Koolstof Quantum Dot-Platina Porphyrine Compositie: Een Dubbele-Functie Theranostische Agent voor Verbeterde Fotodynamische Kankertherapie

Samenvatting

Fotosensitisatoren (PS's) zijn berucht hydrofoob, wat hun klinische nut in fotodynamische therapie (PDT) beperkt. Om dit te overwinnen, hebben we een nieuwe theranostische nano-agent, CQDs@PtPor, ontworpen door electrostatische binding van een tetraplatinatie porphyrine complex (PtPor) aan negatief geladen koolstof quantum dots (CQDs). Uitgebreide karakterisatie (XRD, TEM, XPS, FTIR) bevestigde de succesvolle assemblage van CQDs en PtPor in een enkele nanostructructuur. Spectroscopische analyse onthulde efficiënte resonantie-energieoverdracht van CQDs naar PtPor, wat resulteerde in aanzienlijk verhoogde enkele zuurstof (¹O₂) productie. In vitro studies op HeLa-cellen toonden aan dat CQDs@PtPor superieure fototoxiciteit bereikte vergeleken met vrij PtPor, terwijl verwaarloosbare donkere cytotoxiciteit vertoonde, wat het potentieel benadrukt als veilig en effectief kankertherapeutisch platform.

Achtergrond

PDT is ontstaan als een non-invasieve strategie voor het behandelen van huidaandoeningen, maculaire degeneratie, en diverse kankers. De therapie berust op licht-geactiveerde PS's die reactieve zuurstofsoorten (ROS) genereren bij bestraling, selectief tumorcellen doden terwijl gezonde weefde gespaard blijven. Hoewel activeerbare PS's zoals porphyrine en ftalocyanine derivaten dubbele rollen in imaging en therapie kunnen vervullen, wordt hun klinische vertaling gehinderd door slechte wateroplosbaarheid, verlengde cutane fotosensitiviteit, beperkte weefselpenetratie, en suboptimale absorptie boven 700 nm. Verschillende nanodragers — liposomen, polymere nanodeeltjes, gouden nanodeeltjes, koolstofnanobuizen, grafene, en koolstof quantum dots (CQDs) — zijn verkend om PS-aflevering en prestaties te verbeteren.

CQDs, een veelzijdige klasse koolstofnanomaterialen, vertonen uitzonderlijke optische eigenschappen, hoge wateroplosbaarheid, lage toxiciteit, uitstekende biocompatibiliteit, en gemakkelijke oppervlaktefunctionaliseringsmogelijkheden. Hun overvloedige oppervlaktegroepen maken covalente of niet-covalente hechting van geneesmiddelen, eiwitten, of targetliganden mogelijk, wat ze aantrekkelijke dragers maakt voor theranostische toepassingen. Eerdere studies hebben aangetoond dat CQDs geconjugeerd met PS's (bijv. Ce6, ZnPc, TMPyP) de fluorescentie-imaging en fotodynamische effectiviteit kunnen verbeteren door energieoverdrachtsmechanismen.

Onlangs vertoonde een tetraplatinatie porphyrine complex lage donkere cytotoxiciteit maar IC₅₀ waarden zo laag als 19 nM bij 420-nm bestraling, wat krachtige antikankeractiviteit aangeeft. Echter, de hydrofobiciteit en beperkte biocompatibiliteit sluiten klinisch gebruik uit. We ontwierpen daarom CQDs@PtPor om de oplosbaarheid en oppervlaktechemie van CQDs te benutten terwijl de therapeutische potentie van PtPor behouden blijft. De electrostatische assemblage tussen het positief geladen PtPor en negatief geladen CQDs verbetert niet alleen de waterdispergeerbaarheid maar bevordert ook energieoverdracht, wat ¹O₂ generatie en fototoxiciteit versterkt.

Methoden

Materialen
Trans-platinum diammine dichloride (trans-platine) (Aladdin®), 1,3-Difenylisobenzofuraan (DPBF) (Sigma-Aldrich), en alle oplosmiddelen werden aangeschaft van Tianjin Fu Chen Chemical Reagents of Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. Alle reagentia werden zoals ontvangen gebruikt.

Synthese van [Trans-PtCl(NH₃)₂]₄-5,10,15,20-Tetra(4-pyridyl)-Porphyrine Nitraat

Trans-platine (0,193 mmol, 58 mg) en AgNO₃ (0,193 mmol, 33 mg) werden opgelost in 5 mL DMF en 24 u geroerd. De resulterende witte AgCl-neerslag werd verwijderd door centrifugatie, wat een heldere oplossing opleverde. Dit werd toegevoegd aan een suspensie van 5,10,15,20-Tetra(4-pyridyl)porphyrine (0,487 mmol, 30 mg) in 3 mL DMF, gevolgd door roeren bij 50 °C gedurende 48 u. Na afkoeling werd 10 mL diethylether toegevoegd om het rode product te precipiteren, dat gewassen werd met methanol, dichloromethane, en ether. Drogen onder vacuüm gaf 81 mg product (86 % opbrengst). De structuur werd bevestigd door ¹H NMR en ESI-MS.

Preparatie van CQDs

Citraat (0,45 g) en ethylenediamine (500 µL) werden opgelost in 10 mL DI-water en onderworpen aan hydrothermale behandeling bij 200 °C gedurende 5 u in een PTFE-gevoerde autoklaaf. De resulterende bruin-zwarte oplossing werd gezuiverd door centrifugatie en dialyse tegen DI-water om CQDs te verkrijgen.

Preparatie van CQDs@PtPor Compositie

PtPor (20 mg in 3 mL DMSO) werd gedispergeerd in 12 mL water en langzaam toegevoegd aan een CQDs suspensie (5 mg in 15 mL H₂O) onder sonicatie. Het mengsel werd 24 u bij kamertemperatuur geroerd, dan gezuiverd door centrifugatie en gedialyseerd gedurende 2 dagen. De finale waterige oplossing werd vriesgedroogd bij 4 °C om de compositie te verkrijgen.

Kwantumopbrengst Meting

De CQD kwantumopbrengst (Φ) werd berekend relatief aan chininasulfaat (Φ_st ≈ 54 %) met de standaard comparatieve methode. Absorbantie werd onder 0,1 bij 360 nm gehouden om herabsorptie-effecten te vermijden.

Enkele Zuurstof Generatie

Monsters (5 mg mL⁻¹) werden gemengd met 10 mM DPBF in een 3 mL cuvet en bestraald met een 50 W xenonlamp (500 nm lang-pass filter, 6 mW cm⁻²) gedurende maximaal 30 min. De afname in DPBF absorbantie bij 415 nm werd elke 3 min gemonitord om ¹O₂ productie te kwantificeren. DCFH fluorescentie (λ_em = 525 nm) werd ook gebruikt als kwalitatieve probe.

Cytotoxiciteitsassays

HeLa-cellen werden gekweekt in DMEM met 5 % FCS, 100 U mL⁻¹ penicilline, en 100 µg mL⁻¹ streptomycine bij 37 °C, 6 % CO₂. Voor donkere cytotoxiciteit, werden cellen geïncubeerd met variërende concentraties van CQDs, PtPor, of CQDs@PtPor gedurende 24 u, dan beoordeeld door MTT-assay. Voor fototoxiciteit, werden cellen bestraald na 24 u incubatie, en viabiliteit werd opnieuw bepaald door MTT.

Cellulaire Imaging

HeLa-cellen (5 × 10⁴ cellen mL⁻¹) werden geïncubeerd met 0,25 mg mL⁻¹ CQDs@PtPor gedurende 1 u, gewassen, en geïmageerd door confocale microscopie (Zeiss LSM7 DUO) met een 405 nm laser.

Resultaten

Preparatie en Karakterisatie van CQDs@PtPor

Transmissie elektronenmicroscopie (TEM) onthulde uniforme, monodisperse deeltjes: CQDs gemiddeld 2,5 nm, terwijl CQDs@PtPor gemiddeld 7,6 nm, wat PtPor-adsorptie reflecteert (Fig. 1). XRD-patronen toonden een brede piek bij ~23°, indicatief voor amorfe koolstofstructuur. FTIR-spectra bevestigden de aanwezigheid van hydroxyle, amino, en amide groepen (Fig. 2b). Dynamische lichtspriding (DLS) meet een gemiddelde hydrodynamische diameter van 9,2 nm voor CQDs@PtPor, wat TEM-gegevens bevestigt. Zeta-potentiaal verschoven van −15,6 mV (vrije CQDs) naar +4,5 mV na PtPor-conjugatie, wat electrostatische binding bevestigt (Fig. 3d).

Fotofysieke Eigenschappen

UV-Vis-spectra toonden karakteristieke CQD-absorptie (~360 nm) en porphyrine Soret/Q-banden (~425, 520, 580 nm). CQDs vertoonden excitatie-afhankelijke fotoluminescentie (PL) met emissie verschuivend van 460 tot 552 nm over 280–500 nm excitatie, en een kwantumopbrengst van 36 %. In de compositie nam de PL-intensiteit bij 500 nm af terwijl de emissie bij 660 nm toename, wat efficiënte fluorescentie-resonantie-energieoverdracht (FRET) bewijst. Fluorescentie-levensduurmetingen bevestigden een verkorte donor-levensduur in CQDs@PtPor, wat de energieoverdracht verder ondersteunt (Fig. 4).

Verbeterde Enkele Zuurstof Productie

DPBF-degradatie experimenten onthulden dat CQDs@PtPor significant meer ¹O₂ produceerde dan vrij PtPor, terwijl CQDs alleen verwaarloosbare activiteit vertoonden (Fig. 5a). DCFH fluorescentie bevestigde deze bevindingen, met CQDs@PtPor die het sterkste signaal opleverde (Fig. 5b).

Fototoxiciteit in HeLa Cellen

Donkere cytotoxiciteitstoetsen toonden >90 % viabiliteit bij 50 µg mL⁻¹ voor alle monsters (Fig. 6a). Fototoxiciteitstoetsen toonden echter een dosis-afhankelijke reductie in viabiliteit: CQDs@PtPor bij 50 µg mL⁻¹ bereikte slechts 8 % overleving, wat beter was dan PtPor (18 %) en CQDs (90 %) (Fig. 6b). Deze superieure effectiviteit wordt toegeschreven aan de verhoogde ¹O₂ generatie gemedieerd door CQDs.

Cellulaire Opname en Stabiliteit

Confocale imaging onthulde dat CQDs@PtPor voornamelijk in het cytoplasma van HeLa-cellen gelokaliseerd was, met blauwe CQD-fluorescentie overlappend rode PtPor-emissie, wat stabiele complexvorming na opname aangeeft (Fig. 7).

Discussie

De duidelijke FRET van CQDs naar PtPor, bewijzen door verminderde donor-emissie en verkorte levensduur, vertaalt zich direct in hogere ¹O₂ productie en verbeterde fototoxiciteit. De kleine grootte (~10 nm) van CQDs@PtPor vergemakkelijkt tumoraccumulator via het verbeterde permeabiliteits- en retentie-effect (EPR), terwijl de verbeterde waterdispergeerbaarheid en biocompatibiliteit systemische toxiciteit reduceren. De modulaire aard van de electrostatische assemblage maakt eenvoudige substitutie van verschillende PS's of targetliganden mogelijk, wat CQDs@PtPor positioneert als een veelzijdig platform voor gepersonaliseerde PDT.

Conclusies

We hebben met succes een CQDs@PtPor nano-agent gefabriceerd die de superieure optische eigenschappen van CQDs combineert met de krachtige antikankeractiviteit van een tetraplatinatie porphyrine. De compositie vertoont hoge waterige stabiliteit, lage donkere toxiciteit, efficiënte energieoverdracht, en aanzienlijk verbeterde fotodynamische effectiviteit in vitro. Deze attributen maken CQDs@PtPor een veelbelovende kandidaat voor toekomstige klinische vertaling in kankertherapie.

Wijzigingsgeschiedenis

• Initiele inzending.

Afkortingen

CA

Citraat

CQDs

Koolstof quantum dots

DPBF

1,3-Difenylisobenzofuraan

EDA

Ethylenediamine

MTT

3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromide

PDT

Fotodynamische therapie

PS's

Fotosensitisatoren

TEM

Transmissie elektronenmicroscopie

UV

Ultraviolet

XPS

Röntgenfoto-elektronspectroscopie

XRD

Röntgendiffractie