Eenvoudige synthese van polydopamine-koolstofstippen voor fotothermische therapie

Resultaten en discussie

Synthese en karakterisering van CD-PDA

In dit onderzoek hebben we de polydopamine (PDA)-gefunctionaliseerde koolstofstippen (CD-PDA) gesynthetiseerd via een-pot microgolf-geassisteerde pyrolyse van glycerine en PDA. De koolstofstippen (CD's) vervaardigd via dezelfde door microgolven ondersteunde pyrolyse-aanpak zonder PDA toe te voegen, werden ingesteld als een controlegroep. Schematische illustratie van het syntheseproces van CD-PDA werd conceptueel beschreven in Schema 1. De opbrengst van de CD-PDA was bijna 1,5 keer die van de CD's, vanwege de verbetering van de nucleatieplaats voor de vorming van koolstofdots met de fenolische groep geleverd door PDA [21].

Schematische weergave van het syntheseproces van CD-PDA

Dynamische lichtverstrooiing (DLS)-profielen onthulden de deeltjesgrootte en het zeta-potentieel van CD-PDA. De hydrodynamische deeltjesgrootte van CD-PDA was 51,5 ±  19,5 nm (inzet van figuur 1a) en de zeta-potentiaal werd bepaald op -27,5 ±  0,4 mV, wat wijst op negatief geladen groepen op het oppervlak van de nanodots, die het oppervlak verder demonstreerden wijziging door PDA. De hydrodynamische deeltjesgrootte van CD's gedispergeerd in DI-water was 5,5 ±   2,5 nm (inzet van figuur 1b). Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) -beelden karakteriseerden de monodisperse sferische en uniforme, in grootte verdeelde nanodeeltjes (Fig. 1a, b); de diameter van CD-PDA was ~ 25 nm (Fig. 1c) en die van CD's (Fig. 1d) werd gemeten bij ~  5 nm. Na de oppervlaktemodificatie door PDA was de groei van de diameter van CD-PDA ongeveer 20 nm vergeleken met die van CD's.

Morfologie, FT-IR-spectra en UV-Vis-spectra van CD-PDA en CD's. een TEM-afbeelding van CD-PDA (schaalbalk 100 nm, inzet:grootteverdeling bepaald door DLS). b TEM-afbeelding van cd's (schaalbalk 100 nm, inzet:grootteverdeling bepaald door DLS). c Ingezoomd beeld van een enkele CD-PDA (schaalbalk 50 nm). d Ingezoomde afbeelding van een enkele cd (schaalbalk 20 nm). e FT-IR-spectra van CD-PDA, CD's en PDA. v UV-Vis-spectra van CD-PDA, CD's en PDA (inzet:de absorptie van 600 tot 900 nm)

De passivering van PDA op de koolstofstippen werd geregistreerd met FT-IR-spectra. Hier werd PDA gesynthetiseerd via de polymerisatie van 20 mg DA-hydrochloride in 10 ml Tris-buffer (pH 8,5, 10 mM) bij kamertemperatuur gedurende 12 uur en vervolgens werd het gecentrifugeerd bij 23.294 rcf. Zoals de spectruminformatie van karakteristieke pieken van CD-PDA, CD's en PDA waargenomen in Fig. 1e, is de piek van 3400 cm ⁻¹ en 1600 cm ⁻¹ suggereerde de catechol-OH-groepen en aromatische ringen van PDA, die ook in de CD-PDA bestonden [23, 24]. Nieuwe pieken verschijnen op 1642 cm ⁻¹ , 1588 cm ⁻¹ , en 1640 cm ⁻¹ verwezen naar C=O, N–H en C–N terwijl de piek op 3400 cm ⁻¹ duidde op het bestaan ​​van -OH en N-H in het systeem, wat de oppervlaktemodificatie van PDA op de cd's verder illustreerde. De N-H, C=O en C-N die in de koolstofstippen opdoken tijdens de door microgolven ondersteunde oxidatie toonden de mechanismen van de oppervlaktepassivering voor de nanodots:tijdens de 5 minuten durende microgolf-geassisteerde oxidatie waren de polymerisatie van dopamine en de uitdroging van het systeem om de kern van de nanodots te vormen, waarna de groei van de koolstofstippen volgde.

De UV-Vis-absorptiespectra van CD-PDA, CD's en PDA met dezelfde concentratie worden getoond in Fig. 1f (concentratie van de monsterinzet Fig. 1f, 12,5 μg/mL). Als de oppervlaktepassivant van het systeem vertoonde PDA een breedspectrumabsorptie van 200 tot 900 nm, vooral in het nabije infraroodgebied, wat essentieel was voor de uitstekende fotothermische conversie-eigenschap van CD-PDA. De absorptie bij 220 nm en 280 nm vertegenwoordigde de elektronenovergang tussen de sterke π-stapeling van fenylring als een geconjugeerd systeem, wat de modificatie van PDA verifieerde. In het bijzonder duidde de duidelijke vermindering van absorptie bij 280 nm op de ruimtelijke barrière tussen de sterke π-stapelingsinteracties in het geconjugeerde systeem na de passivering van PDA [25], terwijl de UV-Vis-absorptiespectra van CD-PDA de karakteristieke pieken rond 274 nm en 370 nm, en die van cd's werd gemeten bij 260 nm en 330 nm. De bathochrome verschuiving van 330 naar 370 nm was verantwoordelijk voor de introductie van amidogeen uit de PDA, die ook werd gekarakteriseerd voor de chelatie van de glycerine en PDA [26, 27]. De inzet is de absorptie van CD-PDA, CD's en PDA van de golflengte 600 tot 900 nm.

Fotoluminescentie van CD-PDA

Zoals eerder gemeld, kan oppervlaktemodificatie van de koolstofstippen het fotonconversieproces in hoge mate beïnvloeden, wat leidt tot een enorme diversiteit in de fluorescentiespectra [28, 29]. In ons onderzoek verschoof de emissiepiek van CD-PDA in het rood van 450 naar 500 nm, waarbij de excitatiegolflengte veranderde van 350 naar 420 nm (figuur 2a). Dienovereenkomstig hebben we rode, blauwe en groene fluorescerende microscopiebeelden waargenomen door druppels op een glasplaatje te dompelen, wat de enorme diversiteit van fluorescentie voor CD-PDA verder verduidelijkt (inzet van figuur 2a). Bovendien hebben we de macroscopische afbeeldingen van de CD-PDA, CD's en DI-water gedetecteerd onder de UV-lichtverlichting (365 nm), wat bevestigt dat de fluorescentie-intensiteit van CD-PDA veel sterker was dan die van CD's (Fig. 2b). Figuur 2c illustreert verder de verbetering van de fluorescentie-intensiteit na de oppervlaktemodificatie van PDA; de kwantumopbrengst (QY) van CD-PDA was bijna driemaal die van de CD's (kininesulfaat werd geselecteerd als het standaardmonster [19]), wat het effect van het doteren van N-atomen uit PDA verifieert. We hebben de stabiliteit van de fluorescerende intensiteit van CD-PDA getest; het vertoonde geen duidelijke verandering onder de 2100-s bestraling (365 nm), en vertoonde daarom stabiele fotoluminescentie-eigenschappen (Fig. 2d).

Optische eigenschappen van CD-PDA's en CD's. een Fotoluminescentiespectra van CD-PDA (excitatiegolflengten variëren van 350 tot 420 nm met stappen van 10, inzet:fluorescentiemicroscopiebeelden van CD-PDA). b Van links naar rechts:CD's, CD-PDA en DI-water onder de UV-lichtbestraling (365 nm). c Fotoluminescentiespectra van CD-PDA, CD's en DI-water. d Stabiliteitscurve van de fluorescentie-intensiteit van CD-PDA

Om de invloed van PDA voor de verbetering van de fluorescentie-intensiteit van CD-PDA verder te bestuderen, hebben we eerst de fluorescentie-intensiteit gemeten tegen de duur van de polymerisatie van dopamine in Tris-buffer. De gradiënt van fotoluminescentie in figuur 3a illustreerde dat CD-PDA met dopamine gedurende 2 uur polymeriseren in Tris-buffer de hoogste fluorescentie-intensiteit vertoonde, wat de invloed van de mate van dopamine-prepolymerisatie aangeeft. We hebben de fluorescentie-intensiteit van CD-PDA verder onderzocht met verschillende originele PDA-concentraties in Tris-buffer (3, 5, 7 en 9 mg / ml). Omdat de oorspronkelijke DA-concentraties variëren van 3 tot 9 mg/ml, vertoonde de fluorescentie van CD-PDA de neiging om eerst te stijgen en vervolgens af te nemen (Fig. 3b).

Fotoluminescentiespectra van CD-PDA. een Fluorescerende intensiteit van CD-PDA met verschillende duur van dopamine-polymerisatie in Tris-buffer. b Fluorescerende intensiteit van CD-PDA met verschillende originele dopamineconcentraties. c Fluorescerende intensiteit van CD-PDA met verschillende pH vóór de door microgolven ondersteunde pyrolyse. d Fluorescerende intensiteit van CD-PDA met verschillende pH na de microgolfondersteunde pyrolyse

Verder onderzochten we de fluorescentie-intensiteit van CD-PDA met verschillende initiële pH; de fluorescentie-intensiteit nam af naarmate de pH van de Tris-buffer toenam van 5 naar 11 (figuur 3c). Figuur 3d vertoonde de invloed van de pH na de door microgolven ondersteunde oxidatie. De pH van het systeem na door microgolven geassisteerde oxidatie werd gemedieerd van 5 tot 11, en we vergeleken de fluorescentie-intensiteit van CD-PDA; zuur medium (pH 5,0) leidde tot sterkere fluorescentie, wat ook wees op sterkere fluorescentie van CD-PDA in de zure micro-omgeving van de tumor.

Fotothermische prestaties en cytotoxiciteit van CD-PDA

Meting van fotothermische werkzaamheid

Om de analyse van de fotothermische conversie-efficiëntie van CD-PDA en CD's af te bakenen, evalueerden we de temperatuurtoename kwantitatief tegen de tijd onder bestraling; PDA werd geselecteerd als een extra controlegroep. Minder dan 10 min bestraling (808 nm, 2 W/cm ² ), was de temperatuurstijging van CD-PDA 27 ° C, terwijl die van PDA ongeveer 30 ° C was bij 200 μg / ml. Ondertussen was de temperatuurtoename van CD's (200 μg/ml) onder bestraling gedurende de 10 min ongeveer 7,5 ° C en die van DI-water was niet meer dan 5 ° C (Fig. 4a). Verder hebben we de temperatuurstijging van de CD-PDA gemeten bij verschillende concentraties als functie van de tijd onder een vermogensdichtheid van 2 W/cm ² NIR-laserbestraling gedurende 10 min. Over het algemeen nam de verhoging van de temperatuur toe met de toename van de concentratie van de CD-PDA, en de temperatuur nam sneller toe naarmate de concentratie van CD-PDA toenam van 25 tot 200 μg / ml (figuur 4b). Waarop we de curve van de temperatuurverhoging tekenen tegen verschillende concentraties CD-PDA, waaronder de temperatuurverhoging van CD-PDA bij 200 μg/mL, 100 μg/mL, 50 μg/mL en 25 μg/mL ongeveer respectievelijk 27 °C, 18 °C, 13 °C en 10 °C (Fig. 4d). Om de invloed op de fotothermische conversie-efficiëntie van CD-PDA tegen verschillende initiële concentraties van DA in Tris-buffer te bestuderen, hebben we typisch de temperatuurverandering van CD-PDA (200 μg / ml) gemeten met verschillende oorspronkelijke concentraties van DA in Tris buffer (Fig. 4c). De temperatuur nam toe naarmate de DA-concentratie verbeterde van 3 tot 9 mg/ml. De temperatuurstijging was 27 °C wanneer de oorspronkelijke concentratie van DA 9 mg/ml was, terwijl de temperatuurstijging slechts 10 °C was wanneer de oorspronkelijke concentratie van DA 3 mg/ml was. De natuurlijke afkoelcurve van CD-PDA wordt weergegeven in figuur 4e (200 μg/mL, 808 nm, 2 W/cm ² , 20 min), en de slankere gegevens van − lnθ berekend op basis van de afkoelperiode worden waargenomen in Fig. 4f. De fotothermische conversie-efficiëntie van CD-PDA werd gemeten op 35%, hoger dan die van de eerder gerapporteerde Au-nanostaafjes (literatuurwaarde, 22% [30]).

Fotothermische conversie-eigenschappen van CD-PDA en CD's. een Fotothermische verwarmingscurves van CD-PDA, CD's, PDA en DI-water bij een vermogensdichtheid van 2 W/cm ² NIR-laserbestraling gedurende 10 min. b Fotothermische verwarmingscurves van CD-PDA bij verschillende concentraties gedurende 10 minuten. c Fotothermische verwarmingscurves van CD-PDA (200 g/mL) met verschillende originele DA-concentraties in Tris-buffer. d Temperatuurverhoging van CD-PDA bij verschillende concentraties. e Koelcurve van CD-PDA (bij een vermogensdichtheid van 2 W/cm ² NIR-bestraling in de eerste 10 min en natuurlijk afkoelen tot kamertemperatuur). v Slimmere tijdgegevens versus − lnθ berekend volgens de koelcurve van CD-PDA

In vitro levensvatbaarheid van cellen

De cytotoxiciteiten van CD-PDA, CD's en PDA werden geanalyseerd met een standaard MTT-assay. Om de verschillen in cellevensvatbaarheid tussen CD-PDA, CD's en PDA te evalueren, werden HeLa-cellen geïncubeerd met deze nanodeeltjes in dezelfde concentratie in elke groep. De MTT-resultaten (Fig. 5a) onthulden dat de cellevensvatbaarheid van HeLa-cellen een dosisafhankelijke relatie vertoonde met de CD-PDA, CD's en PDA. Er werd gemeld dat het chinonrijke PDA-gemodificeerde oppervlak energetisch was in de activiteit van celproliferatie [31]. Het is opmerkelijk in onze studie dat de CD-PDA duidelijk de levensvatbaarheid van HeLa-cellen zou kunnen bevorderen, zelfs bij een concentratie van 50 g/ml als gevolg van de oppervlaktemodificatie door PDA en dat de levensvatbaarheid van de cellen niet dramatisch werd geremd bij 100 μg/ml, die in wezen dezelfde tendens deelde met de resultaten van PDA, terwijl de levensvatbaarheid van HeLa-cellen die waren geïncubeerd met de cd's daalde tot 80% en 70% bij respectievelijk 100 μg/ml en 200 μg/ml.

In vitro cytotoxiciteit tegen HeLa-cellen. een In vitro cellevensvatbaarheid van HeLa-cellen geïncubeerd met CD-PDA, CD's en PDA in verschillende concentraties gedurende 24 uur. b In vitro cellevensvatbaarheid van HeLa-cellen geïncubeerd met CD-PDA, CD's en PDA in verschillende concentraties onder bestraling (808 nm, 2 W/cm ² , 5 minuten; gemiddelde ± SD, n = 6). *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0,001

De standaard MTT-assay werd verder beoordeeld op HeLa-cellen om de fotothermische dodingsefficiëntie van CD-PDA, CD's en PDA te bepalen. HeLa-cellen werden met deze nanodeeltjes in dezelfde concentratie in elke groep geïncubeerd. Onder bestraling (808 nm, 2 W/cm ² , 5 min), toonde de MTT-assay (Fig. 5b) aan dat de fotothermische dodingsefficiëntie van CD-PDA, CD's en PDA was verbeterd als een functie van hun concentratie. Over het algemeen verminderde de cellevensvatbaarheid van HeLa-cellen die waren geïncubeerd met CD-PDA tot 30% bij 200 g / ml, wat de fotothermische dodende werkzaamheid van het systeem aantoont. Ondertussen is het opmerkelijk dat het verschil in cellevensvatbaarheid tussen CD-PDA en PDA progressief afnam naarmate hun concentratie toenam van 25 tot 200 μg/ml dankzij de duidelijke temperatuurstijging van CD-PDA onder NIR-bestraling samen met de verbetering van de concentratie (Fig. 4b, 4d). Bovendien was de cellevensvatbaarheid van HeLa-cellen geïncubeerd met cd's onder NIR-bestraling 68% bij 200 g / ml, wat geen significante variatie was in vergelijking met die bij dezelfde concentratie zonder NIR-laser vanwege de zwakke lichtabsorptie in het nabij-infraroodgebied (Fig. 1e).