Carbon Dots @ Platinum Porphyrin Composite als theranostic nanoagent voor efficiënte fotodynamische kankertherapie

Methoden

Transplatina-diammine-dichloride (transplatina) werd gekocht bij Aladdin®. 1,3-Difenylisobenzofuran (DPBF) werd verkregen van Sigma-Aldrich. Alle oplosmiddelen werden gekocht bij Tianjin Fu Chen Chemical Reagents. De andere chemicaliën zijn gekocht bij Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. en gebruikt zoals ontvangen.

Synthese van [Trans-PtCl(NH₃ )₂ ]₄ -5,10,15,20-tetra(4-pyridyl)-porfyrinenitraat

Transplatina (0,193 mmol, 58 mg) en zilvernitraat (0,193 mmol, 33 mg) werden opgelost in 5 ml DMF. Na 24 uur touwtrekken werd het gevormde witte zilverchloride verwijderd uit de resulterende troebele oplossing door middel van centrifugatie om de heldere oplossing te verkrijgen, die vervolgens werd toegevoegd aan de suspensie van 5,10,15,20-tetra(4-pyridyl)porfyrine (0,487 mmol, 30 mg) in 3 ml DMF. Na 48 uur roeren bij 50°C werd het mengsel afgekoeld tot kamertemperatuur. Vervolgens werd 10 ml diethylether toegevoegd om het rode precipitaat te verkrijgen, dat vervolgens werd gewassen met methanol, dichloormethaan en diethylether. Ten slotte werd het monster onder vacuüm gedroogd om 81 mg product te verkrijgen. Opbrengst 86%. ¹ H NMR (400 MHz; DMSO-d₆ ):δ 9,45 (d, 8H), 9,14 (s, 8H), 8,52 (m-pyridyl, d, 8H), 4,70 (NH₃ , s, 24H), -3,04 (s, 2H); MS (ESI):m /z =1209 [M-3(GEEN₃ )-2{PtCl(NH₃ )₂ }] ⁺ , 1074 [M-4(GEEN₃ )-2{PtCl(NH₃ )₂ }-2NH₃ -Cl-2H] ⁺ , 883 [M-4(GEEN₃ )-3{PtCl(NH₃ )₂ }] ⁺ , 866 [M-4(GEEN₃ )-3{PtCl(NH₃ )₂ }-NH₃ ] ⁺ , 812 [M-4(GEEN₃ )-3{PtCl(NH₃ )₂ }-Cl-2(NH₃ )] ⁺ , 574 [M-4(GEEN₃ )-2{PtCl(NH₃ )₂ }] ²⁺ .

Voorbereiding van de CQD's

Over het algemeen werden citroenzuur (0,45 g) en ethyleendiamine (500 L) opgelost in DI-water (10 ml). Vervolgens werd de oplossing overgebracht naar een met poly (tetrafluorethyleen) (Teflon) beklede autoclaaf (30 ml) en gedurende 5 uur op 200 °C verwarmd. Na de reactie werden de reactoren met water of natuurlijk tot kamertemperatuur gekoeld. Het ruwe product, dat bruinzwart was, werd gedurende 30 minuten in een centrifuge gezuiverd om geagglomereerde deeltjes te verwijderen en vervolgens gedialyseerd tegen DI-water om de cd's te verkrijgen.

Voorbereiding van de CQDs@PtPor-composiet

Het PtPor-molecuul, dat vier positieve ladingen in de pyridinering draagt, kan door een elektrostatische interactie aan de oppervlakken van de negatief geladen CQD's binden om de CQDs@PtPor-composiet te verkrijgen. In het algemeen werd 20 mg PtPor opgelost in 3 ml DMSO gedispergeerd in 12 ml water. De oplossing werd langzaam toegevoegd aan de CQDs-suspensie (5 mg CQDs opgelost in 15 ml H₂ O) onder ultrasoonapparaat. Na 24 uur roeren bij kamertemperatuur werd de oplossing gedurende 30 minuten in een centrifuge gezuiverd om geagglomereerde deeltjes te verwijderen en vervolgens gedurende 2 dagen tegen DI-water gedialyseerd. De waterige oplossing van CQDs@PtPor werd gevriesdroogd bij 4 °C om het gewenste product op te leveren.

De berekening van kwantumopbrengsten van CQD's

De kwantumopbrengst van CQD's werd gemeten met kininesulfaat als referentie (0,1 M H₂ SO₄ waterige oplossing, fluorescente kwantumopbrengst ∼ 54%) door de volgende vergelijking:

Waar Φ de kwantumopbrengst van de fluorescentie is, I is de helling van krommen, en η is de brekingsindex van oplosmiddel. Het subscript "st" verwijst naar de referentie van bekende kwantumopbrengst (kininesulfaat in 0,1 M H₂ SO₄ ). De absorptie werd onder 0,1 gehouden bij de excitatiegolflengte van 360 nm om reabsorptie te minimaliseren.

Singlet zuurstofgeneratie

Een oplossing van het monster en 3-difenylisobenzofuran werden bij kamertemperatuur in een glazen cuvet (3 ml) bestraald. Het absorptieverval van DPBF bij 415 nm werd gemeten met bestralingsintervallen van 3 min tot 30 min. De productie van singlet zuurstof werd kwalitatief geëvalueerd door middel van de DPBF, een singlet zuurstof quencher. Het percentage van het DPBF-absorptieverval, evenredig met de productie van ¹ O₂ , werd bepaald door het verschil tussen de aanvankelijke absorptie en de absorptie na een bepaalde bestralingsperiode. Elk experiment werd drie keer herhaald.

Cytotoxiciteitstest van CQD's, PtPor en CQDs@PtPor

Cellen van menselijk baarmoederhalscarcinoom (HeLa) werden gekweekt in Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) aangevuld met 5% foetaal kalfsserum (FCS), 100 E/ml penicilline, 100 μg/ml streptomycine bij 37 °C en 6% CO₂ . De levensvatbaarheidstest van methylthiazolyltetrazolium (MTT) werd uitgevoerd volgens een standaardmethode. Kortom, HeLa-cellen (3 × 10 ³ /putje) werden 24 uur voorafgaand aan blootstelling aan geneesmiddelen gezaaid in platen met 96 putjes. De cellen werden een nacht in het donker met monsters behandeld. De cytotoxiciteit werd bepaald met de MTT-reductietest. De celmonolagen werden tweemaal gespoeld met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en vervolgens gedurende 3 uur bij 37 ° C geïncubeerd met 50 L MTT-oplossing (0,5 mg / ml). Nadat de media waren verwijderd, werd 100 L DMSO toegevoegd. De oplossing werd 30 min geschud om de gevormde formazankristallen in levende cellen op te lossen. De absorptie werd gemeten bij dubbele golflengte, 540 nm en 690 nm, op een Labsystem Multiskan microplaatlezer (Merck Eurolab, Zwitserland). Elke gedoseerde concentratie werd uitgevoerd in drievoudige putjes en tweemaal herhaald voor de MTT-assay.

De fotocytotoxiciteit van monsters werd beoordeeld met een soortgelijk protocol. Over het algemeen zijn HeLa-cellen (3 × 10 ³ per putje) werden 24 uur voorafgaand aan blootstelling aan de geneesmiddelen geïncubeerd in platen met 96 putjes. De cellen werden een nacht in het donker met de monsters behandeld. Daarna werden de cellen gedurende 10 minuten blootgesteld aan een 50 W xenonlamp uitgerust met een warmte-isolatiefilter en een 500 nm long-pass filter. De fluentiesnelheid was 6 mW/cm ² . De levensvatbaarheid van de cellen werd bepaald door de MTT-reductietest.

Bioimaging-toepassingen van CQDs@PtPor

Cellulaire beeldvorming werd geëvalueerd met behulp van een confocale laser scanning microscoop. HeLa-cellen (5 × 10 ⁴ cellen per putje) werden gezaaid in kweekplaten met 6 putjes en men liet ze 12 uur hechten. De cellen werden vervolgens gedurende 1 uur bij 37 ° C behandeld met CQDs@PtPor (0,25 mg/ml). Daarna werd het supernatant voorzichtig verwijderd en werden de cellen driemaal gewassen met PBS. Vervolgens werden de objectglaasjes gemonteerd en geobserveerd met een confocale microscoop (Zeiss Laser Scanning Confocal Microscope; LSM7 DUO) met behulp van ZEN 2009-software (Carl Zeiss).

Resultaten

Voorbereiding van CQDs@PtPor

CQD's werden bereid door middel van een hydrothermische reactie in één pot volgens de methode beschreven in de literatuur [38], zoals weergegeven in Schema 1. Het PtPor werd gesynthetiseerd door complexering van gesubstitueerd transplatine met 5, 10, 15, 20-Tetra(4-pyridyl) )porfyrine volgens de gerapporteerde methode [37]. Omdat het PtPor-molecuul vier positieve ladingen heeft in de pyridinering, die door een elektrostatische interactie aan de oppervlakken van de negatief geladen CQD's zouden kunnen binden, wat de gewenste CQDs@PtPor-composiet oplevert.

Karakterisering van CQDs@PtPor

De transmissie-elektronenmicroscoop (TEM) -afbeeldingen (Fig. 1 links) laten zien dat de voorbereide CQD's en CQDs@PtPor homogeen zijn verdeeld met uniforme afmetingen. De deeltjesgrootte getoond in Fig. 1 rechts is smal (1-9 nm) en de gemiddelde grootte, bepaald door histogram, is 2,5 en 7,6 nm voor respectievelijk CQD's en CQDs@PtPor. De gemiddelde grootte van CQD's@PtPor is groter dan die van CQD's, waarschijnlijk vanwege de adsorptie van PtPor-molecuul op het oppervlak van CQD's door middel van een elektrostatische interactie.

TEM-afbeeldingen (links) en bijbehorende histogrammen voor grootteverdeling (rechts) van a CQD's en b CQDs@PtPor

Figuur 2a toont het röntgendiffractiepatroon (XRD) van de gesynthetiseerde CQD's. De brede XRD-piek van CQD's verschijnt rond 23°, wat wijst op de ongeordende structuur van CQD's [39]. De functionele groepen van CQD's werden gekarakteriseerd door FTIR-spectroscopie. Zoals getoond in Fig. 2b, de brede pieken van 3000 tot 3500 cm ⁻¹ worden toegeschreven aan O-H en N-H strekvibraties, wat wijst op de aanwezigheid van hydroxyl- en aminogroepen. De pieken op 1150 en 1230 cm ⁻¹ worden toegeschreven aan respectievelijk de C-O en C-N strektrillingen. De amidebinding wordt bevestigd door de typische pieken bij 1678 en 1392 cm ⁻¹ , toe te schrijven aan de trillingen van respectievelijk C =O en C-N van amide. Eindelijk, de piek op 1600 cm ⁻¹ wordt geïdentificeerd als C=C/C=N binding. In vergelijking met de FTIR-resultaten van citroenzuur, vertoonden de CQD's geen significante karakteristieke absorptie van citroenzuur (CA), wat aangeeft dat CA grotendeels verkoold moet worden tijdens het hydrolyseproces. Trouwens, een nieuwe scherpe piek op 1700 cm ⁻¹ , toegeschreven aan de amidebinding werd gevonden, wat aangeeft dat ethyleendiamine moet worden gefunctionaliseerd op het oppervlak van CQD's via de -CONH- koppeling. De gemiddelde diameter en deeltjesgrootteverdeling van CQD's en CQDs@PtPor werden bepaald door DLS-meting (aanvullend bestand 1:figuur S1 en figuur 2c). Zoals getoond in Fig. 2c, is de gemiddelde grootte van CQDs@PtPor ongeveer 9,2 nm, wat consistent is met het resultaat van dat van de TEM-test. De zeta-potentiaalmeting werd verder uitgevoerd om de conjugatie tussen CQD's en PtPor te bevestigen. Zoals getoond in Fig. 3d, is de zeta-potentiaal van vrije CQD's -15,6 mV, vanwege de negatieve ladingen op het oppervlak. Na conjugatie met PtPor werd de zeta-potentiaal van CQDs@PtPor-composiet gewijzigd in 4,5 mV, wat wijst op de succesvolle dekking van CQD's door de PtPor-moleculen.

XRD-patroon van CQD's (a ). Het FTIR-spectrum van CQD's (b ). Deeltjesgrootteverdeling van CQDs@PtPor gemeten door dynamische lichtverstrooiing (c ). Zeta-potentieel van CQD's en CQDs@PtPor (d )

XPS-enquêtespectrum (a ), en C 1s (b ), N 1s (c ), en O 1s (d ) hoge resolutie XPS-spectra van CQD's

Röntgenfoto-elektronspectroscopie (XPS) werd uitgevoerd om de chemische samenstelling van CQD's (Fig. 3) en CQDs@PtPor (Extra bestand 1:Figuur S2) verder te onderzoeken. Het onderzoeksspectrum van CQD's in figuur 3a geeft aan dat de bestaande elementen op het oppervlak C, N en O zijn, met de gerelateerde signalen op respectievelijk 535, 402 en 283 eV [40]. Het C 1s-signaal getoond in figuur 3b heeft drie verschillende pieken bij 284,4 eV, 286,3 eV en 288,2 eV, die respectievelijk worden toegewezen aan de C-C-binding, C-O-binding en C=O-binding. De XPS N 1s met hoge resolutie getoond in Fig. 3c is uitgerust met drie pieken, met bindingsenergieën bij 395,3, 399,1 en 402,2 eV, overeenkomend met respectievelijk de pyridine-achtige N, pyrrolische N en quaternaire N [41]. De deconvolutie van O 1s vertoonde de C-O- en O-H-pieken (Fig. 3d), wat wijst op het bestaan ​​van grote carboxylgroepen op het oppervlak van CQD's.

Fotofysische eigenschappen van CQD's@PtPor

De UV-Vis-absorptie- en fluorescentiespectra werden uitgevoerd om de fotofysische eigenschappen van de composiet te onderzoeken. Zoals getoond in Fig. 4a, vertoonde de CQDs@PtPor-composiet de karakteristieke pieken van CQD's en porfyrine. Een significante absorptiepiek rond 360 nm werd bijvoorbeeld waarschijnlijk toegewezen aan de n → π*-overgang van CQD's [42], terwijl de pieken rond 425 nm, 520 nm en 580 nm werden toegeschreven aan de pijnlijke en Q-banden van porfyrine , respectievelijk. De waterige oplossing van CQD's vertoont blauwe emissie onder de bestraling van een 365 nm ultraviolette (UV) lamp. Bovendien vertoonden de CQD's het excitatie-afhankelijke PL-gedrag, waarbij de emissiepiek verschoof van 460 naar 552 nm toen de excitatiegolflengte veranderde van 280 naar 500 nm, zoals weergegeven in figuur 4b. De fluorescentie kwantumopbrengst van de als-bereide CQD's was 36% met kininesulfaat als referentie.

UV-Vis-absorptie (a ) en fluorescentie (b ) spectra van CQD's, PtPor en CQDs@PtPor. Fluorescentiespectra (c ) van CQD's met verschillende excitatiegolflengten. Fluorescentie vervalt (d ) van CQD's en CQD's@PtPor. De concentratie van monsters:CQD's (5 g/mL), CQDs@PtPor (5 μg/mL, 3 μg/mL) en PtPor (3 μg/mL)

Discussie

Het effect van fluorescentie-resonantie-energieoverdracht (FRET) in CQDs@PtPor-composiet kan worden onderzocht door de fluorescentie-intensiteit van CQDs@PtPor te vergelijken met CQDs en PtPor. De fluorescentiespectra en intensiteiten van CQD's, PtPor en CQDs@PtPor met dezelfde concentratie werden gemeten onder de excitatie van 360 nm (figuur 4c). Omdat de CQD's een zeer sterke absorptie vertoonden bij 360 nm (figuur 4a) met de PL-kwantumopbrengst van wel 36%, zendt het een zeer sterke fluorescentie uit. Integendeel, aangezien de absorptie van PtPor bij 360 nm erg laag is en de PL-quantumopbrengst minder dan 1% is, vertoont de PtPor een zeer zwakke emissie. Opmerkelijk is dat de intensiteit van blauwe emissie (500 nm) in CQDs@PtPor duidelijk afnam in vergelijking met vrije CQD's, terwijl de rode emissie (660 nm) significant verbeterd is ten opzichte van die van PtPor alleen, wat wijst op de efficiënte energieoverdracht in CQDs@PtPor composiet . De fluorescentielevensduur van CQD's in CQDs@PtPor-composiet nam af ten opzichte van die van vrije CQD's, zoals weergegeven in figuur 4d. Een dergelijke duidelijke afname van de donorlevensduur geeft verder de effectieve overdracht van resonantie-energie van CQD's naar PtPor in de CQDs@PtPor-composiet aan.

Aangezien de zuurstofproductie van het singlet een sleutelfactor is bij PDT, is de ¹ O₂ generatie werd bepaald door een chemische methode met behulp van 1,3-difenylisobenzofuran (DPBF) als de ¹ O₂ aaseter. In het algemeen zal de absorptie-intensiteit van DPBF geleidelijk afnemen in aanwezigheid van singletzuurstof. Daarom kan de afnamesnelheid van de absorptie-intensiteit van DPBF worden gebruikt om de relatieve opbrengst van singlet-zuurstof te evalueren. In dit experiment werden CQD's (5 mg/mL), PtPor (5 mg/mL) of CQDs@PtPor (5 mg/mL) respectievelijk gemengd met DPBF (10 mM), gevolgd door bestraling met xenonlamp. Zoals getoond in Fig. 5a, vertoonde de absorptie van DPBF na de toevoeging van CQD's geen enkele verandering met de verlenging van de bestralingstijd, wat aangeeft dat CQD's geen significante singlet-zuurstofproductie hadden. Bovendien vertoonde de CQDs@PtPor-composiet een zeer duidelijke degradatie tot DPBF, die veel hoger is dan die van PtPor, wat aangeeft dat de ¹ O₂ opbrengst van porfyrine zou kunnen worden verbeterd onder de rol van CQD's. Ondertussen is de productie van ¹ O₂ werd verder gekwantificeerd met behulp van het dichloorfluoresceïne (DCFH) reagens. De groene fluorescentie (λ_em = 525 nm) van DCFH is bekend dat het kwantitatief toeneemt wanneer het reageert met ¹ O₂ gegenereerd uit de fotosensitizers. Zoals getoond in Fig. 5b, vertoonde de CQDs@PtPor-composiet een hogere efficiëntie van ¹ O₂ productie dan die van zuivere PtPor. Dit resultaat is zeer consistent met het resultaat verkregen met de DPBF-methode.

Singlet-zuurstofgeneratie van CQD's, PtPor en CQDs@PtPor volgens de DPBF-methode (a ) en DCFH-methode (b )

De cytotoxiciteit van CQD's, PtPor en CQDs@PtPor op HeLa-cellen werd getest door middel van de methylthiazolyltetrazolium (MTT) -test. Zoals getoond in Fig. 6a vertoonden alle drie de monsters de verwaarloosbare cytotoxiciteit tegen HeLa-cellen na behandeling gedurende 24 uur in het donker. Meer dan 90% van de kankercellen was nog in leven en hun concentratie was verhoogd tot 50 g/ml, wat suggereert dat alle drie de monsters geen nadelig effect hadden op kankercellen in het donker. Bovendien werd de fotocytotoxiciteit van drie monsters verder geëvalueerd met behulp van een vergelijkbare methode. Zoals getoond in Fig. 6b, nam de levensvatbaarheid van de cellen na behandeling van kankercellen met CQDs@PtPor gedurende 24 uur gevolgd door bestraling met licht geleidelijk af met de toename van de monsterconcentratie. Wanneer de concentratie van CQDs@PtPor 50 g/ml was, was het overlevingspercentage van kankercellen slechts 8%, wat blijkbaar lager was dan dat van PtPor alleen (18%) en CQD's (90%). Dat wil zeggen, de CQDs@PtPor-composiet vertoonde een sterkere therapeutische werkzaamheid dan die van PtPor alleen, wat suggereert dat CQDs@PtPor voordelig is ten opzichte van de conventionele formulering, die waarschijnlijk wordt toegeschreven aan de verbeterde efficiëntie van het genereren van singlet-zuurstof van PtPor door CQD's.

Donkere cytotoxiciteit (a ) en fotocytotoxiciteit (b ) van CQD's, PtPor en CQDs@PtPor in verschillende concentraties

De cellulaire opname van pure CQD's, PtPor en CQDs@PtPor werd bestudeerd met behulp van een confocale laserscanningmicroscoop onder excitatie van een 405-nm laser. Zoals getoond in Fig. 7, verdeelde de CQDs@PtPor-composiet zich voornamelijk in het cytoplasma van HeLa-cellen. Bovendien overlapt de blauwe fluorescentiebeeldvorming van CQD's bijna met de rode emissie van die van PtPor in CQDs@PtPor-composiet, wat aangeeft dat de CQD's en PtPor in bindende toestand bleven nadat de CQDs@PtPor-composiet de cellen binnenging. Deze resultaten bevestigen dat de CQDs@PtPor-composiet stabiel is in de cellulaire omgeving en nog steeds fluorescentieresonantie-energieoverdracht in cellen kan uitvoeren.

De confocale fluorescentiemicroscopiebeelden van HeLa-cellen onder excitatie van 405 nm na behandeling met 50 μg/mL zuivere CQD's (a –c ), PtPor (d –f ), en CQDs@PtPor (g –ik ) gedurende 24 uur. een , d , g Helder veld. b , e , u Het CQDs-beeldvormingskanaal, gedetecteerd in het golflengtegebied van 410-450 nm. c , v , ik Het PtPor-beeldvormingskanaal, gedetecteerd met het 590 nm lange doorgangsgebied; (schaalbalk =20 m)

Conclusies

Een nieuw theranostisch nanomiddel (CQDs@PtPor) werd met succes ontworpen en ontwikkeld door de elektrostatische interactie tussen het tetraplatinated porfyrine-complex (PtPor) en de negatief geladen CQD's. Het als voorbereide CQDs@PtPor-composiet vertoonde een hoge dispergeerbaarheid in water, goede stabiliteit en biocompatibiliteit en verbeterde fluorescentiedetectie van fotosensitizers. Het PDT-effect van CQDs@PtPor was significant verbeterd ten opzichte van dat van PtPor alleen, wat suggereert dat CQDs@PtPor voordeliger is dan de conventionele formulering vanwege de verbeterde efficiëntie van ¹ O₂ generatie van PtPor door CQD's. Dit op CQD's gebaseerde nanomiddel vertoonde dus een verbeterde therapeutische werkzaamheid op kankercellen, evenals lage bijwerkingen in vitro, wat een groot potentieel aantoont voor toepassingen in de kliniek om patiënten met kanker in de nabije toekomst te behandelen.

Wijzigingsgeschiedenis

Afkortingen

CA:

Citroenzuur

CQD's:

Koolstofkwantumstippen

DPBF:

1,3-difenylisobenzofuran

EDA:

Ethyleendiamine

MTT:

3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromide

PDT:

Fotodynamische therapie

PS'en:

Fotosensibilisatoren

TEM:

Transmissie-elektronenmicroscoop

UV:

Ultraviolet

XPS:

Röntgenfoto-elektronenspectroscopie

XRD:

Röntgendiffractie