CoFe2O4-Quantum Dots voor synergetische fotothermische/fotodynamische therapie van niet-kleincellige longkanker via het activeren van apoptose door regulering van de PI3K/AKT-route
Abstract
Niet-kleincellige longkanker (NSCLC) is wereldwijd de op één na meest gediagnosticeerde kwaadaardige tumor geworden. Als onze langetermijnbelangen bij het zoeken naar nanomaterialen om strategieën voor kankertherapieën te ontwikkelen, hebben we hierin nieuwe CoFe2 geconstrueerd O4 -quantum dots (QD's) met uitstekende synergetische fotothermische/fotodynamische eigenschappen die NSCLC efficiënt onderdrukten zonder duidelijke toxiciteit. We toonden aan dat de combinatie van CoFe2 O4 -QDs + NIR-behandeling induceert apoptose van NSCLC-cellen. Bovendien is de CoFe2 O4 -QDs + NIR-behandeling bevordert ook de vorming van reactieve zuurstofsoorten om celdood te veroorzaken door de PI3K/AKT-route te reguleren. Bovendien is de CoFe2 O4 -QDs + NIR-behandeling elimineert met succes tumorxenotransplantaten in vivo zonder duidelijke toxische effecten. Alles bij elkaar hebben we gemeld dat de nieuwe nanomaterialen CoFe2 O4 -QD's kunnen een verbeterd synergetisch fotothermische therapie en fotodynamisch therapie-effect vertonen op het doden van NSCLC zonder toxiciteit, wat een veelbelovende fotosensitizer zou kunnen zijn voor NSCLC-therapie.
Inleiding
Kanker is de belangrijkste doodsoorzaak en brengt een enorme last met zich mee voor het gezin en de samenleving, waaronder longkanker de op één na meest gediagnosticeerde kanker en de eerste van kankergerelateerde sterfte in 2020 [1, 2]. Zoals gemeld, wordt niet-kleincellige longkanker (NSCLC), die ongeveer 85% van alle longkankers uitmaakt, gekenmerkt door een hoge incidentie en mortaliteit [3, 4]. De laatste tijd is er, ondanks chirurgische opties, veel moeite gedaan om chemotherapieën of immunotherapieën te ontwikkelen om NSCLC te behandelen. Zo zijn EGFR-mutante remmers en KRAS-remmers effectief gebleken en zijn er nog meer nieuwe ALK-remmers in ontwikkeling [5,6,7,8,9]. Anti-PDL1 en anti-CLTA4, dergelijke remmers van immuuncontrolepunten bieden ook een veelbelovende werkzaamheid en verlengen het overlevingsvoordeel [10,11,12]. De respons op deze medicijnen verschilt echter van patiënt tot patiënt en de bijwerkingen, met name resistentie tegen geneesmiddelen, mogen niet worden verwaarloosd [13, 14]. Daarom is het ontwikkelen van nieuwe therapeutische strategieën, die minder invasief zijn, een dringende en ook een noodzaak voor NSCLC-onderzoek en klinische behandelingen.
Op basis van recente vooruitgang heeft het gebruik van nanomaterialen voor het uitvoeren van fotothermische therapie (PTT) en fotodynamische therapie (PDT) enorme aandacht getrokken en een grote ontwikkeling bereikt als een strategie tegen kanker en kan het een alternatieve optie zijn in klinische behandeling [15,16,17, 18]. Op nanomateriaal gebaseerde PTT en PDT worden gekenmerkt door minder invasie en lage toxiciteit, die weinig kans hebben om resistentie tegen geneesmiddelen te induceren [19,20,21,22,23]. Met de medewerking van licht, meestal NIR, kunnen gelokaliseerde nanomaterialen de temperatuur in de tumor verhogen en zuurstof omzetten in cytotoxiciteit reactieve zuurstofsoorten (ROS), die celdood veroorzaken om tumoren te elimineren [24]. Hierbij speelt het nanomateriaal een sleutelrol om de werkzaamheid te beïnvloeden en de veiligheid te garanderen. Hoewel dergelijke nanomaterialen metalen nanostructuren [25], op koolstof gebaseerde materialen [26, 27], polymere nanodeeltjes (PNP's) [28] of halfgeleiderverbindingen [29] omvatten, hebben ze hun eigen beperkingen. Op koolstof gebaseerde materialen zijn bijvoorbeeld kostbaar en hebben onbevredigende suspensie-eigenschappen, wat de toepassing ervan op grote schaal en klinische mogelijkheden beperkt. Daarom moeten er meer pogingen worden ondernomen om meer geschikte nanomaterialen te genereren voor verder gebruik.
De afgelopen jaren hebben kwantumdots (QD's), als nieuwe nanomaterialen, grote aantrekkingskracht gekregen in biomedische toepassingen vanwege hun goede biocompatibiliteit, oplosbaarheid en het belangrijkste hun superieure fotostabiliteit en gemakkelijke oppervlaktefunctionaliseringseigenschap [30,31,32, 33]. Door gebruik te maken van deze eigenschappen, hebben verschillende rapporten QD's gebruikt als nieuwe PDT-reagentia en kunnen ze worden ontworpen om te worden gecombineerd met andere biomoleculen om de werkzaamheid van PDT bij de behandeling van kanker te verbeteren. Meng en collega's rapporteerden bijvoorbeeld een multifunctionele GQD@MnO2 geïnduceerd door twee-foto-excitatie om de PDT-efficiëntie te verbeteren [34]. Bovendien genereerden Kuo en collega's met stikstof gedoteerde QD's door ze te functionaliseren met aminomoleculen, wat ook de PDT-efficiëntie verbeterde [35]. Geïnspireerd door deze interessante bevindingen, probeerden we nieuwe QD's te ontwikkelen in combinatie met niet-edelmetaal-gebaseerd nanomateriaal dat PTT- en PDT-synergetische effecten in één nanosysteem kan brengen. Op Co-gebaseerd nanomateriaal is bijvoorbeeld goed bestudeerd op niet-edelmetaal gebaseerd nanomateriaal, dat bekend staat om zijn gebruik als PTT-middelen voor tumortherapie of beeldvorming [36]. Daarom hebben we gesuggereerd dat het ontwerpen van op co-gebaseerde QD's verbeterde PTT/PDT-synergetische effecten kan opleveren.
In deze studie hebben we nieuwe nanomaterialen CoFe2 . gesynthetiseerd O4 -QD's die verbeterde PTT- en PDT-synergetische effecten vertonen op het doden van NSCLC zonder toxische effecten in vitro en in vivo, wat een veelbelovende fotosensibilisator zou kunnen zijn voor NSCLC-therapie.
Materiaal en methoden
Synthese van CoFe2 O4 -QD's
De CoFe2 O4 -QD's werden gesynthetiseerd via een hydrothermische methode. Meestal 0,238 g CoCl2 ·6H2 O en 0,808 g Fe(NO3 )3 ·9H2 O werden opgelost in 10 ml H2 O en 10 ml propyleenglycolmengseloplosmiddel en vervolgens 10 minuten geroerd. Vervolgens werd druppel voor druppel 4 ml dithranolamine aan de oplossing toegevoegd, gevolgd door 30 minuten roeren. Vervolgens werd de verkregen slurry getransformeerd naar een 50 ml roestvrijstalen met Teflon beklede autoclaaf. De autoclaaf werd 3 uur in een oven op 160 gehouden. De CoFe2 O4 -QD's werden verzameld door 10 minuten te centrifugeren bij 8500 tpm en vervolgens achtereenvolgens te spoelen met gedeïoniseerd water en ethanol. Reagentia en materialen die in dit onderzoek zijn gebruikt, zijn te vinden in tabel 1.
Karakterisering van CoFe2 O4 -QD's
De morfologie en grootte van bereide CoFe2 O4 -QD's werden bepaald door het TEM- en EDS-systeem. De kristalstructuur werd geanalyseerd met een röntgendiffractometer (Bruker Duitsland) uitgerust met Cu Ka-straling (k = 0.15406 nm). Het absorptiespectrum van CoFe2 O4 -QDs werd gedetecteerd door SHIMADZU UV-2600 spectrofotometer. De elementvalentietoestanden van CoFe2 O4 -QD's werden bepaald door röntgenfoto-emissiespectroscopiemetingen (XPS, VG ESCALAB 220I-XL, VS). Het warmtebeeld is opgenomen met een IR thermische camera (FLIR E50, VS).
Celcultuur
NSCLC-cellijn NCI-H460 (H460) en A549 en humane navelstrengendotheelcellen (HUVEC's) werden verkregen van ATCC en getest op microplasma-negatief. H460- en A549-cellen werden gekweekt in RPMI-1640 aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline-streptomycine (Gibco). HUVEC's werden gekweekt in endotheelcelgroeimedium (Sigma, #211-500). Alle cellen werden bewaard in een incubator met een donkere vochtigheid van 37 met 5% CO2 .
Cytotoxiciteitsdetectie
Verschillende werkconcentraties (0,1, 0,5, 1,0, 2,0 mg/ml) van CoFe2 O4 -QD's werden toegevoegd en 24 uur gekweekt met HUVEC's. Na incubatie werd het kweekmedium verwisseld en werd CCK-8-regent aan elk putje toegevoegd, gevolgd door 1 uur incubatie. Vervolgens werden platen gemeten bij 450 nm met EnSpire™ Multimode Plate Reader. De verhouding van cellevensvatbaarheid werd genomen als 100% in controle-HUVEC's.
Apoptose-analyse
H460- en A549-cellen (2 × 10 5 ) werden 's nachts gekweekt in platen met 6 putjes voordat ze werden behandeld met 1,0 mg/ml CoFe2 O4 -QD's gecombineerd met NIR-laser van 808 nm gedurende 5 minuten. Vervolgens werden de cellen gewassen en gekleurd met Annexin-V/PI-apoptosekit (BD; #556547) volgens de instructies van de fabrikant. Wat betreft HUVEC's apoptose-assay, werden HUVEC's geïncubeerd met verschillende concentraties CoFe2 O4 -QD's. De apoptoseverhouding werd bepaald zoals hierboven beschreven.
Mobiele ROS-detectie
H460- en A549-cellen werden overnacht gekweekt in platen met 6 putjes. Cellen werden gedurende 1 uur met of zonder 1,0 mg/ml geïncubeerd en gedurende 5 minuten behandeld met een NIR-laser van 808 nm. Na behandelingen werd DCFH-DA toegevoegd en gedurende 30 minuten geïncubeerd, gevolgd door FACS-detectie met excitatie/emissie bij 485 nm/535 nm. Wat de ROS-remmingstest betreft, werd ROS-remmer NAC (Sigma; A7250) toegevoegd volgens de instructies van de fabrikant. Gegevens werden verder gekwantificeerd met Flow-jo software.
Western Blot-analyse
H460- en A549-cellen werden behandeld als apoptose-assay en het hele celeiwit werd geëxtraheerd met behulp van RIPA-lysisbuffer. Western blot-detectie werd uitgevoerd zoals eerder beschreven [37]. De antilichamen die in dit onderzoek werden gebruikt, werden hieronder vermeld:polyklonaal konijnenanti-Bcl-2 (abcam; ab59348), monoklonaal konijnenanti-Bax (abcam; ab32503), polyklonaal konijnenanti-P -PI3K (Bio-Vision; 3152-100), monoklonaal anti-P . van konijnen -AKT-S473 (CST; 4060S), konijn monoklonaal anti-β-actine (CST; 4970S), anti-konijn IgG HRP-gekoppeld antilichaam (CST; 7074S). Kwantificering werd bepaald met behulp van Image-J-software.
In vivo onderzoek naar het anti-NSCLC-effect van de combinatie van CoFe2 O4 en NIR-behandeling
Om het tumordodende vermogen van CoFe2 . te bepalen O4 -QD's, H460-cellen werden subcutaan geïmplanteerd met 50% MatriGel in NSG-muizen (N = 8 elke groep). 4-6 weken oude mannelijke M-NSG-muizen werden verkregen van Shanghai Model Organisms (#NM-NSG-001) voor alle in vivo experimenten. Toen de tumor werd gevisualiseerd en het volume bijna 5 mm × 5 mm bereikte, werden alle muizen willekeurig verdeeld in vier groepen, genaamd Controle, alleen NIR, CoFe2 O4 -Alleen QD's en CoFe2 O4 -QDs + NIR-groep, respectievelijk. Dan muizen in CoFe2 O4 -Alleen QD's en CoFe2 O4 -QDs + NIR-groep werden intratumoraal geïnjecteerd met 50 L CoFe2 O4 (5,0 mg/kg) op basis van ons eerdere werk [37], terwijl de controle- en NIR-groep werd geïnjecteerd met 50 μL PBS. Na injectie, NIR 808 nm-laser (1 W/cm 2 ) werd uitgevoerd in NIR en CoFe2 O4 -QDs + NIR-groep gedurende 10 minuten, die werd gevolgd door infrarood warmtebeeldapparatuur. Het tumorvolume werd elke dag geregistreerd en berekend met de formule V = lengte × breedte 2 /2. Zodra de diameter van tumorxenotransplantaten in de resterende muizen bijna 15 mm bereikte, werden de muizen opgeofferd en werden tumorxenotransplantaten gefotografeerd en bewaard voor verdere detectie. Alle dierproeven en protocollen zijn goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) en het Animal Welfare Committee van het Peking University Shenzhen Hospital.
H&E en immunohistopathologie kleuringsanalyse
Voor pathologische beoordeling kunnen de tumorxenotransplantaten (N = 3) werden één dag na behandeling in elke groep geoogst en vervolgens gefixeerd in 10% gebufferde formaline na ingebed in paraffine voor H&E-kleuring en IHC-detectie. Voor in vivo toxiciteitsevaluatie werden de nier, lever, long, hart en milt van de muizen geëxtraheerd en gefixeerd voor pathologische beoordeling. Voor IHC-kleuring werd anti-Ki67-antilichaam (Abcam; ab15580) gebruikt. Kwantificering van IHC-positief gebied werd uitgevoerd door software Fiji.
Statistische analyse
Voor alle experimenten geldt:"N ” staat voor het aantal herhaalde keren of het aantal gebruikte muizen zoals aangegeven in de legenda van de afbeelding. Studenten t -test of one-way ANOVA werd gebruikt voor statistische vergelijkingen. P < 0,05 wordt als statistisch significant beschouwd, terwijl "ns" niet-significant is. P < 0.05, P < 0.01 en P < 0,001 worden aangegeven met respectievelijk “*”, “**” en “***” sterretjes. Gegevens werden geanalyseerd met GraphPad Prism 5.
Resultaten
De kenmerken van Novel CoFe2 O4 -QD's
Ten eerste hebben we de CoFe2 . geconstrueerd O4 -QD's met behulp van hydrothermische benadering die goedkoop en eenvoudig uit te voeren is. De TEM-afbeelding van CoFe2 O4 -QD's werden getoond in figuur 1a, met een uniform en stabiel patroon met een diameter van ongeveer 3,4 nm (figuur 1b). De kant-en-klare CoFe2 O4 -QD's waren donkerbruin van kleur (Fig. 1b) en met een uitstekende oplosbaarheid in water. Verder toonde het TEM-beeld met hoge resolutie (Fig. 1c) dat de roosterafstand van (222) ongeveer 0,242 nm is, wat consistent is met de kristalparameters van CoFe2 O4 -QD's [38, 39]. Bovendien bevestigde het elementspectrum (Fig. 1d) verder de elementcomponent van de CoFe2 O4 -QDs is Co en Fe, en de atoomverhouding van Co en Fe was ongeveer 1:2. Deze gegevens toonden een succesvolle constructie van CoFe2 O4 -QD's voor ons verder onderzoek.
Bereiding en karakterisering van CoFe2 O4 -QD's. een Het representatieve TEM-beeld van de voorbereide CoFe2 O4 -QD's. Schaalbalk, 20 nm. b Een globale analyse van de grootte van CoFe2 O4 -QD's met een gemiddelde diameter van 3,4 nm. De inzet is de representatieve digitale foto van de CoFe2 O4 -QDs schorsing. c De roosterranden van voorbereide nanokristallen komen overeen met CoFe2 O4 -QDs HRTEM-afbeelding. Schaalbalk, 2 nm. d De kant-en-klare CoFe2 O4 -QD's vertoonden een uniforme verdeling van Co, Fe en O. De kaart met representatieve elementen werd getoond
De detectie van fysieke eigenschappen van CoFe2 O4 -QD's
Om de fysieke eigenschappen van bereide CoFe2 . te bepalen O4 -QD's, we hebben na de bouw verschillende detecties uitgevoerd. Met de NIR-absorptiebepalingstest, CoFe2 O4 -QD's toonden de juiste fotothermische conversie op een concentratieafhankelijke manier en de temperatuurverhogingen (ΔT ) kan worden ingesteld van 0,3 tot 18,9 °C (afb. 2a). Bovendien, bij de concentratie 1,0 mg/ml CoFe2 O4 -QD's, door het NIR-stralingsvermogen te verhogen van 0,5 naar 2,0 W/cm 2 , kan de ΔT worden afgesteld van 0,8 tot 24,3 ° C (Fig. 2b). Deze gegevens suggereerden dat de fotothermische conversieprestaties van CoFe2 O4 -QDs was afhankelijk van de concentratie en het bestralingsvermogen. Verder is de stabiliteit van CoFe2 O4 -QD's getriggerde fotothermische conversie werd bepaald met periodebestraling (figuur 2c). Hoewel de berekende licht-naar-warmte conversie-efficiëntie 7,18% was (Fig. 2d), is het voldoende om het PDT-effect van CoFe2 te versterken. O4 -QD's. Bovendien is de langste golflengte van CoFe2 O4 -QD's kunnen licht absorberen is ongeveer 808 nm (Fig. 2e, f). Alles bij elkaar suggereerden deze gegevens dat CoFe2 O4 -QD's zouden kunnen worden ontwikkeld tot een veelbelovend PTT/PDT-synergetisch middel voor alternatieve therapie voor het doden van tumoren.
De eigendomsevaluatie van CoFe2 O4 -QD's. een De fotothermische conversie van CoFe2 O4 -QD's werden bepaald onder verschillende concentraties. De stooklijnen worden weergegeven. b De bestralingsenergie-afhankelijke manier van CoFe2 O4 -QD's worden weergegeven bij verschillende vermogensdichtheden (0,5–2,0 W/cm 2 ). c CoFe2 O4 -QD's hebben stabiele fotothermische conversie gedetecteerd met 4 cycli van verwarming-koeling continue bestraling (1,0 W/cm 2 ). d De efficiëntie van CoFe2 O4 -QDs fotothermische conversie. e , v De relatie tussen golflengte en absorptie van CoFe2 O4 -QD's
Cytotoxiciteitsbeoordeling van CoFe2 O4 -QD's naar normale cellen
Aangezien nanodeeltjes veel worden gebruikt als medicijnafgifte of intra-medium voor tumortherapieën, is de cytotoxiciteit van CoFe2 O4 -QD's naar normale cellen, met name menselijke vasculaire epitheelcellen, moeten worden bevestigd voor verder gebruik. Daarom hebben we op basis van de eerdere resultaten verschillende concentraties (0,1, 0,5, 1,0 en 2,0 mg/ml) CoFe2 getest. O4 -QD's. Na co-cultuur met HUVEC's (normale menselijke epitheelcellijn), werd CCK-8-reagens toegevoegd voor de detectie van cellevensvatbaarheid. Er werd geen duidelijke cytotoxiciteit waargenomen in vergelijking met de controlegroep (figuur 3a). In deze context werd een verdere apoptose-assay uitgevoerd om consistente resultaten te bereiken onder dezelfde omstandigheden (figuur 3b). De kwantificering van de apoptose-snelheid gaf geen significant verschil aan in vergelijking met de controlegroep (figuur 3c). Uit deze gegevens bleek dat CoFe2 O4 -QD's hadden geen duidelijk toxisch effect op normale cellen, wat erop wees dat CoFe2 O4 -QD's hadden het potentieel om te worden gebruikt als intermedium voor medicijnafgifte.
In vitro beoordeling van cytotoxiciteit van CoFe2 O4 -QD's naar normale cellen. een De levensvatbaarheidstest van CCK-8 in HUVEC's werd uitgevoerd onder verschillende concentraties CoFe2 O4 -QD's. De levensvatbaarheid van de controlegroep werd als 100% genomen. De gegevens werden weergegeven als gemiddelde ± SD, N = 3. b HUVECs-apoptose werd bepaald door FACS-detectie. Representatieve afbeeldingen van aangegeven concentraties worden getoond, N = 3. c De kwantificering van de apoptose-ratio. Ze vertonen geen significantie in vergelijking met de controlegroep. De gegevens werden weergegeven als gemiddelde ± SD
Combinatie van NIR en CoFe2 O4 -QDs induceert apoptose van NSCLC
Om het potentiële NSCLC-kankerdodende vermogen van CoFe2 . te bepalen O4 -QD's, NIR-laserbestraling (808 nm) werd uitgevoerd in combinatie met incubatie van CoFe2 O4 -QD's in vitro. Vervolgens werd een apoptose-assay uitgevoerd na behandelingen, zowel H460- als A549-cellen vertoonden een agressieve apoptosesnelheid met de combinatie van CoFe2 O4 -QD's en NIR-laser (Fig. 4a, b). Kwantificering toonde een significant verschil in vergelijking met de controlegroep, terwijl CoFe2 O4 - Alleen QD's of alleen NIR-groepen vertoonden geen verschil, wat erop wees dat CoFe2 O4 -QD's plus NIR kunnen een anti-NSCLC-effect induceren (Fig. 4a, b). Het is algemeen bekend dat de verandering van het eiwitniveau van Bcl-2/Bax belangrijk is om te bepalen of de cellen apoptose zouden ondergaan [40]. In overeenstemming met dit idee werd het eiwitniveau van Bcl-2 en Bax bepaald in zowel H460- als A549-cellen na behandelingen (Fig. 4c, d). Zoals gerespecteerd, toonden de gegevens ook aan dat de verhouding van Bcl-2 / Bax afnam, wat werd beschouwd als de marker van door mitochondriën gemedieerde apoptose. Daarom hebben we voorgesteld dat CoFe2 O4 -QD's plus NIR geven aanleiding tot anti-NSCLC-effect door mitochondriën-gemedieerde apoptose-route te activeren.
In vitro combinatie van CoFe2 O4 -QD's en NIR induceren NSCLC-apoptose. een , b H460 en A549 NSCLC's werden behandeld met de combinatie van CoFe2 O4 -QD's en NIR-laser gedurende 5 minuten. De apoptotische cellen werden geëvalueerd door Annexin-V-kleuring en gedetecteerd door FACS. Kwantificering wordt respectievelijk ook getoond. De gegevens werden weergegeven als gemiddelde ± SD, N = 3. **P < 0,01 vs. controle, NIR, CoFe2 O4 groepen. c , d Het eiwitniveau van Bcl-2 en Bax werd na behandeling bepaald door middel van Western-blot-analyse in NCI-H460 en A549 NSCLC. Representatieve afbeeldingen worden getoond. De kwantificering wordt getoond na kalibratie naar de expressie van interne controle -actine. De gegevens werden weergegeven als gemiddelde ± SD, N = 3. *P < 0,05 vs. controle, NIR, CoFe2 O4 groepen
Combinatie van CoFe2 O4 -QD's en NIR induceren ROS-generatie via PI3K/AKT-route
Mitochondria-disfunctie leidt altijd tot een verhoogd niveau van ROS-generatie, wat celdood veroorzaakt bij NSCLC. In deze context hebben we ROS-detectie uitgevoerd na CoFe2 O4 -QD's plus NIR-behandeling in H460- en A549-cellen. De resultaten toonden aan dat een enorme afgifte van ROS in de combinatiegroep, wat aangaf dat een versterkt PDT-effect kon worden geïnduceerd door CoFe2 O4 -QD's zelfs met lage fotothermische transmissie-efficiëntie (aanvullend bestand 1:Fig. S1A, B). Bovendien was het gerelateerde eiwitniveau van de PI3K / AKT-signaleringsroute ook verlaagd, wat suggereerde dat de wijziging van ROS werd gereguleerd door de PI3K / AKT-route, wat leidt tot de wijziging van het Bcl-2 / Bax-eiwitexpressieniveau (Fig. 4c, d, Extra bestand 1:Fig. S1C, D). Om dit idee te bevestigen, werd de ROS-remmer NAC toegevoegd om het fenomeen om te keren (Fig. 5a, b). Vervolgens werd vastgesteld dat de expressie van PI3K/AKT werd gered na behandeling met NAC, wat verder bevestigde dat de ROS die vrijkwam na CoFe2 O4 -QD's plus NIR-behandeling werd gereguleerd door de PI3K / AKT-route (figuur 5c, d). Deze bevindingen ondersteunen sterk het idee dat de combinatie van CoFe2 O4 -QD's en NIR kunnen leiden tot een synergetisch PTT- en PDT-effect bij het doden van NSCLC-cellen door het induceren van mitochondriadisfunctie (ROS) afhankelijke apoptose.
De combinatie van CoFe2 O4 -QD's en NIR induceren ROS-generatie door de PI3K/AKT-route te reguleren. een , b NCI-H460 en A549 NSCLC's werden behandeld met de CoFe2 O4 -QD's en NIR-laser met of zonder NAC gedurende 5 min. Het ROS-niveau werd gedetecteerd door FACS en de gemiddelde fluorescentie-intensiteit werd respectievelijk gekwantificeerd. De gegevens werden weergegeven als gemiddelde ± SD, N = 3. **P < 0,01. c , d Het eiwitgehalte van P -PI3K en P -AKT werd bepaald door Western-blot-analyse. Representatieve afbeeldingen worden getoond, N = 3
In vivo anti-NSCLC-beoordeling van combinatie van CoFe2 O4 -QD's en NIR
Op basis van de in vitro resultaten hebben we vervolgens het anti-NSCLC-effect van CoFe2 . onderzocht O4 -QD's en NIR-combinatiebehandeling op NSCLC-tumordragend muizenmodel. M-NSG-muizen werden subcutaan geïmplanteerd met H460-cellen. Na intratumorale injectie met CoFe2 O4 -QD's, de NIR-laserbestraling veroorzaakte een snelle temperatuurstijging tot ongeveer 56 ° C onder de monitor van thermische detectieapparatuur (Fig. 6a, b). Bovendien vertoonde histopathologische kleuring een uitgebreid necrosegebied waargenomen in de combinatiegroep, wat aangeeft dat CoFe2 O4 -QD's plus NIR-behandeling veroorzaakten de dood van tumorcellen als gevolg van tumoreliminatie (Fig. 6c, d). Verdere IHC-kleuring toonde ook aan dat het Ki-67-positieve gebied agressief was gekrompen in vergelijking met andere groepen na de combinatiebehandeling, wat aangeeft dat de behandelde tumorxenotransplantaten niet langer konden prolifereren (aanvullend bestand 2:Fig. S2A, B). Vervolgens volgden we 12 dagen na CoFe2 O4 -QD's en NIR-behandeling. Zoals we verwachtten, groeiden de grootte en het gewicht van de tumorxenotransplantaten in andere groepen opmerkelijk, maar niet in de CoFe2 O4 -QD's en NIR-behandelingsgroep (Fig. 6e, f), ter ondersteuning van het idee dat CoFe2 O4 -QD's en NIR gecombineerde behandeling zouden de tumorxenotransplantaten in vivo volledig kunnen elimineren. Wat betreft het cytotoxische effect van CoFe2 O4 -QD's, althans in onze observatieperiode, werd geen duidelijk nadelig effect gedetecteerd uit de resultaten van histopathologische analyse in belangrijke organen van muizen (aanvullend bestand 2:Fig. S2C). De bovenstaande gegevens leverden sterk bewijs dat CoFe2 O4 -QD's zouden kunnen worden ontwikkeld als een nieuw PTT/PDT-reagens voor NSCLC-behandeling.
In vivo beoordeling van tumordoding van de combinatie van CoFe2 O4 -QD's en NIR-behandeling. een De representatieve infrarood thermische beelden van M-NSG-muizen met NCI-H460-tumorxenotransplantaten worden getoond. b De temperatuurcurve toont de toenemende temperatuur binnen tumorxenotransplantaten onder NIR-bestraling. c H &E pathologische kleuring van elke groep werd 1 dag na de behandeling gefotografeerd. Schijnbare necrose kon worden waargenomen in de combinatiegroep. Representatieve afbeeldingen worden getoond, N = 3. d De foto van de xenotransplantaten in elke groep nadat de muizen waren opgeofferd, N = 5. e , v De groeicurve en het gewicht van tumorxenotransplantaten in elke groep werd geregistreerd. De gegevens werden weergegeven als gemiddelde ± SD, N = 5.***P < 0,001
Discussie
In de afgelopen jaren heeft het onderzoek naar de ontwikkeling van anti-NSCLC-strategieën enorme vooruitgang geboekt. Zowel het precisiegeneesmiddel gericht op specifieke mutante oncogen-verslaafde NSCLC als therapieën voor het blokkeren van immuuncheckpoints zorgen voor een veelbelovende toekomst in klinische behandelingen [41, 42]. Gezien de complexiteit en heterogeniteit van de micro-omgeving van tumoren en het onderliggende risico om tumorantigeen te verliezen, blijft het echter een knelpunt om de resistentie tegen geneesmiddelen te verlagen na de immuunontwijkende status, wat leidt tot een terugval van de tumor in een korte tijd. Daarom is het dringend noodzakelijk om naar nieuwe behandelingen of intermedia voor NSCLC-therapieën te zoeken. Onder de opkomende benaderingen zijn nanomaterialen gewaardeerd en vermeld als effectieve kankerdodende middelen. Door gebruik te maken van hun kleine formaat, goede biocompatibiliteit en thermische transmissiecapaciteiten, oefenen verschillende nanomaterialen in recente onderzoeken uitstekende kankerdodende eigenschappen uit [43].
In onze studie ontwikkelden we een nieuwe CoFe2 O4 -QD's die kunnen worden toegepast als intermedia voor NSCLC-behandelingen via het induceren van apoptose van tumorcellen met synergetische PTT- en PDT-effecten. Net als andere nanomaterialen, CoFe2 O4 -QD's vertoonden uitstekende biocompatibiliteit in onze onderzoeken die geen duidelijke toxiciteit vertoonden voor normale cellen en belangrijke organen. Hoewel we ontdekten dat de thermische transmissiesnelheid niet hoog is in vergelijking met andere nanomaterialen, is het genoeg voor CoFe2 O4 -QD's om apoptose van kankercellen te induceren onder de NIR-laseractivering. CoFe2 O4 -QD's vertonen een goede lineaire relatie met de lichtabsorptie in deze studie en genereren mogelijk ROS met de combinatie van NIR-laser, wat verder bewijst dat CoFe2 O4 -QD's kunnen fungeren als bevoorrechte fotosensibilisator. Vervolgens kunnen we de structuur verder optimaliseren of thermisch gevoelige elementen toevoegen aan CoFe2 O4 -QD's die een hogere thermische transmissiesnelheid zouden kunnen bereiken voor betere synergetische PTT- en PDT-effecten [44, 45]. Bovendien, het aanbrengen van chemische medicijnen of antilichamen op het oppervlak van CoFe2 O4 -QD's zijn ook mogelijk, wat een superieure moordefficiëntie kan opleveren. Bijvoorbeeld de benadering van het koppelen van anti-PDL1- of anti-CTLA4-antilichamen aan CoFe2 O4 -QD's kunnen een veelbelovende combinatietherapie zijn bij het doorbreken van de immuunonderdrukkende micro-omgeving in tumoren, wat onze volgende interesse is om volledig gebruik te maken van CoFe2 O4 -QD's.
Trouwens, het mechanisme van CoFe2 O4 -QD's bij het doden van NSCLC werden ook opgehelderd in deze studie. We hebben bevestigd dat CoFe2 O4 -QD's induceerden NSCLC-apoptose voornamelijk door ROS-secretie na NIR-laser geactiveerde synergetische PDT- en PTT-effecten. Overmatige ROS-generatie veroorzaakt oxidatieve stress van tumorcellen en veroorzaakt direct DNA-schade, die op hun beurt stroomafwaartse signaalroutes activeren en vervolgens de dood van tumorcellen induceren [46, 47]. Waarvan toenemend bewijs heeft aangetoond dat de PI3K/AKT-route kan worden gereguleerd door cellulaire ROS en leidt tot disfunctie van mitochondriën [48, 49]. Het is algemeen aanvaard dat AKT na activering wordt gefosforyleerd door PI3K en daarom het pro-apoptotische eiwit Bax inactiveert en cellen beschermt tegen apoptose. Bovendien is gefosforyleerd AKT ook in staat om het MDM2/p53-complex te stabiliseren, dat de celoverleving reguleert [50]. In deze context is de rol van een dergelijke route in CoFe2 O4 - Door QD's geïnduceerde ROS-secretie werd onderzocht. Zoals verwacht, ontdekten we dat overmatige ROS veroorzaakt door CoFe2 O4 -QD's reguleerden significant de expressie van PI3K/AKT-routes en veroorzaakten daarom apoptose van tumorcellen via het activeren van Bax maar het inactiveren van het Bcl-2-eiwit. Deze bevinding werd verder bevestigd door toevoeging van ROS-remmer, die de PI3K/AKT-expressie omkeerde en de productie van ROS verminderde. Aangezien bekend is dat de PI3K/AKT-route de overleving en dood van cellen reguleert, vooral in kankercellen, is het begrijpen van dergelijke mechanismen van CoFe2 O4 -QD's bij het doden van NSCLC zouden ons helpen meer opties voor combinatietherapieën te ontwikkelen.
Samenvattend, om nieuwe fotosensitizers voor alternatieve tumordodingstherapie te ontwikkelen, hebben we met succes CoFe2 geconstrueerd O4 -QD's door hydrothermische benadering op een goedkope en gemakkelijke manier te gebruiken in deze studie. De CoFe2 O4 -QD's hebben een brede NIR-absorptie, goede biocompatibiliteit en fotothermisch conversievermogen. Bovendien, vergeleken met eerder gerapporteerde QD's, CoFe2 O4 -QD's vertoonden een synergetisch PTT/PDT-effect bij het doden van NSCLC-tumoren, die een veelbelovend multifunctioneel middel vertegenwoordigen bij verdere fototherapieën van NSCLC. Bovendien, met de NIR-bestraling, CoFe2 O4 -QD's kunnen NSCLC voornamelijk doden door ROS-generatie te induceren via het reguleren van Bcl-2 / Bax-expressie via de stroomopwaartse PI3K / AKT-signaleringsroute. Wat betreft het vermogen om tumoren in vivo te doden, CoFe2 O4 -QD's in combinatie met NIR zouden de NSCLC-tumorxenotransplantaten volledig kunnen elimineren zonder duidelijke toxische effecten. Deze bevindingen bewijzen dat CoFe2 O4 -QDs bezit veelbelovende toepassingen die moeten worden ontwikkeld als een nieuw NSCLC-dodingsreagens.
Conclusie
Al met al, CoFe2 O4 -QD's die we hebben gesynthetiseerd, kunnen superieure PTT/PDT-synergetische effecten vertonen bij het onderdrukken van NSCLC door ROS-generatie te induceren via het reguleren van de PI3K/AKT-route, die licht werpen op het mechanismeonderzoek en toepassingen van nieuwe fotosensitizers.
Beschikbaarheid van gegevens en materialen
De gegevens die de bevindingen van deze studie ondersteunen, zijn op redelijk verzoek verkrijgbaar bij de corresponderende auteur.
Nanomaterialen
- Nanodeeltjes voor kankertherapie:huidige vooruitgang en uitdagingen
- BSA-gecoate gouden nanostaafjes voor NIR-II fotothermische therapie
- N,N-dimethylformamide die de fluorescentie van MXene Quantum Dots reguleert voor de gevoelige bepaling van Fe3+
- Op cellen gebaseerde medicijnafgifte voor kankertoepassingen
- Verkenning van Zr–Metal–Organic Framework als efficiënte fotokatalysator voor waterstofproductie
- Synthese en in vitro prestaties van met polypyrrool gecoate ijzer-platina nanodeeltjes voor fotothermische therapie en foto-akoestische beeldvorming
- Biocompatibel 5-aminolevulinezuur/Au met nanodeeltjes geladen ethosomale blaasjes voor in vitro transdermale synergetische fotodynamische/fotothermische therapie van hypertrofische littekens
- Aptamer-gemodificeerde magnetische nanosensitizer voor in vivo MR-beeldvorming van HER2-expressie van kanker
- Eenvoudige synthese van polydopamine-koolstofstippen voor fotothermische therapie
- Carbon Dots @ Platinum Porphyrin Composite als theranostic nanoagent voor efficiënte fotodynamische kankertherapie
- Tumorgerichte en biocompatibele MoSe2 Nanodots@Albumin-nanosferen als een middel voor dual-modaliteit therapie voor synergetische fotothermische radiotherapie