat de toevoeging van CS bij 10% concentratie de spreiding van HAECs kan vergemakkelijken. Er werd gevonden dat de HAECs konden hechten, spreiden en goed groeien op de composiet nanovezels, met name 10%CS@PG en 15%CS@PG. Dus kunnen deze twee nanovezelmaterialen beschouwd worden als een veilige en veelbelovende kandidaat vasculaire materiaal in klinische toepassing.

Cel Proliferatie

Celgroei en levensvatbaarheid op CS@PG nanovezels werden in vitro onderzocht door fluorescentiemicroscoop en CCK-8 test (Fig. 9a–c). De elektrogesponnen PG scaffold werd geselecteerd als de positieve controle. De resultaten van de CCK-8 assay voor verschillende nanovezelfilms worden getoond in Fig. 9c. In 2, 4, 6 dagen van celkweek, nam het celaantal toe met de kweektijd voor alle groepen. Op dag 6 was de OD-waarde van 10%CS@PG nanovezels significant hoger dan die van de PG scaffold. De celproliferatievergelijking van 5%CS@PG, 10%CS@PG en 15%CS@PG gaf aan dat de celproliferatiesnelheid toegenomen was naarmate de CS-aanwezigheid in composiet nanovezels in een bepaald bereik. Echter, de celproliferatiecapaciteit werd ook beïnvloed door de oppervlaktemorfologie van nanovezelmaterialen. Aangezien de 15%CS@PG nanovezel sterke viscositeit vertoonde door de hogere CS-verhouding in de elektrospinpolymere oplossing, kan celproliferatie beïnvloed worden.

Conclusies

Samenvattend, biomimetische CS@PG composiet nanovezels zijn succesvol gefabriceerd met behulp van elektrospintechnologie. Veranderde vezelmorfologie en diameter werden verkregen door variërende CS-concentraties in PG nanovezels. De CS@PG nanovezels bezitten een geschikte porositeit (~ 80%) en PBS-oplossingsabsorptie (tot 650%). De incorporatie van CS in PG nanovezels verbetert hun anticoagulante eigenschappen aanzienlijk, verlengt hun stollingstijd en verbetert cellulaire responsen. Met name 10%CS@PG nanovezels vertoonden gunstige celadhesie, utrekking en proliferatie. Daarom remmen de PG composiet nanovezels geïncorgeerd met een bepaalde hoeveelheid CS antitrombogeniteit en verbeteren endotheliale celresponsen, wat ontwikkeld kan worden als een veelbelovende weefseltechnische scaffold in bloedvatherstel en regeneratie.

Beschikbaarheid van data en materialen

Alle data gegenereerd of geanalyseerd tijdens deze studie zijn opgenomen in dit artikel.