Bovine Serum Albumine-Gecoate Goudnanostaven Stellen Lage-Dosis NIR-II Fotothermale Therapie Toe

Samenvatting

Het tweede nabij-infrarood (NIR-II, 1000–1300 nm) venster biedt ongekende weefselpenetratie, wat het positioneert als het ideale optische regime voor beeldvorming en fotothermale therapie. Het produceren van goudnanostaven die in deze band absorberen terwijl ze lage cytotoxiciteit behouden, blijft echter uitdagend. We ontwikkelden een reeks hoog-aspectratio goudnanostaven met robuuste oppervlakteplasmonresonantie over het NIR-II-venster. Coating van deze nanostaven met bovine serum albumine (BSA) verbeterde hun biocompatibiliteit dramatisch zonder de optische prestaties te compromitteren. In een borstkanker-muismodel bereikten de BSA-gecoate nanostaven complete tumorablatie met een bescheiden NIR-II laserintensiteit van slechts 0,75 W cm⁻². Deze resultaten bevestigen dat lage-dosis NIR-II fotothermale therapie haalbaar is met groot-aspectratio goudnanostaven.

Inleiding

Goudnanodeeltjes (AuNPs) zijn opgedaan als veelzijdige agentia in biomedisch onderzoek door hun uitzonderlijke biocompatibiliteit en lage cytotoxiciteit. Hun hoge X-straal attenuatie maakt ze aantrekkelijk voor computed tomography (CT) tumorbeeldvorming, terwijl hun uitgesproken oppervlakteplasmonresonantie (SPR) efficiënte foton-naar-warmte conversie mogelijk maakt voor fotothermale therapie (PTT). AuNPs met afstelbare grootte en morfologie – nanostaven, nanoshells, nanokooien – zijn afgestemd voor kankerablatie, met name goudnanostaven (AuNRs) wiens anisotropie sterke NIR-absorptie en fotothermale stabiliteit biedt. NIR-licht penetrateert weefsels dieper dan zichtbaar licht, en langere golflengtes ervaren minder verstrooiing. Staafvormige deeltjes vertonen ook verbeterde tumorpermeabiliteit en verlengde circulatie, wat accumulatie verhoogt. Conventionele PTT vereist echter vaak hoge-vermogen lasers, met risico op bijschade. Het NIR-II-venster biedt diepere penetratie en lagere verstrooiing dan NIR-I, wat effectieve therapie bij lagere laserintensiteiten mogelijk maakt. Het produceren van AuNRs die in NIR-II absorberen terwijl ze biocompatibel blijven, is echter moeilijk. Hier rapporteren we een zaadloze synthese van AuNRs met absorptiepieken bij 1000–1300 nm, gevolgd door BSA-coating om cytotoxiciteit te reduceren. We evalueren hun fotothermale prestaties in vitro en in vivo, en tonen tumorablatie in een borstkanker-muismodel met een laserintensiteit van slechts 0,75 W cm⁻².

Materialen en Methoden

Materialen

Goudchloride trihydraat (HAuCl₄·3H₂O, 99,9 %), hexadecyltrimethylammoniumbromide (CTAB, 99 %), salpeterzuur (GR 65–68 %), waterstofperoxide (30 %), natriumborohydride (NaBH₄, 97 %), zilvernitraat (AgNO₃, 99,8 %), zoutzuur (38 %), hydrochinon (99 %), bovine serum albumine (BSA, 98 %) werden bezorgd door Shanghai Aladdin Biological Technology Co. Ltd. RPMI 1640, Penicilline-Streptomycine, PBS, foetaal kalverseum (FBS), 4T1-cellen en Cell Counting Kit-8 (CCK-8) werden verkregen van HyClone, Corning, Gibco en Dojindo respectievelijk. Ultrazuiver water (Millipore) werd doorheen gebruikt.

Bereiding van AuNR@CTAB

AuNRs werden gesynthetiseerd via een zaadloos protocol. Kortweg, 0,4 mL 10 mM HAuCl₄ en 10 mL 0,1 M CTAB werden gecombineerd met 23–33 µL 100 mM AgNO₃. Vervolgens werd 10–30 µL 1,2 M HCl en 525 µL 0,1 M hydrochinon toegevoegd, wat een licht-gele groeistoplossing opleverde. Na 15 min roeren, werd 10–40 µL vers bereide 10 mM ijskoude NaBH₄ geïnjecteerd, gevolgd door 30 s roeren en 18 u veroudering bij kamertemperatuur. AuNR@CTAB werd gezuiverd door twee PBS-wassingen.

Bereiding van AuNR@BSA

CTAB-concentratie in AuNR@CTAB werd aangepast tot 1 mM en gesonicateerd om volledig op te lossen. 3 mL AuNR@CTAB werd gemengd met 3 mL 10 mg mL⁻¹ BSA en 30 min gesonicateerd. Na centrifugatie (9500 × g, 40 min) werd het pellet heropgelost in 6 mL 5 mg mL⁻¹ BSA, pH aangepast tot 11–12 met 2 M NaOH, en ≥18 u geroerd. De finale AuNR@BSA werd gezuiverd door twee PBS-wassingen en in PBS opgeslagen.

Karakterisering

Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM, Talos F200X) beoordeelde morfologie; dynamische lichtverstrooiing (DLS, Zetasizer Nano ZS) meet grootte en zetapotentiaal; UV-Vis spectroscopie (Shimadzu UV-2700) registreerde absorptie. In vivo tumordistributie werd onderzocht door TEM van geëxciseerde tumorsecties post-injectie. FT-IR en XRD analyses bevestigden BSA-coating en kristallijn goud respectievelijk.

Fotothermale Prestaties

AuNR-oplossingen (OD = 0,5–2 bij 1064 nm) werden bestraald met een 1064 nm laser (0,35–1 W cm⁻²) gedurende 30 min, en temperatuurveranderingen werden gemonitord door infrarood thermische beeldvorming (FLUKE TI25). Fotostabiliteit werd geëvalueerd door herhaalde 10 min aan/uit bestralingscycli bij 0,5 W cm⁻².

In Vitro Cytotoxiciteit

4T1-cellen werden gezaaid in 96-putplaten (5 × 10³ cellen put⁻¹) en 24 u geïncubeerd. AuNR@CTAB of AuNR@BSA (10 µL) werd toegevoegd bij variërende concentraties, gevolgd door 24 u incubatie. CCK-8 (10 µL) werd toegevoegd, 40 min geïncubeerd, en absorbantie gemeten bij 450 nm. Fototoxiciteitsassays omvatten 1064 nm bestraling (0,75 W cm⁻², 10 min) voor de CCK-8 test.

Dierstudies

Vrouwelijke BALB/c muizen (6–8 weken) werden subcutaneus geïnculeerd met 2 × 10⁶ 4T1-cellen. Toen tumoren ~100 mm³ bereikten, begonnen experimenten. Alle procedures volgden institutionele ethische richtlijnen.

In Vivo Biodistributie en Circulatie

AuNR@BSA (200 µL) werd via de staartvlieg geïnjecteerd. Bloedmonsters werden verzameld bij 0,25, 2, 4, 6, 8, 12, 36 en 48 u, verteerd met HNO₃ en H₂O₂, en Au-gehalte gekwantificeerd door ICP-OES. Organen (hart, lever, milt, long, nier) werden 24 u post-injectie gehaald, verteerd en Au-concentraties op dezelfde manier gemeten.

Fotothermale Behandelingsefficiëntie

Muizen werden verdeeld in vier groepen: (1) AuNR@BSA, (2) AuNR@BSA + laser, (3) alleen laser, (4) controle. AuNR@BSA (200 µL) werd intratumoraal geïnjecteerd, gevolgd 10 min later door 1064 nm bestraling (0,75 W cm⁻², 10 min). Tumortemperatuur, volume en lichaamsgewicht werden 14 dagen gemonitord. Tumor werden aan het einde van de studie geëxciseerd.

Data-analyse

Statistische analyses werden uitgevoerd met SPSS 16.0. Data worden uitgedrukt als gemiddelde ± SD; significantie ingesteld op p < 0,05.

Resultaten en Discussie

Synthese en Karakterisering van AuNR@CTAB

Optimalisatie van NaBH₄, HCl en Ag⁺ concentraties maakte controle over aspectratio en SPR-piekpositie mogelijk. Toename van NaBH₄ blauwde de piek van 1223 tot 865 nm, terwijl hogere HCl de piek roodverschoof van 871 tot 1070 nm. Vermindering van Ag⁺ concentratie verlengde de SPR-piek verder. De finale AuNRs vertoonden een wijnrode kleur en een absorptiemaximum bij 1064 nm (Fig. 1). Deze golflengte past in het NIR-II-venster en komt overeen met beschikbare laserbronnen.

Figuur 1. Fotogene eigenschappen van AuNR@CTAB onder variërende synthesecondities: (a) bereidingsschema; (b) TEM-afbeelding; (c) UV-Vis spectra versus NaBH₄; (d) versus HCl; (e) versus AgNO₃.

Synthese en Karakterisering van AuNR@BSA

CTAB, hoewel effectief voor nanostavgroei, is cytotoxisch boven 1–10 µM en kan neerslaan bij lage temperaturen. Vervanging van CTAB door BSA vermindert toxiciteit en verbetert colloïdale stabiliteit. AuNR@BSA behield een vergelijkbare aspectratio maar vertoonde een ~30 nm roodverschoofde SPR-piek bij 1064 nm (Fig. 2). Zetapotentiaal veranderde van positief (CTAB) naar negatief (BSA), wat oppervlaktewisseling bevestigt. FT-IR spectra onthulden karakteristieke BSA-amidebanden (1649 en 1539 cm⁻¹). DLS toonde hydrodynamische diameters van 8,6 nm en 89 nm voor de twee populaties, wat een milde grootteverhoging na BSA-coating aangeeft. TEM bevestigde staafvormige morfologie met iets afgeronde uiteinden (Fig. 2). Alle afmetingen bleven onder 100 nm, wat tumorpenetratie gunstigt.

Figuur 2. Karakterisering van AuNR@BSA en AuNR@CTAB: (a) synthese; (b) UV-Vis spectra; (c) DLS grootteverdeling; (d) TEM-afbeeldingen.

In Vitro Fotothermale Effect

AuNR@BSA (OD ≈ 1) bereikte een temperatuurstijging van ~25 °C tot 80 °C binnen 5 min onder 0,35 W cm⁻², waarna het plateauwde (Fig. 3A). Temperatuur schaalde lineair met laservermogen (Fig. 3B). Verhoging van OD verhoogde piektemperaturen verder. Fotothermale stabiliteit werd bevestigd over drie 10-min bestralingscycli bij 0,5 W cm⁻² (Fig. 3D). Thermische afbeeldingen toonden piektemperaturen van 85,5 °C voor AuNRs versus 44,5 °C voor PBS (Fig. 3E). Deze resultaten benadrukken de superieure fotothermale conversie en stabiliteit van BSA-gecoate nanostaven in het NIR-II-bereik.

Figuur 3. In vitro fotothermale prestaties: (a) temperatuur vs. tijd; (b) temperatuur vs. laservermogen; (c) temperatuur vs. absorbantie; (d) drie-cycli stabiliteit; (e) thermische afbeeldingen.

In Vitro Cytotoxiciteit en Fotothermale Toxiciteit

AuNR@CTAB vertoonde significante cytotoxiciteit zelfs bij lage concentraties (OD ≈ 0,05), terwijl AuNR@BSA >80 % celviabiliteit behield tot OD ≈ 1 (Fig. 4A). Fotothermale behandeling (0,75 W cm⁻², 10 min) verlaagde 4T1-celviabiliteit tot ~20 % bij OD ≈ 1, terwijl controlecellen ~100 % viabel bleven (Fig. 4B). Dus behoudt BSA-coating biocompatibiliteit terwijl het effectieve fotothermale doden mogelijk maakt.

Figuur 4. Cytotoxiciteit en fotothermale toxiciteit: (a) celviabiliteit vs. concentratie; (b) viabiliteit met/zonder laser.

In Vivo Biodistributie en Circulatie

AuNR@BSA vertoonde een halfwaardetijd van ~1,5 u in circulatie (Fig. 5A). Na 24 u werd voorkomende accumulatie waargenomen in lever en milt, consistent met opname door het reticulo-endotheliale systeem (Fig. 5B). Deze bevindingen suggereren potentieel voor lever-milt-gerichte toepassingen.

Figuur 5. Biodistributie: (a) Au-concentratie in bloed over tijd; (b) orgaandistributie bij 24 u.

In Vivo Fotothermale Behandeling

Intratumorale injectie van AuNR@BSA gevolgd door 1064 nm bestraling (0,75 W cm⁻², 10 min) verhoogde tumortemperatuur tot ~64 °C, terwijl controlegroepen bij lichaamstemperatuur bleven (Fig. 6D). Over 14 dagen toonde de AuNR@BSA + laser groep complete tumorablatie zonder teruggroei; tumoren in controlegroepen progresseerden snel (Fig. 6A, B). Post-mortem analyse bevestigde afwezigheid van residueel tumorweefsel (Fig. 6C). TEM van behandelde tumoren onthulde intacte AuNRs, wat in vivo fotostabiliteit bevestigt (Fig. 7).

Figuur 6. In vivo behandelresultaten: (a) tumorvolume; (b) lichaamsgewicht; (c) tumorfoto's; (d) infrarood thermografie; (e) post-behandeling afbeeldingen.

Figuur 7. TEM van AuNR@BSA in tumorweefsel: (a) behandeld; (b) onbehandeld.

Conclusie

We hebben BSA-gecoate goudnanostaven gesynthetiseerd met een 1064 nm SPR-piek, combineren hoge fotothermale efficiëntie met verbeterde biocompatibiliteit. In vivo studies toonden snelle tumorablatie in een borstkanker-muismodel met lage-dosis NIR-II laserbestraling. De nanostaven vertonen gunstige biodistributie, met significante lever- en miltopname, en behouden fotostabiliteit in de tumor-micro-omgeving. Deze eigenschappen positioneren AuNR@BSA als een veelbelovend platform voor NIR-II fotothermale therapie, potentiëel in combinatie met immunotherapie of chemotherapie voor gepersonaliseerde, veilige en effectieve kankerbehandeling.

Beschikbaarheid van Data en Materialen

De dataset onderliggend aan deze studie is beschikbaar bij de corresponderende auteur op redelijk verzoek. Alle data gegenereerd of geanalyseerd tijdens deze studie zijn in dit gepubliceerde artikel opgenomen.