Aptamer-gemodificeerde magnetische nanosensitizer voor in vivo MR-beeldvorming van HER2-expressie van kanker

Resultaten en discussie

Apt_HER2 -MNS is ontworpen als een op één molecuul gericht middel op basis van IONP's voor de moleculaire beeldvorming van tumoren die HER2 tot expressie brengen met behulp van MRI. Vandaar dat Apt_HER2 -MNS moest een hoge specificiteit hebben voor het doelmolecuul en een grote magnetische gevoeligheid hebben. Om een ​​hoge magnetische gevoeligheid te verkrijgen, gebruiken de MNC's, monodispers Fe₃ O₄ nanodeeltjes, werden gesynthetiseerd met behulp van de thermische ontledings- en zaadgroeimethode [36]. Experimentele procedure van voorbereiding en in vivo toepassing van Apt_HER2 -MNS werd beschreven in Fig. 1. Ten eerste werden de grootte en vorm van de MNC's bevestigd door HR-TEM (Fig. 2a, b). In Fig. 2c werd de gemiddelde grootte van MNC's gemeten door de willekeurige selectie van 130 MNC's uit het TEM-beeld, en een zeer smalle grootteverdeling (10,49 ±-1,74 nm) en bolvorm werden waargenomen. De superparamagnetische eigenschap van de MNC's werd ook geëvalueerd door VSM, wat een MNC-verzadigingsmagnetisatiewaarde opleverde van 98,8 emu/g_Fe (Fig. 2d). Het T2-contrastmiddel, dat momenteel beschikbaar was via intraveneuze injectie, was gebaseerd op superparamagnetische ijzeroxiden (SPIO) of ultrakleine superparamagnetische ijzeroxiden (USPIO) [40]. SPIO of USPIO hebben ook superparamagnetische eigenschappen, maar ze hebben een verzadigingsmagnetisatiewaarde van minder dan 70 emu/g_Fe [40,41,42,43]. De superparamagnetische eigenschap is noodzakelijk voor het gebruik van IONP's als intraveneus contrastmiddel, omdat het ervoor zorgt dat IONP's alleen een magnetische eigenschap hebben als ze zich in het magnetische veld bevinden, en het voorkomt dat IONP's aggregeren. Bovendien zou een hogere verzadigingsmagnetisatiewaarde van MNC's nuttig kunnen zijn om de injectiedosis te verlagen dan op SPIO of USPIO gebaseerde contrastmiddelen.

Schematische illustratie die de experimentele procedure toont voor de bereiding van met aptamer gemodificeerde magnetische nanosensitizer (Apt_HER2 -MNS) en hun beoordeling van in vivo beeldvorming

Het resultaat van morfologische en magnetische karakterisering van multinationals. een TEM-afbeelding. b Vergrote TEM-afbeelding. c Grootteverdeling meten van TEM-afbeelding (totaal aantal 100). d Magnetisatiegrafiek

Om MNC's te gebruiken voor in vivo experimenten, werden WMNC's en mWMNC's bereid door een nano-emulsiemethode met respectievelijk T80 of Tm80. De fysisch-chemische kenmerken van bereid Tm80 en zijn voorlopers, MPA en T80, werden bevestigd door absorptie, FT-IR, ¹ H-NMR spectrale analyse (zie aanvullend bestand 1:figuur S1). Zoals eerder gepubliceerd [44], zijn mWMNC's bereid met de nano-emulsiemethode met Tm80 stabiel gedispergeerd in water. Bovendien kunnen de maleimidylgroepen van mWMNC's gemakkelijk worden geconjugeerd met een molecuul dat thiolgroepen met een neutrale pH heeft en deze conjugatie genereert geen nevenproducten. Bovendien werd met NapdU gemodificeerd aptameer gebruikt om de in vivo halfwaardetijd te verlengen, en de halfwaardetijd was 151 uur in humaan serum (zie aanvullend bestand 1:figuur S3). Apt_HER2 -MNS werd bereid door conjugatie tussen mWMNC's en Apt_HER2 -SH, en de hydrodynamische eigenschappen van Apt_HER2 -MNS werden geëvalueerd met behulp van dynamische laserverstrooiing en MR-relaxiviteitsanalyse (Fig. 3). De diameters van WMNC's en Apt_HER2 -MNS waren respectievelijk 28,8 ± 7.2 en 34,1 ± 8.2 nm (Fig. 3a). Omdat de Apt_HER2 bestond uit 40-meer oligonucleotiden en was ongeveer 5-10 nm lang, de aanwezigheid van Apt_HER2 kan het verschil in hydrodynamische diameter veroorzaken. De relaxiviteit van WMNC's en Apt_HER2 -MNS was 265,7 en 257,2 mM ⁻¹ _Fe s ⁻¹ , respectievelijk (Fig. 3b), die werd geëvalueerd om hun magnetische gevoeligheid als MRI-contrastmiddel te bevestigen. In het geval van T2-contrastmiddelen op basis van SPIO of USPIO, die door de FDA zijn goedgekeurd, werden ze bijna gesynthetiseerd door de co-precipitatiemethode. Om deze reden was hun kristalliniteit afgenomen, wat een lage relaxiviteit veroorzaakte (minder dan 190 mM ⁻¹ _Fe s ⁻¹ ) onder het magnetische veld [40]. Door MNC's in dit onderzoek te gebruiken, kan Apt_HER2 -MNS had 35 ~  500% verhoogde magnetische relaxiviteit dan SPIO- of USPIO-gebaseerde T2-contrastmiddelen.

De karakterisering van WMNC's en Apt_HER2 -MNS voor gebruik als in vivo MRI-contrastmiddel. een hydrodynamische diameter (n = 5, WMNC's 28,8 ± 7,2 nm, Apt_HER2 -MNS 34,1 ± 8,2 nm). b Relaxiviteitsanalysegrafiek (n = 3, WMNC's R ² = 265,7 mM ⁻¹ s ⁻¹ , R ² = 0.99 en Apt_HER2 -MNS R ² = 257.2 mM ⁻¹ s ⁻¹ , R ² = 0.99)

De bindingsaffiniteit van Apt_HER2 -MNS voor HER2-eiwit werd geëvalueerd met behulp van een filterbindingstest (Fig. 4a) en de resulterende K _d waarden van Apt_HER2 -SH en Apt_HER2 -MNS werden gemeten als respectievelijk 26,88 ±-8,24 en 0,57 ± 0,26 nM (Fig. 4b, c). Apt_HER2 -OH heeft een zeer hoge specificiteit voor HER2-eiwitten met een K _d waarde van 0,42 ± 0,05 nM, en deze bindingsaffiniteit is ongeveer 10 keer hoger dan 5 nM van Herceptin® [45]. De bindingsaffiniteit van het naakte Apt_HER2 kan worden veranderd door conjugatie met de chemicaliën, moleculen of nanodeeltjes. Daarom is de bindingsaffiniteit van Apt_HER2 voor HER2-eiwitten moeten worden geëvalueerd na conjugatie met mWMNC's. De bindingsaffiniteit van Apt_HER2 -SH voor HER2 werd verminderd door de aanwezigheid van een thiolgroep in plaats van door het naakte Apt_HER2 omdat de thiolgroep kan worden gebonden met andere thiolresten in eiwitten of andere met thiol gemodificeerde aptameren. De bindingsaffiniteit van Apt_HER2 -MNS werd gemeten als vergelijkbaar met die van Apt_HER2 , betekent dit resultaat dat er ook niet genoeg ongebonden Apt_HER2 . is -SH dat de interactie tussen aptameer en HER2-eiwit kan onderbreken, noch mWMNC's hebben geen of zeer weinig invloed op de bindingsaffiniteit van aptameren.

Bindingsaffiniteitsgegevens van anti-HER2-aptameer (Apt_HER2 -OH) gethioleerde anti-HER2-aptameer (Apt_HER2 -SH) en Apt_HER2 -MNS op HER2-eiwitten door de filterbindingstest te meten. een De schematische illustratie die het proces van filterbindingstest van aptameren toont. b De fractiegebonden aptameergrafiek tegen HER2-concentratie. c De K _d waardegrafiek van Apt_HER2 -OH (0,42 ± 0,05 nM, R ² = 0.99, p < 0.0001), Apt_HER2 -SH (26,88 ± 8,24 nM, R ² = 0.98, p < 0.0001) en Apt_HER2 -MNS (0,57 ± 0,26 nM, R ² = 0.91, p = 0,001) berekend vanaf b . Foutbalken werden weergegeven door positieve y -alleen as

In vivo MRI-experimenten werden uitgevoerd met behulp van de syngene muistumormodellen om het vermogen van Apt_HER2 te evalueren. -MNS om zich te richten op tumoren die HER2 tot overexpressie brengen. Met behulp van een tumormodel dat werd gegenereerd door de implantatie van NIH3T6.7-cellen in de dij, werd een MRI-experiment uitgevoerd vanaf de pre-injectie tot 120 min na de injectie van WMNC's of Apt_HER2 -MNS (Fig. 5, zie ook Extra bestand 1:Figuur S4). Het T2-contrastverbeteringseffect door op IONP gebaseerde contrastmiddelen wordt waargenomen als een donkerder beeld omdat ze een T2-verkortingseffect van rond protonen induceren. Daarom werden in de signaalintensiteitsanalyses T2- of T2*-waarden weergegeven door R2 of R2*. R2, een omgekeerde waarde van T2, wordt gebruikt om de signaalintensiteit te vergelijken met een positieve waarde. In het geval van WMNC's werd de hoogste R2-signaalintensiteit 30 minuten na injectie van WMNC's waargenomen, waarna deze geleidelijk afnam (Fig. 5a, b). 120 min na de injectie van WMNC's leek de T2-signaalintensiteit op de pre-injectietoestand. De veranderingssnelheid in de gemiddelde waarde van R2-signaalintensiteit was minder dan 10%; dus was het moeilijk te herkennen in de T2-gewogen MR met het blote oog. In de vorige studie werd aangetoond dat de met T80 omhulde ijzeroxide-nanodeeltjes zich ophoopten rond de tumorweefsels ondanks de afwezigheid van enige targeting-eenheden [46]. In dat onderzoek werd echter een contrastmiddeldosis van 1,4 mg_Fe per muis werd gebruikt in de T2-gewogen MRI, die 14 keer hoger was dan de dosis die in dit onderzoek werd gebruikt. Dit betekent dat WMNC's geen effectieve contrastverbeteringseffectiviteit in het experiment konden aantonen bij een dosis van 0,1 mg_Fe per muis (5 mg_Fe /kg). De verandering in de tijdreeks van de R2*-signaalintensiteit was ook minder dan 10% en er was geen statistische significantie. Daarentegen 120 min na injectie, Apt_HER2 -MNS veroorzaakte een 130% hogere signaalintensiteitsverbetering dan vóór de injectie van Apt_HER2 -MNS ondanks het gebruik van dezelfde injectiedosis als WMNC's (Fig. 5c, d). Deze injectiedosis was 2- tot 30-voudig lager dan die van andere onderzoeken naar aptameer-gemodificeerde magnetische nanodeeltjes-gebaseerde contrastmiddelen [44, 47, 48]. Dit resultaat gaf aan dat Apt_HER2 -MNS heeft een hoger targetingvermogen dan WMNC's of andere aptameer-gemodificeerde contrastmiddelen, en suggereerde ook dat het hoge contrastverhogende effect van Apt_HER2 -MNS kan worden verwacht ondanks een lagere dosis dan WMNC's. De contrastversterking deed zich vooral voor in de perifere bloedvaten en in het centrum van het tumorweefsel. Hoewel de perifere bloedvaten kort na de injectie van Apt_HER2 . donker werden -MNS, de contrastversterking in het midden van de tumorlaesie verscheen voor het eerst na 60 min en nam toe tot 120 min.

In vivo MR-beelden van HER2+-tumormuismodel met behulp van WMNC's (n = 3) of Apt_HER2 -MNS (n = 3). een T2- en T2*-gewogen MR-beelden bij de pre- of post-injectie van WMNC's. b Grafiek voor relatieve signaalintensiteit gemeten vanaf a . c T2- en T2*-gewogen MR-beelden bij de pre- of post-injectie van Apt_HER2 -MNS. d Relatieve signaalintensiteitsgrafiek en e het intensiteitshistogram van het tumorgebied gemeten vanaf c . v Histologische analysegegevens verkregen na MR-beeldvorming. Foutbalken werden weergegeven door positieve y - alleen as. Relatieve signaalintensiteiten van b , d , en e werden gemeten vanaf de rode ononderbroken ROI van a , c en Aanvullend bestand 1:Afbeelding S4

Om de zichtbare verandering in de contrastverbeteringseffecten voor en na de injectie van Apt_HER2 . te benadrukken -MNS, een histogramanalyse van de R2-signaalintensiteit werd uitgevoerd in de ROI's op de T2-gewogen MRI-beelden (figuur 5e). Omdat het T2-signaal duidelijk de negatieve verbetering is in T2-gewogen MRI-beelden, werd het weergegeven door R2. Na injectie van Apt_HER2 -MNS, het midden van het histogram is naar rechts verschoven. De toename van de contrastverbetering met ongeveer 10% werd waargenomen toen het verschil in het midden van de histogrammen werd berekend.

Om de aanwezigheid van Apt_HER2 . te bevestigen -MNS in de tumor histologisch werd Pruisische blauwe kleuring uitgevoerd (Fig. 5f). In Pruisisch blauw gekleurd weefsel, kern en cytoplasma werden gekleurd als een diepe of lichtroze kleur, en er werden verschillende blauwgekleurde stippen rond tumorcellen waargenomen. We namen aan dat de tumorweefsels blauw kleurden als Apt_HER2 -MNS richtte zich op de tumor. In de resultaten van de Pruisische blauwe kleuring werden de blauwe stippen waargenomen in de tumorweefsels en de weefselglaasjes van Apt_HER2 -MNS had ongeveer 3 keer zoveel blauwe stippen als die van WMNC's. Pruisische blauwe kleuring kan het Fe-ion in weefsels detecteren; het werd dus gebruikt om de accumulatie van het contrastmiddel op basis van IONP's in de tumorweefsels te bevestigen [44, 49, 50].