HER2-gerichte magnetische nanosensitizer versterkt in vivo MRI voor HER2-positieve kankers

Samenvatting

Het doel van deze studie was de ontwikkeling van een humaan epidermale groeifactorreceptor 2 (HER2)-richtbaar contrastmiddel voor magnetische resonantiebeeldvorming (MRI) met hoge magnetische gevoeligheid. Een anti-HER2 aptamer-gemodificeerde magnetische nanosensitizer (AptHER2-MNS) werd bereid door conjugatie met 5'-thiol-gemodificeerde aptamers en maleimide-gemodificeerde magnetische nanokristallen (MNCs). De fysicochemische kenmerken en richtende capaciteit van AptHER2-MNS werden bevestigd, en de bindingsaffiniteit (Kd) op HER2-proteïne van AptHER2-MNS was 0,57 ± 0,26 nM. De in vivo MRI-contrastversterking werd eveneens geverifieerd in HER2+ kankercel (NIH3T6.7)-xenograft muismodellen (n = 3) op een 3T klinisch MRI-instrument. Het controle-experiment werd uitgevoerd met niet-gelabelde MNCs. De resultaten gaven aan dat tot 150% contrastversterking werd bereikt in de tumorregio in de T2-gewogen MR-beelden na injectie van het AptHER2-MNS middel in muizen die de NIH3T6.7 cellen ontvingen.

Achtergrond

Humane epidermale groeifactorreceptor 2 (HER2), behorend tot de EGFR-familie, speelt een sleutelrol in humane maligniteiten en is overexprimereerd in ongeveer 30% van de humane borstkankers [1] en in veel andere kankertypen, waaronder maag, blaas, eierstok en longcarcinoom [1-4]. Patiënten met HER2-overexprimerende borstkanker hebben aanzienlijk lagere overlevingskansen dan patiënten met niet-overexprimerende HER2-kankers [5]. Bovendien leidt HER2-overexpressie tot verhoogde borstkanker-metastase [6-8]. Om die reden fungeert HER2 als belangrijke biomarker in kankerdiagnose. In de klinische praktijk wordt HER2 gebruikt als typische biologische marker, samen met de oestrogeenreceptor (ER) en progesteronreceptor (PR), om borstkanker te diagnosticeren. Borstkankerpatiënten ontvangen een definitieve diagnose na histologische verificatie van HER2, ER, en PR expressieniveaus. Histologische verificatie is echter invasief en wordt slechts bij een beperkt aantal letsels uitgevoerd. Verschillende onderzoeken zijn daarom uitgevoerd om diagnostische markers non-invasief te visualiseren via radiologische onderzoek vóór histologische verificatie, gebaseerd op computed tomography [9, 10], positronen-emissie-tomografie [11-13], single-foton-emissie-computed tomography [14-16], magnetische resonantiebeeldvorming (MRI) [17-20], en multimodale beeldvormingstools [21-23].

IJzeroxide-nanodeeltjes (IONPs) worden gebruikt in verschillende non-invasieve radiologische onderzoeken voor de observatie van klinisch relevante biomarkers [24, 25]. IONPs zijn compatibel met moleculaire beeldvorming omdat ze een hogere magnetische gevoeligheid of biocompatibiliteit hebben dan andere zware metaal-gebaseerde MRI-contrastmiddelen zoals gadolinium-gebaseerde contrastmiddelen (GBCAs) of nikkel- of kobalt-bevattende contrastmiddelen. In het bijzonder, hoewel gecommercialiseerde MRI-contrastmiddelen en GBCAs geassocieerd zijn met problemen gerelateerd aan in vivo toxiciteit door vrijkomst van Gd³⁺ ionen, hebben IONP-gebaseerde MRI-contrastmiddelen een hogere in vivo veiligheid dan GBCAs omdat ze kunnen worden afgebroken tot ijzer, geabsorbeerd of geëlimineerd [26, 27].

Om IONPs toe te passen voor moleculaire beeldvorming, zijn de richtende moieties uitermate belangrijk en kunnen chemicaliën, koolhydraten, eiwitten, antilichamen of aptamers zijn [25, 28, 29]. Onder deze moleculen hebben aptamers een stabiele driedimensionale structuur van een enkelstrengs nucleïnezuur die een hoge bindingsaffiniteit en specificiteit op specifieke moleculen heeft. De hoge bindingsaffiniteit van aptamers wordt veroorzaakt door hun ontwikkelingsmethode en systematische evolutie van liganden door exponentiële verrijking (SELEX) [30]. SELEX gebruikt zeer grote bibliotheken van willekeurige sequentie-oligonucleotiden (~10¹⁵) die door chemische synthese kunnen worden verstrekt en parallel gescreend om aptamers te vinden die een hoge bindingsaffiniteit op het doelmolecuul hebben. Als resultaat van SELEX kunnen aptamers worden ontwikkeld met een hoge bindingsaffiniteit op picomolaire concentratieniveau over het algemeen, terwijl die van andere biomoleculen varieert van micromolair tot subnanomolair [31, 32]. In het geval van de recent ontwikkelde derde-generatie aptamers, hebben ze ook in vitro en in vivo stabiliteit door hun verbeterde weerstand tegen DNase of RNase door gebruik van gemodificeerde nucleïnezuren [33, 34]. Om deze redenen komen aptamers op als de voorkeursmoieties in moleculaire beeldvormingonderzoek [35].

Het doel van deze studie was de ontwikkeling van een aptamer-gemodificeerd T2-contrastmiddel gebaseerd op magnetische nanokristallen (MNCs) met een hoge specificiteit voor kankercellen die HER2 overexprimeren. Om dit te bereiken, werden MNCs, die een hoge magnetische gevoeligheid hebben, bereid door een thermische decompositiemethode en een HER2-specifieke aptamer (Kd = 0,42 nM) gebruikt. De gesynthetiseerde contrastmiddelen werden gekarakteriseerd door analyse van morfologie, magnetisatie-eigenschap en magnetische relaxiviteit. Ook voerden we in vitro en in vivo richtingstoetsen uit tegen HER2-proteïnen in een tumor-xenograft diermodel geïmplanteerd met een HER2-exprimerende kankercellijnen, respectievelijk.

Methoden

Materialen

TWEEN® 80 (T80), 4-(dimethylamino)pyridine, N,N'-dicyclohexylcarbodiimide, triethylamine, dichloormethaan anhydraat, ijzer(III) acetylacetonaat, 1,2-hexadecanediol, dodecaanzuur, dodecylamine, en benzylether werden gekocht van Sigma-Aldrich (VS), en 3-maleimidepropionzuur (MPA) werd gekocht van TCI America (VS). RPMI-1640, Dulbecco's modified Eagle's medium, fetale kalfserum, en Gibco® antibiotic-antimycotic oplossing werden gekocht van Life Technologies (VS). De NIH3T6.7 werd gekocht van American Tissue Type Culture (VS). Diethylpyrocarbonaat (DEPC)-behandeld water werd gekocht van Biosesang Inc. (Korea). De thiol-gemodificeerde anti-HER2 aptamer [AptHER2, sequentie: 5'-6CC 6GG CA6 G66 CGA 6GG AGG CC6 66G A66 ACA GCC CAG A-3' (6: NapdU), 5'-SH modificatie, 40-mer] werd gekocht van Aptamer Science Inc. (Korea).

Synthese van MNCs

De monodisperse magnetische ijzeroxide-nanodeeltjes werden gesynthetiseerd met behulp van Sun's thermische decompositiemethode [36]. Deze magnetische nanodeeltjes worden MNCs genoemd vanwege hun ijzer(III) acetylacetonaat en oleïnezuur-precursoren. Kortweg, een mengsel van ijzer(III) acetylacetonaat (2 mmol), oleïnezuur (6 mmol), 1-octadeceen (6 mmol), 1,2-hexadecanediol (10 mmol), en benzylether (20 mL) werd geladen in een drie-hals ronde-bodemkolf en mechanisch geroerd. Om residuele zuurstofmoleculen en water te verwijderen, werd het mengsel voorverwarmd tot 100 °C gedurende 30 min. Het voorverwarmde mengsel werd vervolgens verhit tot 200 °C gedurende 2 uur en teruggekoken bij 300 °C gedurende 30 min onder een stroom van stikstof. Na afkoeling tot kamertemperatuur door verwijdering van de warmtebron, werden de reactanten gezuiverd met overmaat ethylalcohol. Centrifugatie werd in drievoud uitgevoerd om het product van eventuele ongedispergeerde residuen te scheiden. De Fe₃O₄-nanodeeltjesproducten werden vervolgens hergedispergeerd in 5 mL hexaan. Het eindproduct werd gesynthetiseerd door de bovenstaande procedure te herhalen met 100 mg Fe₃O₄ en de precursoren. De MNC-morfologieën werden geëvalueerd met een hoog-resolutie transmissie-elektronenmicroscoop (HR-TEM, JEM-2100, JEOL Ltd., Japan). De verzadigingsmagnetisatie werd geëvalueerd met een trillendemonstermagnetometer (VSM, MODEL-7300, Lakeshore, VS) bij kamertemperatuur. De hoeveelheid MNCs in het product werd geanalyseerd door het gewicht te meten met een thermogravimetrische analyzer (SDT-Q600, TA Instrument), en de MNCs werden gewassen tot de inhoud van Fe₃O₄ ongeveer 80% bereikte.

Synthese van Maleimide-TWEEN® 80

Voor de bereiding van maleimide T80 (Tm80), werden 15,3 mmol MPA en 22,9 mmol N,N'-dicyclohexylcarbodiimide opgelost in 10 mL dichloormethaan, respectievelijk, en vervolgens gemengd. Het mengsel werd vervolgens toegevoegd aan 20 mL dichloormethaan bevattende 7,6 mmol T80, gevolgd door de toevoeging van 3,2 mL triethylamine in het mengsel. Ten slotte werd 22,9 mmol 4-(dimethylamino) pyridine opgelost in 10 mL dichloormethaan, en alle reagentia werden gemengd in een 70 mL flesje. Het eindmengsel werd gerold met een magneet gedurende 48 uur. De kleur van het mengsel veranderde van abrikoos tot een rood wijnkleur. Na 48 uur reactie, werd de gekristalliseerde ureum door filtratie verwijderd. Om het dichloormethaan te elimineren, werd de reactie gefiltreerd door verdamping in een rotatieverdampapparaat (N-1100, EYELA, Japan). Het resulterende product werd opgeschud in gedemineraliseerd water, en de niet-geconjugeerde reagentia werden verwijderd door dialyse (Spectra/Por®, 1 kDa MWCO, Spectrum Laboratory Inc., VS). Het eindproduct werd bereid door vriesdrogen. De gesynthetiseerde Tm80 werd bevestigd door vergelijking met MPA en T80 met behulp van een UV-vis-spectrometer (UV-1800, Shimadzu, Japan), Fourier-transformatie infrarood (FT-IR) spectrometer (PerkinElmer, spectrum two), en ¹H-kernmagnetische resonantie (NMR) spectrometer (Bruker Biospin, Advance II, zie Aanvullend bestand 1: Figuur S1).

Bereiding van Maleimide MNCs

Water-dispergeerbare maleimide MNCs (mWMNCs) werden bereid met de nano-emulsiemethode [37]. Kortweg, 100 mg Tm80 werd volledig opgelost in 20 mL gedemineraliseerd water, en 4 mL n-hexaan bevattende 20 mg MNCs werd snel geïnjecteerd in het Tm80-opgeloste water met ultrasoneer (190 W) en roeren (1200 rpm). Het emulsieproces duurde 10 min met ijs-gekoelde bad. Het overgebleven organische oplosmiddel verdampt gedurende 12 uur bij kamertemperatuur, en de producten werden gezuiverd door dialyse (Spectra/Por®, 3,5 kDa MWCO, Spectrum Laboratory Inc., VS) om overmaat surfactant te verwijderen gedurende 3 dagen. De mWMNCs werden geconcentreerd met een centrifugafilter (NMWL 3000, Amicon® Ultra, Merk Milipore Ltd., Duitsland) tot 1,25 mgFe/mL in DEPC-behandeld water. De T80-omhulle MNCs (WMNCs) werden ook bereid met dezelfde methode.

Bereiding van AptHER2-MNS

Voorafgaand aan conjugatie tussen mWMNCs en anti-HER2 aptamers, werd de reductiestap van thiol-gemodificeerde aptamers uitgevoerd. Kortweg, 1 nmol aptamer werd opgelost in 0,3 mL gedemineraliseerd water, en triethylamineacetaat en 1,4-dithiothreitol oplossing werden toegevoegd waarbij de eindconcentratie 50 en 25 mM was, respectievelijk. Dit mengsel werd geschud bij kamertemperatuur gedurende 1,5 uur, en werd gezuiverd en gedesouteerd door ethanol-precipitatie. Om de AptHER2-MNS te bereiden, HER2-specifieke MRI-sonde, werd het molecuulgewicht van MNCs theoretisch berekend (zie Aanvullend bestand 1: Figuur S2) en de mengverhouding van mWMNCs en aptamer werd aangewezen als 1:7. Daarom werd 100 µg (Fe) mWMNCs (als Fe₃O₄, 45 pmol) opgelost in PBS (1 mL) en 5 µg (0,35 nmol) aptamer toegevoegd. Het mengsel werd gerold bij kamertemperatuur gedurende 5 min en geïncubeerd bij 4 °C gedurende 2 uur. De verdeling van de hydrodynamische diameter van de AptHER2-MNS werd vervolgens geanalyseerd met een dynamische laserspreidingsanalyzer (ELS-Z, Otsuka Electronics, Japan). Om de capaciteit van de AptHER2-MNS als MRI-contrastmiddel te bevestigen, werd T2-relaxiviteit (R2) analyse uitgevoerd met een 1,5 T klinisch MRI-instrument met een micro-47 oppervlaktecoil (Intera, Philips Medical System, Nederland) met behulp van diverse geconcentreerde fantomen van AptHER2-MNS. De R2 van de AptHER2-MNS werd gemeten met de Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG) sequentie bij kamertemperatuur: TR = 10 s, 32 echo's met 12 ms even echo-ruimte, aantal acquisities = 1, puntenresolutie = 156 µm × 156 µm, en snede-dikte = 0,6 mm. De R2 werd gedefinieerd als 1/T2 met s⁻¹ eenheden.

AptHER2-MNS bindingsaffiniteitstoets

Voor de validatie van de HER2-specificiteit van AptHER2-MNS, werd de nitrocellulose-filterbindingsmethode gebruikt [38]. De naakte AptHER2 en AptHER2-MNS werden gedefosforeerd met alkalische fosfatase (New England Biolabs, MA, VS). Het 5' of 3' einde van de aptamers werd gelabeld met T4 polynucleotide kinase en [³²P]-ATP (Amersham Pharmacia Biotech, NJ, VS) [39]. De bindingstoetsen werden uitgevoerd door de ³²P-gelabelde aptamers te incuberen bij een concentratie van 10 pM met het HER2-proteïne bij concentraties variërend van 100 tot 10 pM in selectiebuffer (20 mM Tris·HCl, pH 7,5 bij 4 °C, 6 mM NaCl, 5 mM 2-mercaptoethanol, 1 mM Na₃EDTA, 10% v/v glycerol) bij 37 °C gedurende 30 min. Het mengsel van de ³²P-gelabelde aptamers en het HER2-proteïne werd gefiltreerd door een G-50 kolom (GE Healthcare Life Science, VK) om vrije radio-isotopen te verwijderen. De gefiltreerde mengsels werden ontwikkeld op de herbruikbare film, en fracties van het HER2-proteïne-gebonden aptamers werden gekwantificeerd met een fosforimager (Fuji FLA-5100 Image Analyzer, Tokyo, Japan). Om het effect van de aspecifieke achtergrondbinding van het radioactief gelabelde aptamer aan het nitrocellulosefilter te elimineren, werden de ruwe bindingsgegevens gecorrigeerd door het experiment uit te voeren met alleen ³²P-gelabelde aptamers.

In vivo MRI

Alle dierproeven werden uitgevoerd onder goedkeuring van de Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International. De in vivo MRI-scans werden uitgevoerd met een syngene muistumormodel, gegenereerd door implantatie van NIH3T6.7 cellen (1,0 × 10⁷ cellen) in de dijken van 5-wekelijkse vrouwtjes BALB/c naakte muizen. Na 2 weken werd de tumorgrootte geëvalueerd door MRI. Toen de tumorgrootte ongeveer 500 mm³ bereikte, werd 100 µg (5 mg/kg) AptHER2-MNS geïnjecteerd in de staartvlieg. In vivo MRI-experimenten werden uitgevoerd met een 3,0 T klinisch MRI-instrument en een 8-kanaals menselijke polscoil. Voor T2-gewogen MRI bij 3,0 T werden de volgende parameters gehanteerd: TR/TE = 1054/70 ms, aantal acquisities = 2, puntenresolutie = 400 × 319 mm, en snededitte = 1 mm TSE factor = 8. De controle-experimenten werden uitgevoerd met WMNCs op dezelfde manier. Alle T2-signaalintensiteiten werden berekend door gemiddeld ongeveer vijf regio's van interesse (ROIs) getekend op de T2-gewogen MRI-beelden van elk muismodel (n = 3), en R2 (of R2*) waarde, omgekeerde waarde van T2, werd gebruikt in de signaalintensiteitsanalyse. De veranderingen in de tijd van relatieve signaalintensiteit werden genormaliseerd door initiële signaalintensiteit (pre-injectie). De histogramanalyse werd ook uitgevoerd op de R2-signaalintensiteit van voxel in ROI.

Histologische analyse

Prussisch blauw kleuring, kan worden gebruikt om Fe-ion in tumorweefsels te detecteren, werd uitgevoerd om de AptHER2-MNS richting van HER2-exprimerende kanker te bevestigen na het oogsten van tumorweefsel van elk tumormodel na de in vivo MRI. De geoogste tumorweefsels werden gefixeerd in 10% formalinoplossing gedurende 24 uur en in paraffin ingesloten na dehydratatie in toenemende ethanolconcentraties en verheldering in Histo-Clear® (National Diagnotics, VS). Prussisch blauw kleuring werd uitgevoerd door de weefselsneden (dikte = 5 µm) op glasplaatjes te monteren gevolgd door deparaffinatie en hydratatie met Histo-Clear® en geconcentreerde ethanolen, respectievelijk. Daarna werden de plaatjes in de Prussisch blauw werkoplossing (10% potassiumferrocyanide en 20% chlorwaterstofzuuroplossing = 1:1) geplaatst gedurende 1 uur. De kernen werden gekleurd met Nucleaire Fast Red kleurstof (Sigma Aldrich, VS). Na het wassen van de weefselmonsters drie keer gedurende 30 min, voegden we 2-3 druppels van de montagesoplossing toe op de plaatjes en bedekten de plaatjes met dekkers. De gekleurde weefselsneden werden waargenomen met een Olympus BX51 en Olyvia software (Olympus, Japan).

Resultaten en discussie

AptHER2-MNS werd ontworpen als een enkel-molecuul-richtend middel gebaseerd op IONPs voor de moleculaire beeldvorming van HER2-exprimerende tumoren met MRI. Daarom moest AptHER2-MNS een hoge specificiteit voor het doelmolecuul en een grote magnetische susceptibiliteit hebben. Om een hoge magnetische gevoeligheid te verkrijgen, werden de MNCs, monodisperse Fe₃O₄-nanodeeltjes, gesynthetiseerd met de thermische decompositie- en zaaigroei-methode [36]. Het experimentele procedure van bereiding en in vivo toepassing van AptHER2-MNS werd beschreven in Fig. 1. Ten eerste werden de grootte en vorm van de MNCs bevestigd door HR-TEM (Fig. 2a, b). In Fig. 2c werd de gemiddelde grootte van MNCs gemeten door willekeurige selectie van 130 MNCs uit het TEM-beeld, en een zeer smalle grootteverdeling (10,49 ± 1,74 nm) en bolle vorm werden waargenomen. De superparamagnetische eigenschap van de MNCs werd ook geëvalueerd door VSM, wat een MNC-verzadigingsmagnetisatiewaarde van 98,8 emu/gFe opleverde (Fig. 2d). Het T2-contrastmiddel, dat momenteel beschikbaar was voor intraveneuze injectie, was gebaseerd op superparamagnetische ijzeroxiden (SPIO) of ultrasmall superparamagnetische ijzeroxiden (USPIO) [40]. SPIO of USPIO hebben ook superparamagnetische eigenschappen, maar ze hebben een verzadigingsmagnetisatiewaarde minder dan 70 emu/gFe [40-43]. De superparamagnetische eigenschap is noodzakelijk voor het gebruik van IONPs als een intraveneus contrastmiddel omdat het ervoor zorgt dat IONPs alleen een magnetische eigenschap hebben wanneer ze in het magnetische veld zijn, en het voorkomt dat IONPs agglomereren. Bovendien kan de hogere verzadigingsmagnetisatiewaarde van MNCs helpen om de injectiedosis te verlagen ten opzichte van SPIO- of USPIO-gebaseerde contrastmiddelen.

Om MNCs te gebruiken voor in vivo experimenten, werden WMNCs en mWMNCs bereid door een nano-emulsiemethode met T80 of Tm80, respectievelijk. De fysicochemische kenmerken van bereide Tm80 en de precursoren, MPA en T80, werden bevestigd door absorbantie, FT-IR, ¹H-NMR spectrale analyse (zie Aanvullend bestand 1: Figuur S1). Zoals eerder gepubliceerd [44], zijn mWMNCs bereid door de nano-emulsiemethode met Tm80 stabiel gedispergeerd in water. Bovendien kunnen de maleimide-groepen van mWMNCs gemakkelijk geconjugeerd worden met een molecuul dat neutrale pH thiol-groepen heeft en deze conjugatie genereert geen bijproducten. Verder werd NapdU-gemodificeerde aptamer gebruikt om de in vivo halfwaardeperiode te verhogen, en de halfwaardeperiode was 151 uur in menselijk serum (zie Aanvullend bestand 1: Figuur S3). AptHER2-MNS werd bereid door conjugatie tussen mWMNCs en AptHER2-SH, en de hydrodynamische eigenschappen van AptHER2-MNS werden geëvalueerd met dynamische laserspreiding en MR-relaxiviteitsanalyse (Fig. 3). De diameters van WMNCs en AptHER2-MNS waren 28,8 ± 7,2 en 34,1 ± 8,2 nm, respectievelijk (Fig. 3a). Omdat de AptHER2 bestond uit 40-mer oligonucleotide en ongeveer 5-10 nm in lengte was, kan de aanwezigheid van AptHER2 het verschil in hydrodynamische diameter veroorzaken. De relaxiviteit van WMNCs en AptHER2-MNS was 265,7 en 257,2 mM⁻¹Fe s⁻¹, respectievelijk (Fig. 3b), wat geëvalueerd werd om hun magnetische gevoeligheid als MRI-contrastmiddel te bevestigen. In het geval van T2-contrastmiddelen gebaseerd op SPIO of USPIO, die FDA-goedgekeurd zijn, werden ze bijna allemaal gesynthetiseerd door de co-precipitatie-methode. Om die reden was hun kristallijnhte verminderd, wat een lage relaxiviteit (onder 190 mM⁻¹Fe s⁻¹) onder het magnetische veld veroorzaakte [40]. Door MNCs in deze studie te gebruiken, had AptHER2-MNS een 35-500% verhoogde magnetische relaxiviteit ten opzichte van SPIO- of USPIO-gebaseerde T2-contrastmiddelen.

De bindingsaffiniteit van AptHER2-MNS voor HER2-proteïne werd geëvalueerd met een filterbindingsanalyse (Fig. 4a), en de resulterende Kd-waarden van AptHER2-SH en AptHER2-MNS werden gemeten als 26,88 ± 8,24 en 0,57 ± 0,26 nM, respectievelijk (Fig. 4b, c). AptHER2-OH heeft een zeer hoge specificiteit voor HER2-proteïnen met een Kd-waarde van 0,42 ± 0,05 nM, en deze bindingsaffiniteit is ongeveer 10-voudig hoger dan 5 nM van Herceptin® [45]. Echter, de bindingsaffiniteit van de naakte AptHER2 kan veranderen door conjugatie met chemicaliën, moleculen of nanodeeltjes. Daarom moet de bindingsaffiniteit van AptHER2 voor HER2-proteïnen geëvalueerd worden na conjugatie met mWMNCs. De bindingsaffiniteit van AptHER2-SH voor HER2 werd verminderd door de aanwezigheid van een thiol-groep eerder dan door de naakte AptHER2, omdat de thiol-groep kan binden met andere thiol-restanten in proteïnen of andere thiol-gemodificeerde aptamers. Echter, de bindingsaffiniteit van AptHER2-MNS werd gemeten als vergelijkbaar met die van AptHER2, dit resultaat betekent dat noch er voldoende ongebonden AptHER2-SH is die de interactie tussen aptamer en HER2-proteïne kan storen, noch mWMNCs geen of zeer weinig invloed hebben op de bindingsaffiniteit van aptamers.

In vivo MRI-experimenten werden uitgevoerd met de syngene muistumormodellen om de capaciteit van AptHER2-MNS te evalueren om HER2-overexprimerende tumoren te richten. Met een tumormodel gegenereerd door implantatie van NIH3T6.7 cellen in de dijk, werd een MRI-experiment uitgevoerd van pre-injectie tot 120 min na de injectie van WMNCs of AptHER2-MNS (Fig. 5, zie ook Aanvullend bestand 1: Figuur S4). T2-contrastversterkingseffect door IONP-gebaseerde contrastmiddelen wordt waargenomen als donkerder beeld omdat ze T2-verkortingseffect van omringende protonen induceren. Daarom werden in de signaalintensiteitsanalyses T2 of T2* waarden voorgesteld door R2 of R2*. R2, een omgekeerde waarde van T2, wordt gebruikt om de signaalintensiteit met positieve waarde te vergelijken. In het geval van WMNCs, werd de hoogste R2-signaalintensiteit waargenomen 30 min na injectie van WMNCs waarna het geleidelijk afnam (Fig. 5a, b). Bij 120 min na de injectie van WMNCs, leek de T2-signaalintensiteit op de pre-injectietoestand. De veranderingssnelheid in de gemiddelde waarde van R2-signaalintensiteit was minder dan 10%; dus was het moeilijk te herkennen in de T2-gewogen MR met het blote oog. In een eerdere studie werd aangetoond dat T80-omhulle ijzeroxide-nanodeeltjes geaccumuleerd raakten rond tumorweefsels ondanks de afwezigheid van enige richtende moieties [46]. Echter, in die studie werd een contrastmiddel-dosis van 1,4 mgFe per muis gebruikt in de T2-gewogen MRI, wat 14-voudig hoger was dan de dosis in deze studie. Dit betekent dat WMNCs geen effectieve contrastversterkingseffectiviteit konden tonen in het experiment bij een dosis van 0,1 mgFe per muis (5 mgFe/kg). De tijdreeksverandering van R2* signaalintensiteit was ook minder dan 10%, en er was geen statistische significantie. In tegenstelling, 120 min na injectie, veroorzaakte AptHER2-MNS een 130% hogere signaalintensiteitsversterking dan voor de injectie van AptHER2-MNS ondanks het gebruik van dezelfde injectiedosis als WMNCs (Fig. 5c, d). Deze injectiedosis was 2- tot 30-voudig lager dan die van andere studies over aptamer-gemodificeerde magnetische nanodeeltjes-gebaseerde contrastmiddelen [44, 47, 48]. Dit resultaat gaf aan dat AptHER2-MNS een hogere richtende capaciteit heeft dan WMNCs of andere aptamer-gemodificeerde contrastmiddelen, en suggereerde ook dat het hoge contrastversterkingseffect van AptHER2-MNS verwacht kan worden ondanks een lagere dosis dan WMNCs. De contrastversterking verscheen voornamelijk in de perifere vaten en in het centrum van het tumorweefsel. Hoewel de perifere vaten snel verduisterden na de injectie van AptHER2-MNS, verscheen de contrastversterking in het centrum van de tumorletsels eerst op 60 min en neigde toe te nemen tot 120 min.

Om de zichtbare verandering in de contrastversterkingseffecten voor en na de injectie van AptHER2-MNS te benadrukken, werd een histogramanalyse van de R2-signaalintensiteit uitgevoerd in de ROIs bij de T2-gewogen MRI-beelden (Fig. 5e). Omdat het T2-signaal duidelijk is als de negatieve versterking in T2-gewogen MRI-beelden, werd het voorgesteld door R2. Na injectie van AptHER2-MNS, verschuurde het centrum van het histogram naar de rechterkant. De ongeveer 10% toename van contrastversterking werd waargenomen wanneer het verschil van de centrum van histogrammen werd berekend.

Om de aanwezigheid van AptHER2-MNS in de tumor histologisch te bevestigen, werd Prussisch blauw kleuring uitgevoerd (Fig. 5f). In Prussisch blauw gekleurd weefsel, werden kern en cytoplasma gekleurd als diepe of lichte roze kleur, en diverse blauw gekleurde stippen werden waargenomen rond tumorcellen. We veronderstelden dat de tumorweefsels blauw gekleurd zouden zijn als AptHER2-MNS de tumor richtte. In de resultaten van de Prussisch blauw kleuring, werden de blauwe stippen waargenomen in de tumorweefsels, en de weefselsneden van AptHER2-MNS hadden ongeveer 3-voudig zoveel blauwe stippen als die van WMNCs. Prussisch blauw kleuring kan het Fe-ion in weefsels detecteren; dus werd het gebruikt om de accumulatie van het contrastmiddel gebaseerd op IONPs in de tumorweefsels te bevestigen [44, 49, 50].

Conclusies

Concluderend, we bevestigden dat AptHER2-MNS werkt als een in vivo HER2-richtbaar MRI-contrastmiddel door fysicochemische karakterisering en in vivo MRI-experimenten in HER2-exprimerende muistumormodellen. AptHER2-MNS heeft een hoge relaxiviteit en specificiteit voor HER2, en het demonstreerde duidelijke contrastversterkingseffecten ondanks een lagere toedieningsdosis dan andere T2-contrastmiddelen, door de ijzeroxide-nanodeeltjes. Dit contrastmiddel wordt verwacht informatie te leveren over de expressie van HER2-kanker bij kankerpatiënten en kan worden gebruikt om HER2+ kankerpatiënten te monitoren tijdens chemotherapie met HER2-doelwitten. We verwachten dat de resultaten van dit werk een veelbelovende strategie zullen bieden voor de diagnose van HER2-overexprimerende kanker en voor patiëntenbehandeling.