Biocompatibele 5-aminolevulinezuur/goud-nanodeeltje-geladen ethosomale vesikels: een synergistische fotodynamische/fotothermale transdermale strategie voor hypertrofe littekenbehandeling

Samenvatting

We rapporteren een biocompatibele ethosomale vesikel (A/A-ES) geladen met 5-aminolevulinezuur (ALA) en goud-nanodeeltjes (AuNPs) bereid door ultrasoneering zonder giftige reagentia. A/A-ES vertoont een uitgesproken plasmatische absorptieband bij 600–650 nm, wat simultane fotodynamische (PDT) en fotothermale (PTT) activering mogelijk maakt met een 632 nm laser. In vitro transdermale studies bevestigen dat A/A-ES zowel ALA als AuNPs efficiënt in hypertrofe litteken (HL) weefsel levert, met 48% ALA-retentie na 2 uur. Cel-assays met hypertrofe litteken-fibroblasten (HLF) tonen aan dat A/A-ES reactieve zuurstofsoorten (ROS) productie en warmte-opwekking aanzienlijk verhoogt, leidend tot verhoogde apoptose en necrose vergeleken met alleen PDT of PTT. Deze resultaten benadrukken A/A-ES als een veelbelovend topicaal platform voor synergistische PDT/PTT van HL.

Achtergrond

Hypertrofe littekens (HL) ontstaan door excessive dermale collageendepositie en worden gekenmerkt door verdikte, fibrotische huid die functie en esthetiek kan beeinträchtigen. Conventionele behandelingen—met inbegrip van intralesionale injecties, drukkleding, en lasertherapie—lijden vaak onder beperkte effectiviteit, ongemak, of bijwerkingen zoals hypopigmentatie en weefselaatrofie. Fotodynamische therapie (PDT) met 5-aminolevulinezuur (ALA) biedt selectieve cytotoxiciteit via ROS-generatie, doch de klinische nut wordt beperkt door slechte huidpenetratie en lage ROS-opbrengst. Fotothermale therapie (PTT), met name met goud-nanodeeltjes (AuNPs) die licht omzetten in warmte via gelokaliseerde oppervlakte-plasmon-resonantie (LSPR), kan ROS-productie versterken en selectief littekenweefsel ableren, maar hoge laservermogens riskeren schade aan omringende huid.

Het combineren van PDT en PTT in een enkel platform belooft synergistische voordelen: ALA-gemedieerde ROS-generatie kan worden geamplificeerd door de warmte van AuNPs, terwijl het fotothermale effect de lokale temperatuur kan verhogen, wat ROS-opbrengsten verder verhoogt. Ethosomale vesikels (ES) bieden een deformeerbare, lipide-gebaseerde drager die transdermale afgifte van zowel hydrofiele als lipofiele geneesmiddelen verbetert. Eerder werk demonstreerde dat ALA-geladen ES (ALA-ES) wateroplossingen aanzienlijk overtreft in het leveren van ALA aan HL-weefsel. Echter, het integreren van AuNPs in ES terwijl biocompatibiliteit en efficiënte afgifte behouden blijven, is uitdagend. Hier presenteren we een eenvoudige, ultrasoneering-gebaseerde synthese van A/A-ES die gelijktijdig ALA en AuNPs encapsuleert zonder giftige oplosmiddelen, met hoge ALA-encapsulatie (≈20%) en sterke 600–650 nm absorptie.

Resultaten en discussies

Karakterisering van A/A-ES

Ultrasoneering diende twee doeleinden: (1) het genereerde AuNPs in situ via radicaal-gemedieerde reductie van AuCl₄⁻, wat giftige reducerende agenten overbodig maakte; (2) het induceerde lipide-dubbellaag herorganisatie, producerend kleine, uniform gesizeerde vesikels met voldoende interne kern voor medicinelading. UV-Vis-spectroscopie bevestigde een sterke absorptiepiek bij 600–650 nm (Fig. 1a), toeschrijfbaar aan plasmatische koppeling tussen aangrenzende AuNPs. Dynamische lichtverstrooiing onthulde een smalle groottedistributie gecentreerd op 166 ± 83 nm (Fig. 1b), terwijl SEM/TEM-afbeeldingen intacte, sferische vesikels (~200 nm) met duidelijk zichtbare AuNPs ingehuld in de dubbellaag toonden (Fig. 1c,d). Encapsulatie-efficiëntie (EE) van ALA bereikte 20%, wat waarden rapporteerd voor conventionele ES-formuleringen (<10%) overtreft. Deze kenmerken suggereren dat A/A-ES goed geschikt is voor het doorstaan van de dichte collageenmatrix van HL.

In vitro transdermale penetratie-studie van A/A-ES

Met Franz-diffusiecellen kwantificeerden we de retentie van ALA en AuNPs in vers geëxcideerd HL-weefsel. Beide agenten piekten na 2 uur, bereikend 48% van de toegepaste ALA-dosis binnen het weefsel (Fig. 2a). De gelijktijdige daling daarna reflecteert complete transdermale permeatie. TEM-imaging (Fig. 2b–d) bevestigde intacte vesikels in de dermis, gevolgd door vrijgave van AuNPs die in situ agregeerden—gunstig voor warmte-opwekking bij laserbestraaling. Deze gegevens vestigen A/A-ES als effectieve drager voor co-afgifte van ALA en AuNPs in HL-weefsel.

In vitro PDT/PTT van HLF

Biocompatibiliteitsassay

Cellevensvatbaarheidsassays onthulden geen significante cytotoxiciteit voor A/A-ES bij concentraties ≤2,0 mM, met overleving >90% na 12 uur (Fig. 3). Hogere doses veroorzaakten slechts geringe reducties, wat het veiligheidsprofiel van de formulering bevestigt en de therapeutische concentratie leidt tot 2,0 mM (≈14% v/v) voor volgende experimenten.

PDT/PTT voor HLF

Confocale microscopie toonde robuuste protoporfyrine IX (PpIX) accumulatie in HLF behandeld met ALA-ES en A/A-ES; Au-ES produceerde verwaarloosbare PpIX (Fig. 4). Bij 632 nm laserbestraaling nam PpIX-fluorescentie af terwijl ROS-signalen intensiefen, met name in A/A-ES-behandelde cellen—bewijs van verhoogde ROS-generatie via AuNP LSPR. Morfologische veranderingen, zoals membraanbubbelvorming, waren uitgesproken in A/A-ES-behandelde cellen, wat celdood aangeeft. Infrarood-thermografie bevestigde dat ALA-ES, Au-ES, en A/A-ES de lokale temperatuur verhoogden tot 41,3 °C (Au-ES/A/A-ES) en 36,5 °C (ALA-ES) onder bestraling, met snelle afkoeling daarna (Fig. 5). Deze bevindingen benadrukken de dubbele fotodynamische en fotothermale werking van A/A-ES.

Apoptose en necrose assay

Stroomcytometrie van Annexin V/PI-gekleurde cellen onthulde dat laser-behandelde A/A-ES de hoogste necrotische fractie induceerde (61,8%) vergeleken met ALA-ES (47,7%) en Au-ES (24,3%) (Fig. 6). Vroege en late apoptose waren ook verhoogd in A/A-ES, wat het synergistische effect van ROS-versterking en fotothermale stress weerspiegelt. Deze resultaten demonstreren kwantitatief de superioriteit van de gecombineerde PDT/PTT-benadering boven enkelvoudige modaliteiten.

Visualisatie van A/A-ES in HLF

Transmissie-elektronenmicroscopie onthulde uitgebreide AuNP-aggregatie in het cytoplasma van A/A-ES-behandelde HLF, consistent met efficiënte vesikelfusie en cargovrijgave. Na bestraling lieten afbeeldingen kenmerkende membraanbubbels, gezwollen mitochondriën, en geruptureerde buitenmembraan zien—kenmerken van celdood (Fig. 7). Deze ultrastructurele veranderingen bevestigen dat A/A-ES effectief ALA en AuNPs levert aan HLF, leidend tot synergistische fotodynamische en fotothermale celdoding.

Conclusies

We hebben een biocompatibele, ultrasoneer-gesynthetiseerde 5-ALA/AuNP-geladen ethosomale vesikel (A/A-ES) ontwikkeld die sterke 600–650 nm absorptie, hoge ALA-encapsulatie (~20%), en efficiënte transdermale afgifte aan HL-weefsel demonstreert. In vitro studies bevestigen dat A/A-ES ROS-productie en fotothermale opwarming versterkt, wat superieure apoptose en necrose van HLF oplevert vergeleken met PDT of PTT alleen. Deze bevindingen ondersteunen A/A-ES als een veelbelovend topicaal platform voor synergistische fotodynamische/fotothermale therapie van hypertrofe littekens, wat toekomstige in vivo evaluatie rechtvaardigt.

Experimenten en methoden

Bereiding van A/A-ES

Fosfatidylcholine (180 mg) werd opgelost in 1,8 mL ethanol, 0,6 mL 10 mM HAuCl₄, en 3,6 mL 0,01 M ALA-citraatbuffer (pH 4,0, 12 mg ALA). Het mengsel werd geroerd bij 700 rpm gedurende 10 min, daarna gesoniceerd bij 200 W gedurende 30 min tot een wijnrode kleur verschen. Centrifugatie (8000 rpm, 20 min) verwijderde ongereageerde reagentia, en het pellet werd hergedispergeerd in 3 mL 2 mg/mL ALA-hydroalcoholische oplossing. Een transmembraan pH-gradient ladingsmethode werd toegepast om ALA in de vesikelkern te encapsuleren, wat de finale A/A-ES opleverde. Voor vergelijking werden ALA-ES en Au-ES bereid met identieke ALA- of AuNP-concentraties maar zonder de andere component.

Karakterisering van A/A-ES

Negatieve kleuring met 1,5 gewichts% fosfo-wolframzuur gevolgd door TEM (JEOL, 120 kV) beoordeelde morfologie. SEM (JEOL, 10 kV) evalueerde oppervlaktekenmerken. Groottedistributie gemeten door DLS (Nicomp 380ZLS). ALA-gehalte gekwantificeerd via fluorescamine-derivatisering, en EE berekend door ultrafiltratie. UV-Vis-spectra opgenomen op een Varian Cary 50 spectrophotometer.

In vitro penetratie-studie met Franz-diffusiecellen

HL-weefsel (≤24 uur post-excisie) werd gemonteerd op een Franz-cel met stratum corneum gericht naar de donor-compartiment. Een milliliter A/A-ES werd toegepast, en de receptor werd gehandhaafd bij 37 °C. Na gedefinieerde intervallen werd weefsel gewassen, gehomogeniseerd, en ALA geëxtraheerd door dialyse gedurende 24 uur. AuNP-retentie gekwantificeerd door ICP-MS. Na 2 uur blootstelling werden weefsels verwerkt voor ultra-dunne sneden en TEM-imaging.

In vitro PDT/PTT voor HLF

Celcultuur

HLF werden geïsoleerd uit patiënt HL-biopsieën met collagenaase I-verteering en gekweekt in DMEM aangevuld met 10% FBS bij 37 °C, 5% CO₂. Cellen gebruikt bij passages 2–3.

Biocompatibiliteitsassay

HLF (2 × 10³ cellen/put) werden blootgesteld aan seriële verdunningen van ALA-ES, Au-ES, of A/A-ES in FBS-vrij medium gedurende 12 uur. Cellevensvatbaarheid beoordeeld met CCK-8.

PDT/PTT-procedure

HLF (4 × 10⁴ cellen/put) werden geïncubeerd met 14% v/v A/A-ES of controles gedurende 6 uur, daarna gewassen en bestraald met een 632 nm, 40 mW/cm² He-Ne-laser gedurende 20 min. Na bestraling werden cellen gekweekt in DMEM met 10% FBS gedurende 24 uur voor downstream-assays.

Intracellulaire PpIX en ROS-generatie assay

PpIX en ROS gevisualiseerd door CLSM (Leica TCS SP5). DCFH-DA-kleuring kwantificeerde ROS, terwijl PpIX-fluorescentie vastgelegd werd bij 405 nm excitatie/635 nm emissie.

Apoptose en necrose assay

Annexin V-FITC/PI dubbele kleuring gevolgd door BD FACSCalibur stroomcytometrie bepaalde apoptose- en necrose-tarieven. Data geanalyseerd met FlowJo 7.6.

Statistische analyse

Data gepresenteerd als gemiddelde ± SD. Student's t-toets bepaalde significantie (P < 0,05).

Afkortingen

A/A-ES:

5-Aminolevulinezuur/Au nanodeeltje-geladen ethosomale vesikel

ALA:

5-Aminolevulinezuur

ALA-ES:

ALA-geladen ES

ALA-PDT:

ALA-gebaseerde PDT

Au-ES:

AuNP-geladen ES

AuNPs:

Au-nanodeeltjes

CLSM:

Confocale laserscanningmicroscopie

DLS:

Dynamische lichtverstrooiing

DMEM:

Dulbecco's Modified Eagle Medium

EE:

Encapsulatie-efficiëntie

ES:

Ethosomale vesikels

FBS:

Fetale kalverseerum

HL:

Hypertrofe litteken

HLF:

Hypertrofe litteken-fibroblasten

ICP-MS:

Inductief gekoppelde plasma-massa-spectrometrie

LSPR:

Gelokaliseerde oppervlakte-plasmon-resonantie

PDT:

Fotodynamische therapie

PDT/PTT:

Fotodynamische/fotothermale therapie

PpIX:

Protoporfyrine IX

PTT:

Fotothermale therapie

ROS:

Reactieve zuurstofsoorten

SEM:

Scanning-elektronenmicroscopie

TEM:

Transmissie-elektronenmicroscoop