BSA-gecoate gouden nanostaafjes voor NIR-II fotothermische therapie

Resultaten en discussie

Synthese en karakterisering van AuNR@CTAB

Het bleek dat hoe kleiner de gouden nanostaafjes, hoe beter de farmacokinetiek en hoe lager de cytotoxiciteit [18]. De SPR-absorptiepiek van gouden nanostaafjes is echter sterk gerelateerd aan de beeldverhouding, hoe groter de beeldverhouding, hoe lager de energie van de SPR-piek. Om AuNR met een grote aspectverhouding te synthetiseren en ondertussen de grootte zo klein mogelijk te houden, werden de syntheseparameters geoptimaliseerd, zoals de oppervlakteactieve stofconcentratie, de pH van de groeioplossing en de reductiemiddelconcentratie. De NaBH₄ (aq) is een soort sterk reductiemiddel dat Au-kern vormt via LaMer-burst-kiemvorming, gevolgd door snelle willekeurige aanhechting van Au-ionen en rijping binnen de deeltjes [19]. Als de molhoeveelheid NaBH₄ toenemend, ondergaat de maximale absorptiepiek van gouden nanostaafjes een blauwe verschuiving van 1223 naar 865 nm (figuur 1C). De pH van de groeioplossing is ook een belangrijke parameter om de groei van gouden nanostaafjes te beheersen, die wordt aangepast via de hoeveelheid zoutzuur [20]. De maximale absorptiepiek van gouden nanostaafjes bleek geleidelijk in het rood te verschoven van 871 naar 1070 nm, terwijl de hoeveelheid zoutzuur toenam (figuur 1D). Verder, Ag ⁺ wordt geacht in staat te zijn de groeirichting van gouden nanostaafjes te regelen, en hoe lager de Ag ⁺ concentratie kon de langere absorptiegolflengte van de SPR-piek worden gerealiseerd (figuur 1E). Uiteindelijk zijn de gesynthetiseerde gouden nanostaafjes in wijnrood, zoals weergegeven in figuur 1B. Daarom hebben we, gezien de synthese-efficiëntie van gouden nanostaafjes en de beschikbaarheid van laserlichtbronnen, gekozen voor gouden nanostaafjes met een maximale absorptiepiek bij 1064 nm voor fotothermische behandeling van tumoren.

De foto-eigenschappen van AuNR@CTAB bij verschillende syntheseomstandigheden. een De voorbereiding van AuNR@CTAB. b Het beeld van met CTAB gecoate gouden nanostaafjes (AuNR@CTAB), c UV–vis-spectra van geprepareerde AuNR@CTAB met variërende NaBH₄ concentratie, d UV–vis-spectra van bereid AuNR@CTAB met variërende HCl-concentratie e UV–vis-spectra van geprepareerde AuNR@CTAB met variërende AgNO₃ concentratie

Synthese en karakterisering van AuNR@BSA

Cetyltrimethylammoniumbromide (CTAB) is de meest gebruikte verbinding voor de synthese van gouden nanostaafjes met precieze lengtes en aspectverhoudingen. CTAB heeft echter een significante cytotoxiciteit wanneer de concentratie hoger is dan 1-10 μM. De toepassing van de met CTAB gecoate gouden nanostaafjes (AuNR@CTAB) in de biogeneeskunde is sterk beperkt [21]. Bovendien wordt de colloïdale stabiliteit van met CTAB gecoate gouden nanostaafjes in waterige oplossing dramatisch beïnvloed door de temperatuur, die gemakkelijk te kristalliseren is bij lage temperaturen [22]. Gezien het verminderen van de cytotoxiciteit van CTAB en het verbeteren van de stabiliteit, zijn er verschillende benaderingen voorgesteld om CTAB te vervangen tijdens het syntheseproces van gouden nanostaafjes of om de met CTAB gecoate gouden nanostaafjes te functionaliseren. Met behulp van polymeren, peptiden, oppervlakteactieve stoffen en lipiden om het oppervlak van nanodeeltjes te modificeren, gebruiken de meeste van deze strategieën gethioleerde moleculen of elektrostatische interactiekrachten om aan het goudoppervlak te binden [23]. Eiwitten zijn de meest veelbelovende opties als de voordelen van colloïdale stabiliteit, biocompatibiliteit en verdere functionalisering. [26]

De met CTAB en BSA omhulde gouden nanostaafjes zijn afgebeeld in figuur 2A. De maximale absorptiepiek van AuNR@BSA is ongeveer 1064 nm, wat ongeveer 30 nm roodverschoven is in vergelijking met die van AuNR@CTAB (Fig. 2B). Het zeta-potentieel van de gouden nanostaafjes veranderde van positief naar negatief door de CTAB-coating te vervangen door BSA (aanvullend bestand 1:Fig. S1). Uit de FTIR-spectra van de AuNR@BSA en AuNR@CTAB (aanvullend bestand 1:Fig. S2) konden we vinden dat twee karakteristieke pieken van 1649 cm ⁻¹ en 1539 cm ⁻¹ in het geval van AuNR@BSA, die werden toegeschreven aan de amide I- en amide II-trillingsbanden van BSA. De dynamische lichtverstrooiing (DLS) werd ook toegepast om de hydrodynamische grootte van de AuNR@CTAB en AuNR@BSA te analyseren; verder werd de morfologie van AuNR@BSA en AuNR@CTAB gekarakteriseerd door transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) zoals weergegeven in Fig. 2C, D. Twee pieken konden duidelijk worden gevonden uit de meting van de verstrooiingsintensiteit van DLS, één met een hydrodynamische grootte van ongeveer 3,10 ( ± -0,85) nm en de andere ongeveer 57,45 (± -24,22) nm voor AuNR@CTAB. In het geval van AuNR@BSA verschuiven de pieken echter naar 8,64 (±-3,80) nm en 89,24 (± 42,24) nm. We konden ontdekken dat de vorm van AuNR vergelijkbaar blijft na het coaten met BSA, behalve dat de uiteinden enigszins afgerond worden (Fig. 2C, D). Voor in-vivotherapietoepassingen is de kritische grootte van nanodeeltjes beperkt tot minder dan 100 nm [25]. Boven deze grootte zal het vermogen van nanodeeltjes om tumoren te penetreren beperkt zijn; daarom zouden de gepresenteerde gouden nanostaafjes een ideale kandidaat voor tumortherapie zijn [24]. Zoals getoond in aanvullend bestand 1:Fig. S3, kunnen de karakteristieke pieken van Au duidelijk worden waargenomen in het XRD-patroon, van de (111), (200), (220) en (311) vlakken van Au-nanodeeltjes.

Karakterisering van AuNR@BSA en AuNR@CTAB. een Voorbereiding van AuNR@BSA. b UV–Vis-spectra van AuNR@CTAB (L) en AuNR@BSA (R). c De DLS-intensiteitsmeting van AuNR@CTAB en AuNR@BSA. d De TEM-afbeeldingen van AuNR@CTAB en AuNR@BSA

In Vitro Fotothermisch effect van gouden nanostaafjes

De 1064 nm diodelaser als de meest economische NIR-II-lichtbron wordt beschouwd als de optimale golflengte voor fotothermische therapie. Daarom wordt het ideale NIR-II gouden nanoplatform voor efficiënte fotothermische therapie beschouwd als een sterke SPR-absorptie bij 1064 nm, hoge fotothermische efficiëntie en uitstekende fotothermische stabiliteit. Om het fotothermische effect van de bereide AuNR@BSA te onderzoeken, werden PBS en verschillende OD (= 0,5, 1, 1,5, 2) van AuNR@BSA geëxciteerd bij 1064 nm met een lichtintensiteit van 0,35 tot 1 W/cm ² gedurende 30 min. Een temperatuurbeeldcamera werd gebruikt om de temperatuurveranderingen om de 5 minuten vast te leggen, zoals weergegeven in Fig. 3A. Het fotothermische effect van AuNR@BSA en AuNR@CTAB met dezelfde absorptie (OD = 1) is significant hoger dan dat van PBS. We konden zien dat de temperatuur in de eerste 5 minuten snel steeg en vervolgens de rest van de tijd op ongeveer 80 ° C bleef, zoals geïllustreerd in figuur 3A. De door fotothermische geïnduceerde temperatuurstijging voor PBS wordt meestal veroorzaakt door de boventoonabsorptie van water bij 1064 nm. De maximale temperatuur als functie van de lichtintensiteit is weergegeven in figuur 3B. Er werd gevonden dat de foto-geïnduceerde thermische temperatuur van AuNR@CTAB en AuNR@BSA bij een absorptie van ongeveer 1 evenredig is met de lichtintensiteit. De temperatuurstijging is veel sneller voor AuNR@CTAB en AuNR@BSA dan die van PBS naarmate de laserintensiteit hoger wordt. Bovendien laat figuur 3C zien dat onder dezelfde bestralingsomstandigheden (1064 nm, 0,75 W/cm ² ), wordt de maximale fotothermische temperatuur dramatisch verhoogd naarmate de absorptie van beide AuNR toeneemt. De fotothermische eigenschappen van met BSA gecoate AuNR zijn iets beter dan die van met CTAB gecoate. Er is geen significante verandering in de maximale fotothermische temperatuur van AuNR@BSA (OD = 1, 61,1 °C) binnen drie bestralingscycli (0,5 W/cm ² , 10 min), wat de uitstekende fotothermische stabiliteit van de bereide AuNR@BSA aangeeft (Fig. 3D). Figuur 3E toont het fotothermische temperatuurbeeld van AuNR@CTAB (OD = 1), AuNR@BSA (OD = 1) en PBS onder laserbestraling gedurende 10 minuten. De maximale temperatuur van PBS is 44,5 ° C, terwijl de maximale temperatuur van de AuNR zo hoog is als 85,5 ° C. De bovenstaande resultaten toonden aan dat de gesynthetiseerde AuNR@BSA geschikte absorptie-eigenschappen, fotothermische conversie-efficiëntie en fotostabiliteit in het NIR-II-bereik bezit als een uitstekend fotothermisch therapeutisch middel.

In vitro evaluatie van het fotothermische effect van AuNR@BSA. een De fotothermische temperatuur van AuNR@BSA en AuNR@CTAB als functie van de bestralingstijd van de laser (SPR-absorptie ongeveer 1, 1064 nm, 1 W/cm ² ). b Door NIR geactiveerde temperatuurverhoging van PBS, AuNR@CTAB (OD = 1) en AuNR@BSA (OD = 1) als functie van de intensiteit van de laserstraling (1064 nm, 0,35 tot 1 W/cm ² ). c NIR-geactiveerde temperatuurverhoging van AuNR@BSA en AuNR@CTAB met verschillende absorptie voor 10 min laserbestraling (1064 nm, 1 W/cm ² ). d Fotothermische conversie van AuNR@BSA (OD = 1) onder drie bestralingscycli (1064 nm, 0,5 W/cm ² ). e Warmtebeeld van PBS, AuNR@CTAB (OD = 1), AuNR@BSA (OD = 1) onder bestraald met NIR-laser (1064 nm, 1 W/cm ² ) met een tijdsinterval van 5 en 10 min. (gemiddelde ± SD, n = 3)

In Vitro Cytotoxiciteit en fotothermische toxiciteit van gouden nanostaafjes

De CCK-8-analyse werd uitgevoerd om de cytotoxiciteit van AuNR@CTAB en AuNR@BSA op 4T1-cellen bij verschillende concentraties te kwantificeren. Zelfs zonder laserbestraling vertoont de AuNR@CTAB al significante cytotoxiciteit bij zeer lage concentraties (absorptie ongeveer 0,05), waardoor de biologische toepassing ervan sterk wordt beperkt. De AuNR@BSA vertoont echter uitstekende biologische toepassingsvooruitzichten, de levensvatbaarheid van de cellen is bijvoorbeeld nog steeds in het acceptabele bereik, aangezien de AuNR@BSA-absorptie ongeveer 1 bereikt (Fig. 4A). Aangemoedigd door de veelbelovende stabiliteit en hoge fotothermische conversie-efficiëntie van AuNR@BSA, werd de fotothermische toxiciteit in vitro uitgevoerd op 4T1-tumorcellen met een lichtintensiteit van ongeveer 0,75 W/cm ² gedurende 10 min. Significante fotothermische toxiciteit werd gevonden bij een absorptie van ongeveer 1 met een celoverlevingspercentage van ongeveer 20%; er werd echter ongeveer 100% celoverleving gevonden voor niet-stralingsexperimenten (Fig. 4B, Aanvullend bestand 1:Fig. S4). Deze in vitro resultaten geven aan dat AuNR@BSA fotothermische behandeling in het NIR-II-gebied kankercellen effectief zou kunnen doden bij een relatief hoge stralingsintensiteit.

In vitro cytotoxiciteit en fotothermische toxiciteit van gouden nanostaafjes. een Levensvatbaarheid van de cellen van 4T1-cellen geïncubeerd met verschillende concentraties AuNR@CTAB en AuNR@BSA. b Cellevensvatbaarheid van 4T1-cellen geïncubeerd met verschillende concentraties AuNR@BSA zonder en met NIR-laserbestraling (1064 nm, 0,75 W/cm ² , 10 minuten). (gemiddelde ± SD, n = 3)

In vivo Biodistributie-onderzoeken

De bloedcirculatietijd is essentieel voor de succesvolle levering van op nanodeeltjes gebaseerde medicijnen [24]. De bloedcirculatietijd van AuNR@BSA werd gevolgd door de Au-concentratie via ICP-OES en bleek ongeveer 1,5 uur te zijn (halfwaardetijd) (Fig. 5A). De in vivo biodistributie van AuNR@BSA werd ook gemeten door de Au-concentratie in verschillende organen (Aanvullend bestand 1:Fig. S5). Zoals getoond in Fig. 5B, waren AuNR@BSA sterk geaccumuleerd in lever en milt na 24 uur intraveneuze injectie vanwege hun sterke fagocytose als een orgaan van het reticuloendotheliale systeem (RES) [27, 28]. Deze resultaten laten zien dat AuNR@BSA zich effectief kan ophopen in lever en milt. AuNR@BSA heeft potentiële toepassingen bij lever- en miltgerelateerde ziekten.

De biodistributie van AuNR@BSA in bloed en organen. een De Au-concentratie in het bloed als functie van de tijd via intraveneuze injectie van AuNR@BSA. b De biodistributie van AuNR@BSA in verschillende organen

In Vivo Nabij-infrarood fotothermische behandeling van gouden nanostaafjes

De uitstekende fotothermische prestaties van AuNR@BSA moedigen ons aan om de in vivo fotothermische therapie op tumordragende BALB/c-muizen voort te zetten. AuNR@BSA werd in situ in de tumor geïnjecteerd en 10 min later werd het licht geïntroduceerd voor fotothermische therapie (1064 nm, 0,75 W/cm ² ). De in vivo temperatuurvariatie werd gevolgd door een warmtebeeldcamera. De temperatuurveranderingen voor en na de behandeling zijn weergegeven in Fig. 6D. De temperatuur van de tumorplaats was ongeveer 63,9 ° C binnen 10 minuten na bestraling en hield weinig fluctuatie bij deze temperatuur (Fig. 6D). Daarentegen is er geen waarneembare temperatuurverandering voor de controlegroep in dezelfde bestralingsconditie (AuNR@BSA-groep, PBS-groep, lasergroep). Na fotothermische therapie werden het tumorvolume en het lichaamsgewicht van muizen 14 dagen lang om de twee dagen gecontroleerd. Zoals weergegeven in Fig. 6A, B, werd de tumor van de AuNR@BSA_laser-groep volledig geremd en achtergelaten als verbrande korsten op de locatie van de oorspronkelijke tumorplaats, terwijl die van de controlegroepen relatief snel groeide en uit de hand liep (AuNR@BSA-groep, PBS-groep, lasergroep). De korstjes zijn de verbrande huid, die direct bewijzen dat het PPT-proces overmatige lokale warmte op de tumorplaats kan veroorzaken met geïnjecteerde AuNR@BSA. Het fotothermische effect is zeer efficiënt, aangezien we hebben waargenomen dat de solide tumoren in de AuNR@BSA + laser-groep twee dagen na de behandeling snel afnemen. Om de tumorveranderingen na behandeling verder vast te leggen, werden aan het einde van de observatie van de 14 dagen de muizen gedood en werden de tumoren geïsoleerd. Zoals getoond in Fig. 6C, was de tumorgrootte van de AuNR@BSA_laser-behandelingsgroep volledig onderdrukt, terwijl alle andere groepen ongecontroleerde groei bleken te zijn. Afbeeldingen van muizen uit de groep (AuNR@BSA + laser) lieten zien dat tumoren niet doorgroeiden na 14 dagen behandeling (Fig. 6E). Daarom, gezien het ideale therapeutische vermogen en geen duidelijke cytotoxiciteit, is AuNR@BSA voor nabij-infrarood tweede venster laserbestralingstherapie een ideale kandidaat voor door licht getriggerde PTT in vivo. Dit toont duidelijk aan dat eenvoudige hyperthermie met de huidige NR-II-therapie de tumorgroei effectief kan remmen (aanvullend bestand 1).

Fotothermische behandeling van tumordragende muizen. een Tumorvolume als functie van tijd onder verschillende behandelingscondities. b Veranderingen in lichaamsgewicht van muizen met tumoren als functie van de tijd, na de behandeling. c Foto's van tumorweefsels in verschillende groepen na 14-daagse behandeling. d Infrarood thermografische beelden van tumordragende muizen blootgesteld aan een laser van 1064 nm (0,75 W/cm ² , 10 min) op 10 min post-intratumorale injectie van AuNR@BSA. e Afbeeldingen van muizen uit de AuNR@BSA_laser-groep na behandeling. (gemiddelde ± SD, n = 2)

Bovendien werd TEM genomen voor de geïsoleerde tumor na fotothermische behandeling en de onbehandelde tumor. De AuNR kon worden waargenomen in het tumorweefsel na fotothermische behandeling. Het leverde verder bewijs dat gouden nanostaafjes nog steeds een uitstekende fotostabiliteit hebben in de omgeving van tumorweefsel (Fig. 7).

Transmissie-elektronenmicrofoto van AuNR@BSA in tumorweefsel a Behandelde tumor. b Onbehandelde tumor