Microgolf-gereed, chitosaan-gecoate grafene-oxide voor gerichte adriamycine afgifte en verbeterde borstkankertherapie

Samenvatting

Om betere antitumoreffectiviteit te bereiken, is het dringend nodig de leveringsefficiëntie van antikankermedicijnen in het targeten van kankercellen te verbeteren. In dit werk werden chitosaan-gefunctionaliseerde grafene-oxide (ChrGO) nanovellen geproduceerd via microgolf-geassisteerde reductie, die werden ingezet als intracellulaire levering nanosysteem voor antikankermedicijn in borstkankercellen. Medicijnlading en -afgifte onderzoek wees uit dat adriamycine efficiënt kan worden geladen op en vrijgegeven van de ChrGO nanovellen. Minder medicijnafgifte tijdens levering en betere bio-compatibiliteit van ChrGO/adriamycine verbeteren de veiligheid en therapeutische effectiviteit in HER2-overexprimerende BT-474 cellen significant. Verder vertoonde ChrGO/adriamycine in combinatie met trastuzumab synergistische antitumoractiviteit in BT-474 cellen, wat superieure therapeutische effectiviteit demonstreerde vergeleken met elk medicijn apart. Cellen behandeld met trastuzumab (5 μg/mL) of equivalent ChrGO/adriamycine (5 μg/mL) induceerden elk 54,5% en 59,5% celdood, respectievelijk, terwijl de combinatiebehandeling met trastuzumab en ChrGO/adriamycine resulteerde in een dramatische 88,5% celdood. De dubbele-gerichte therapie toonde hogere apoptose, wat superieure therapeutische effectiviteit aangeeft door de aanwezigheid van verschillende werkingsmechanismen. De gecombineerde behandeling van ChrGO/adriamycine en trastuzumab in BT-474 cellen induceerde celcyclusarrest en apoptose, wat uiteindelijk leidde tot de dood van verhoogde kankercellen. Dit werk heeft een eenvoudige microgolf-geassisteerde fabricage van ChrGO geleverd als een gecontroleerd en gericht intracellulair medicijnlevering nanosysteem, wat verwacht wordt een veelbelovende nieuwe therapie te zijn voor het behandelen van HER2-overexprimerende borstkankercellen.

Inleiding

De HER2 receptor is een lid van de EGFR receptorfamilie die kankercelgroei en differentiatie medieert en hoog overexprimeert in 20–30% van humane borstkankers, leidend tot een metastasetumorfenotype en slechte prognose [1]. HER2 is ook overexprimeert in ongeveer 20% van humane maagkankers [2]. Trastuzumab, een gehumaniseerde monoclonale therapeutische antilichaam, toont veelbelovende therapeutische voordelen als eerste-lijn therapie in HER2-overexprimerende borstkankerpatiënten [3]. Echter, de algehele responsratio op trastuzumab blijft bescheiden: 15–30% bij behandeling als monotherapie en 50–75% bij gecombineerde behandeling met chemotherapie medicijnen [4]. Onder die patiënten die reageren op trastuzumab, progresseert een meerderheid van hen uiteindelijk na initiële respons en verkrijgt resistentie na continue behandeling [5]. Dus is het essentieel en noodzakelijk om additionele nieuwe therapieën te ontwikkelen voor HER2-overexprimerende patiënten om de algehele overlevingsscijfers te verbeteren.

Anthracyclines dienen nog steeds als de ruggengraat van kankerbehandeling. Voor de anthracyclinen agenten, is de topoisomerase II remmer adriamycine breed gebruikt om veel kankers te behandelen, zoals borst-, long- en lymfekankers [6]. Adriamycine heeft effectieve effectiviteit in de behandeling van HER2-overexprimerende borstkankerpatiënten, vanwege de nabijheid tussen het HER2 gen en het topoisomerase II gen [7]. Ondanks het klinische voordeel waargenomen met anthracyclines-gebaseerde therapieën in borstkanker, heeft cardiale dysfunctie meer uitgebreide therapeutische toepassingen beperkt. In de klinische proef, toonde trastuzumab in combinatie met adriamycine significante effectiviteit, terwijl hoge dosis-afhankelijke cardiotoxiciteit een probleem was dat opgelost moest worden [8]. Gesustineerde afgifte van chemotherapie agenten aan het weefsel van kankerdoel wordt erkend als een goede oplossing om lagere doses te vereisen voor therapeutische effectiviteit en de veiligheidsprofielen te verbeteren [9]. Om betere antitumorale effectiviteit te bereiken maar minder bijwerkingen, is er een dringende behoefte om de leveringsefficiëntie van antikankermedicijnen in het targeten van kankercellen te verbeteren.

Grafene-oxide (GO)-gebaseerde nanomaterialen hebben grote belofte getoond in de gecontroleerde levering van chemotherapie agenten [10]. Talloze studies hebben aangetoond dat de toxiciteit van GO geassocieerd is met zijn oppervlaktefunctionaliserings [11]. Recentelijk zijn milieuvriendelijke agenten, zoals chitosaan en PEG, gerapporteerd om GO te functionaliseren met minder giftige oppervlaktefunctionele groepen [12, 13]. Nanopartikel colloïdale stabiliteit in biologische media is cruciaal voor de ontwikkeling van effectieve en veilige medicijnleveringssystemen voor klinisch gebruik [14]. Gefunctionaliseerde GO nanovellen hebben grote aandacht gekregen in biomedische toepassingen vanwege hun eigenschappen zoals bio-compatibiliteit en stabiliteit. Als een uitstekende kandidaat voor grafene-gebaseerd biomateriaal, is colloïdale stabiliteit van GO of rGO belangrijk voor het controleren van de prestaties van medicijndragers. De poly(ethyleenglycol)-gefunctionaliseerde GO vertoonde verbeterde colloïdale eigenschap in celcultuurmedia [15]. P. Khanra rapporteerde een nieuwe methode voor de gelijktijdige reductie en bio-functionaliserings van GO door gistcellen te gebruiken als reductieve biocatalysator [16, 17]. Avinav G presenteerde een one-pot biosynthese van GO door gistextract te gebruiken tijdens een autoklaafproces [18]. Sonicatiesbehandeling van micrometer-grote GO vellen gedurende uren resulteerde in GO nanovellen, die hogere colloïdale stabiliteit vertoonden vergeleken met reguliere micrometer-grote GO [19]. Hoewel eerdere studies het hoge potentieel van GO voor biomaterialen demonstreerden, zijn de bio-gefunctionaliseerde GO nanovellen met chitosaan door microgolf-geassisteerde reductie met celvrije gistextract nog niet bestudeerd tot nu toe. Voor dit doel werd een nieuwe chitosaan-gefunctionaliseerde grafene-oxide (ChrGO) structuur geconstrueerd door een eenvoudig microgolf-synthesesysteem dat gistextract gebruikt als reductant. Bovendien biedt de effectieve functionalisatie van GO met bio-compatibele chitosaan een potentieel platform voor efficiënte medicijnlading en -levering. Medicijnlading en -afgifte studies toonden aan dat adriamycine efficiënt werd geladen op en vrijgegeven van de ChrGO nanovellen. De ChrGO/adriamycine composieten toonden significante antitumoractiviteit in een concentratie-afhankelijke manier. In het bijzonder resulteerde de combinatiebehandeling met ChrGO/adriamycine en trastuzumab in een verbeterde groeiremmingseffect in BT-474 cellen vergeleken met monotherapie. De synergistische antitumorale effectiviteit van deze agenten werd onthuld als gemedieerd door celcyclusarrest en apoptose, wat uiteindelijk leidde tot kankerceldood. Dit werk rapporteerde een veelbelovende route voor de snelle en kosteneffectieve productie van ChrGO composieten, die chemotherapie agenten in een spatio-temporaal gecontroleerde manier leverden voor efficiënte kankerbehandeling (Schema 1).

Materialen en Methodes

Materialen

Grafietpoeder werd verkregen van Qingdao Huatai Tech (Qingdao, China). Chitosaan en adriamycine werden gekocht van Aladdin Co., Ltd. (Shanghai, China). Trastuzumab werd gekocht van Hoffmann-La Roche Ltd (Basel, Zwitserland). Roswell Park Memorial Institute-1640 (RPMI-1640), Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) en foetale runderserum (FBS) werden gekocht van Invitrogen Corporation (Camarillo, VS). Amicon^® Ultra centrifugaalfilters werden gekocht van Merck Millipore. CellTiter 96^® aqueous one solution celproliferatie assay kit en Caspase-Glo^® 3/7 assay systeem kit werden verkregen van Promega Corporation (Madison, VS). Droge bakkersgist werd verkregen van AB/Mauri Co., Ltd. BT-474 en Cos-7 cellijnen werden verkregen van de Celbank van de Chinese Academie van Wetenschappen (Shanghai, China). Luria-Bertani medium werd gekocht van Sangon Biotech Co., Ltd. Alle chemicaliën waren analytische graad en commercieel beschikbaar zonder verdere zuivering.

Microgolf-geassisteerde Reductie van Chitosaan-gefunctionaliseerde GO

Grafietoxide (GO) werd bereid van native grafietvlokken met een gemodificeerde Hummers methode [14]. Om een enkele laag nano-grote GO te verkrijgen, werd de GO geëxfolieerd met een ultrasonische proef (Scientz, China) werkend bij 800 W gedurende 8 u. Ten slotte werd de geëxfolieerde GO gedispergeerd in gedemineraliseerd water voor verder gebruik. De gedeeltelijk gereduceerde chitosaan-GO (ChrGO) nanovellen werden gesynthetiseerd door microgolf-geassisteerde reductie van GO met chitosaan waterige oplossing met behulp van een microgolf-synthesesysteem. Het celvrije gistextract werd gebruikt voor de biosynthese van ChrGO via microgolf-geassisteerde reductie. Eerst werden de voorraad gistcellen geactiveerd door inenting in Luria-Bertani medium en schudden bij 135 rpm gedurende 18 u bij 25 °C. De geactiveerde gistcellen werden overgebracht in 2% sucrose oplossing schuddend bij 135 rpm voor nog eens 6 u bij 25 °C. Vervolgens werd 6 mL celvrij gistextract verkregen door centrifugaal scheiding bij 2000 rpm gedurende 5 min. Dan werd 50 mg chitosaan opgelost in 25 mL 2% (v/v) azijnzuuroplossing en gemengd met gistextract [20]. Een 5 mg GO oplossing werd toegevoegd onder hevig magnetisch roeren. Ten slotte werd de zo bereide oplossing overgebracht in NOVA-2S microgolf-syntheseapparatuur (PreeKem Scientific Instruments, China) voor de microgolfreactie. Het verwarmingsschema voor het microgolfsysteem omvatte verwarmen tot 80 °C gedurende 5 min en het vasthouden van de temperatuur voor nog eens 5 min. De verkregen ChrGO werd gezuiverd met een 100-kDa MWCO filter (Millipore, VS) en vriesgedroogd voor verder gebruik.

Karakterisaties

Transmissie elektronenmicroscopie (TEM) afbeeldingen van nano-grote GO werden verkregen op een JEM-2100 transmissie elektronenmicroscoop met een versnellingsspanning van 200 kV (JEOL, Japan). Ultraviolet-zichtbaar (UV-Vis) spectra werden verkregen met een UV/Vis/NIR spectrophotometer Lambda 950 (Perkin-Elmer, VS). Fourier transform infrarood (FTIR) spectra werden verzameld door gebruik te maken van een Vertex 70 FTIR spectrometer scannend van 4000 tot 400 cm⁻¹ met monsters voorbereid als KBr pelletten (Bruker, Duitsland). Raman spectra werden opgenomen met een Senterra R200-L Raman microscoop met een opwekking golflengte van 532 nm (Bruker Optics, Duitsland). Röntgendiffractie (XRD) patronen werden onderzocht door een Bruker D8 Advance diffractometer (Bruker, Duitsland). De oppervlakteelementen werden opgenomen met Röntgenfotoelektronspectroscopie (XPS) Kratos AXIS Ultra DLD met monochromatische Al Ka straling (1486,6 eV) (Shimadzu, Japan). Thermogravimetrische analyse (TGA) werd uitgevoerd op een PerkinElmer Pyris 1 TGA bij een verwarmingssnelheid van 5 °C/min van 30 tot 800 °C in een stikstofatmosfeer (PerkinElmer, VS). De oppervlaktelading van de composieten werd gemeten met een Malvern Zeta Nano ZS-90 instrument (Malvern, VK).

Medicijnlading en -afgifte

Vier milligram ChrGO nanopartikelen werd opgeschud in 20 mL adriamycine waterige oplossing (0,4 mg/mL). Na sonicatie gedurende 0,5 u, werd roeren uitgevoerd in het donker gedurende 24 u, licht vermijdend. De niet-geladen adriamycine werd verwijderd door centrifugaal filtratie door 50-kDa MWCO Amicon filters (Millipore, VS) en weggewassen met fosfaatgebufferde saline (PBS, pH 8,0) tot de supernatant kleurloos werd. De concentratie van adriamycine werd bepaald met een standaard adriamycine concentratiecurve door UV-Vis spectrometrie bij 490 nm met een SpectraMax^® M5 microplaatlezer (Molecular Devices, VS). Het bedrag adriamycine lading op ChrGO werd bepaald met een UV-Vis absorbantie door de concentratie van het verlies van adriamycine in de supernatant van Amicon^® Ultra-15 mL centrifugaalfilter te meten.

De adriamycine afgiftekenmerken van ChrGO werden bestudeerd. De adriamycine-geladen ChrGO werd ondergedompeld in 10 mL PBS bufferoplossing. Op gespecificeerde intervallen werd 2 mL vrijgegeven adriamycine oplossing losgemaakt van ChrGO verzameld door centrifugaal filtratie door 50-kDa MWCO Amicon filters (Millipore, VS). Het volume van ChrGO/adriamycine oplossing werd constant gehouden door 2 mL verse PBS bufferoplossing toe te voegen na elke bemonstering. Het bedrag adriamycine vrijgegeven van ChrGO werd gemeten door een UV-Vis absorbantie bij 490 nm door een SpectraMax^® M5 microplaatlezer (Molecular Devices, VS). De afgifte studies werden onderzocht in verschillende pH oplossingen (pH waarden 5 en 7,4).

Bio-compatibiliteitsanalyse en Therapeutische Effectiviteit Assay

BT-474 en Cos-7 cellen werden onderhouden in RPMI-1640 aangevuld met 10% FBS of DMEM aangevuld met 10% FBS, respectievelijk, en gecultureerd in een vochtige atmosfeer van 5% CO₂ bij 37 °C. De bio-compatibiliteitsassay van GO en ChrGO werd uitgevoerd op BT-474 of Cos-7 cellen via celcytotoxiciteitsassay. Cellen werden gezaaid in 96-put platte platen bij een dichtheid van 3 × 10⁴ cellen per put en voorgeïncubeerd gedurende 18 u voor behandeling met GO en ChrGO. Vervolgens werden de verdunningen van de geteste agenten aan de cellen toegevoegd en geïncubeerd voor nog eens 24 u. De levensvatbaarheid van de cellen werd bepaald door CellTiter 96^® aqueous one solution. De absorbantie werd gemeten bij 490 nm door een SpectraMax^® M5 microplaatlezer (Molecular Devices, VS).

De effectiviteit van ChrGO/adriamycine complexen alleen of in combinatiebehandeling met trastuzumab op proliferatie in BT-474 cellen werd onderzocht door proliferatie-inhibitie assay [16]. BT-474 cellen werden gezaaid in 96-put platte platen bij een dichtheid van 1 × 10⁴ cellen per put en geïncubeerd gedurende 24 u. Vervolgens werden ChrGO/adriamycine complexen alleen of in gecombineerde behandeling met trastuzumab geïntroduceerd in de BT-474 cellen in het cultuurmedium. Na 96-u incubatie, werden de levensvatbare cellen bepaald door CellTiter 96^® aqueous one solution. De absorbantie werd gemeten met een SpectraMax^® M5 microplaatlezer bij 490 nm (Molecular Devices, VS). De data werden geanalyseerd met eenrichtings ANOVA. p < 0,05 werd als statistisch significant beschouwd.

Celcyclusanalyse en Apoptose Assay

Voor celcyclusanalyse, werden BT-474 cellen gezaaid in zes-put platen bij een dichtheid van 5 × 10⁵ cellen per put en toegestaan om 16 u te hechten. De cellen werden behandeld met ChrGO/adriamycine complexen alleen of in combinatie met trastuzumab gedurende 24 u. BT-474 cellen werden geoogst en gefixeerd met 70% (v/v) ethanol bij 4 °C gedurende 24 u. De gefixeerde BT-474 cellen werden gekleurd met propidium iodide oplossing (15 μg/mL) bevattende ribonuclease A (10 μg/mL) bij 25 °C gedurende een uur. Vervolgens werden de cellen geanalyseerd met een stroomcytometer (BD Biosciences, VS). Voor de apoptose assay, werden BT-474 gezaaid in witgewande 96-put platen bij een dichtheid van 2 × 10⁴ cellen per put en toegestaan om 18 u te hechten. De cellen werden behandeld met ChrGO/adriamycine complexen, trastuzumab alleen of in combinatiebehandeling gedurende 24 u. Vervolgens werd het cultuurmedium weggegooid, en 100 µL Caspase-Glo^® 3/7 reagent werd aan elke put toegevoegd en geïncubeerd bij RT gedurende 2 u. Luminescentie werd gemeten door een SpectraMax^® M5 microplaatlezer (Molecular Devices, VS). De resultaten werden geanalyseerd door eenrichtings ANOVA. p < 0,05 werd als statistisch significant beschouwd. Alle studies werden uitgevoerd in overeenstemming met relevante richtlijnen en regelgeving.

Resultaten en Discussie

Synthese en Karakterisatie

De morfologie van de zo gesynthetiseerde GO vellen werd gekarakteriseerd door transmissie elektronenmicroscopie (TEM). Figuur 1a onthult de uniforme grootteverdeling van GO nanovellen onder 100 nm, met een gemiddelde grootte van ongeveer 45 nm. De hoge elektrondichtheid van GO vertoonde betere contrast vergeleken met chitosaan, wat nauwelijks zichtbaar is door de lage elektrondichtheid en gehydrateerde natuur [21]. Vanwege de hogere oppervlakte, zijn nanoschaal GO of gereduceerde GO vellen breed gebruikt als medicijndragers [22]. Het geselecteerde-gebied elektrondiffractie (SAED) patroon in Fig. 1c toont de concentrische ringen, wat de aanwezigheid van een polykristallijne aard aantoont corresponderend met grafene-oxide [23].

Om GO nanovellen in fysiologische oplossing te stabiliseren, werden chitosaan-gefunctionaliseerde GO nanovellen bereid door microgolf-geassisteerde reductie met een microgolfsysteem [24]. De resulterende gereduceerde GO-chitosaan (ChrGO) werd geanalyseerd door UV-Vis spectrometrie. Figuur 2a toont de UV-Vis spectra van GO en ChrGO. GO vertoonde een scherpe absorptiepieken bij 230 nm en een schouder bij 300 nm, wat toegeschreven wordt aan de π–π* overgang van aromatische C=C bindingen en n–π* overgang van C=O bindingen, respectievelijk [25, 26]. Nadat chitosaan op GO was geënt, verschoven de piek bij 230 nm naar 270 nm voor ChrGO, en de schouder bij 300 nm verdween duidelijk, wat toegeschreven werd aan de gedeeltelijke herstel van elektronische conjugatie onder de aromatische koolstofatomen [27]. Een zwarte oplossing van gesynthetiseerde ChrGO wordt getoond in Fig. 2b, wat de vorming van gedeeltelijk gereduceerde grafene-oxide (p-rGO) aangeeft. Zowel de GO nanovellen als ChrGO waren goed gedispergeerd in gedemineraliseerd H₂O. De colloïdale stabiliteit van GO of GO derivaten in waterige oplossing is heel belangrijk voor hun biomedische toepassing. De resultaten gaven aan dat de chitosaan geconjugeerd was met GO na de reductie.

FTIR spectroscopie werd uitgevoerd om de structuur van GO, chitosaan en ChrGO te karakteriseren (Fig. 3a). De karakteristieke pieken van GO waren gesitueerd bij 3440 cm⁻¹ en 1376 cm⁻¹, corresponderend met O–H en C–OH bindingen, respectievelijk. De piek bij 1072 cm⁻¹ werd toegewezen aan de rektrilling van C–N–C. Opvallend, de pieken van chitosaan moleculen bij 2912 cm⁻¹ en 2848 cm⁻¹ werden toegeschreven aan de rektrillingen van de CH₃– en –CH₂– [28, 29]. Gefunctionaliseerde p-rGO met chitosaan resulteerde in nieuwe bindingen, wat leidde tot nieuwe pieken in de ChrGO spectra. Er is een significante afname in de intensiteiten van de C=O band bij 1636 cm⁻¹ in ChrGO vergeleken met die in GO, wat suggereert dat het reductieproces de zuurstofbevattende groepen van GO verwijderde [30]. Het FTIR spectrum van ChrGO bevestigde de succesvolle conjugatie van chitosaan op GO. Bovendien werd Raman spectroscopie gebruikt om de elektronische eigenschappen en structuur van grafene te karakteriseren. De G-band wordt toegeschreven aan de E_2g fononen van sp² koolstofdomeinen, terwijl de D-band toegewezen wordt aan de trilling van sp³ koolstofatoomdomeinen en ongestructureerde koolstofatomen. De intensiteit van de D-band geeft de kenmerken van wanorde en defecten in koolstofvellen aan [31]. De reductie van GO nanovellen werd ook geanalyseerd in het signaalverhouding van de D versus G-band [32]. Het representatieve Raman spectrum van GO toont twee karakteristieke pieken van de D-band (1341 cm⁻¹) en de G-band (1591 cm⁻¹) in Fig. 3b. Verandering in de relatieve intensiteit van I_D/I_G waarde illustreert de verandering in de elektronische conjugatietoestand van de GO in het reductieproces [33]. De verschuiving van de D-band toont succesvolle functionalisatie van gereduceerde GO. De waarde van I_D/I_G neemt toe van 0,99 (GO) tot 1,12 (ChrGO), wat toegeschreven wordt aan de introductie van sp3 defecten na functionalisatie en onvolledig herstel van de grafene-karakteristieke structuur [34]. Deze waarneming is in goede overeenstemming met het eerdere rapport en suggereert de vorming van chitosaan-gefunctionaliseerde grafene [16].

De oppervlaktesamenstelling van ChrGO werd bevestigd door XPS. De volledige scan van het XPS spectrum van ChrGO toont drie pieken bij 284, 399 en 533 eV, die toegewezen worden aan C1s, N1s en O1s (Fig. 4a), respectievelijk. De relatieve elementaire analyse toonde een toename in de ChrGO zuurstof- en stikstofniveaus, met een bijbehorende afname in de koolstofinhoud vergeleken met GO. De hoge-resolutie C1s spectra van ChrGO getoond in Fig. 4b tonen vier gescheiden pieken, corresponderend met C–C of C=C (sp², 284,7 eV), C-O (epoxy/hydroxylen, 286,4 eV), C=O (sp³, 288,2 eV) en O=C–O (carboxylaten, 289,1 eV) bindingen. Het verschijn van een amide piek in ChrGO levert bewijs voor de functionalisatie van chitosaan op GO [35]. De overvloedige hydrofiele functionele groepen op het oppervlak maakten ChrGO hoog oplosbaar in een waterige oplossing, wat consistent is met de FTIR resultaten. Biomoleculen zoals reductieve aminozuren en alpha-linoleenzuur in het gistextract kunnen een significante rol spelen in de microgolf-geassisteerde fabricage van ChrGO [20].

Het Röntgendiffractie (XRD) patroon van GO en ChrGO wordt gepresenteerd in Fig. 5a. In GO XRD spectra, is de hoofdpiek bij 11,0° en zwakke piek bij 20,7° duidelijk de grafietstructuur present. De kenmerkende diffractiepieken bij 11,0° corresponderend met het (001) vlak van GO, wat de succesvolle synthese van GO aantoont [36]. De kleine buiging tussen 20° en 24° toont de grafietachtige moiety, wat toegeschreven wordt aan de ongeoxideerde pristine grafiet [37]. Met de functionalisatie van chitosaan, verdwijnt de (001) piek van GO, terwijl de brede diffractiepieken bij 21,4° prominent wordt. Deze verschuiving kan toegeschreven worden aan de reductie van de GO, waar de reductie de rGO strakker laat pakken dan de GO. De (002) reflectie van ChrGO monster is heel breed, wat suggereert dat het monster heel slecht geordend is langs de stapelrichting, wat toegeschreven kan worden aan de onvolledige reductie van GO [33]. De ontledingsgedrag van GO, chitosaan en ChrGO zijn bestudeerd door thermische zwaarteanalyse (TGA) [38]. De TGA curven van ChrGO, GO en chitosaan worden getoond in Fig. 5b, welke gemeten zijn in een stikstofatmosfeer. GO begon gewicht te verliezen onder 100 °C, wat toegeschreven werd aan de eliminatie van geadsorbeerd vrij water in de gestapelde structuur [39]. De GO verloor 42% van zijn gewicht in het bereik van 191–231 °C, wat gerelateerd was aan de ontleding van labil zuurstofbevattende groepen. De snelheid van gewichtsverlies van ChrGO bij 100–250 °C is significant lager dan GO, en het is duidelijk dat ChrGO een ander ontledingspatroon vertoonde vergeleken met GO. De thermische eliminatie van ChrGO en zuivere chitosaan vond plaats van 250 tot 440 °C, wat gerelateerd is aan de depolymerisatie en pyrolyse van meer stabiele functionele groepen, zoals glycosidische eenheden van chitosaan en carboxylgroepen [40]. Vergeleken met GO, was ChrGO thermisch stabiel en gaf een majeure gewichtsverlies van 36% in de eerste ontledingsfase bij 250–440 °C, terwijl weinig gewichtsverlies getoond wordt voor de GO. Het significante gewichtsverlies in het hoge-temperatuurgebied van 450–800 °C was door thermische degradatie van het koolstofskelet, wat toegeschreven kan worden aan de chitosaan residuen en biomoleculen uit gistextract zoals aminozuren [41].

De oppervlaktelading van GO en ChrGO werd gemeten door een Malvern Zeta Nano ZS-90 instrument, wat een belangrijke parameter is van colloïdale stabiliteit. De hogere oppervlakteladingsdichtheid op GO nanovellen creëert een stabielere colloïdale dispersie [42]. Zoals getoond in Aanvullend bestand 1: Fig. S1, daalde de zeta-potentiaal van GO monotoon van − 10,7 mV bij pH 3 tot − 35,5 mV bij pH 11, wat de negatieve lading op het oppervlak van de GO nanovellen bevestigde. De zeta-potentiaal waarde voor ChrGO was relatief minder dan de potentiaal van GO bij elke pH variërend van 3 tot 11. ChrGO nanovellen vertoonden stabiliteit over het gehele bereik van pH waarden, terwijl gereduceerde GO colloïden gerapporteerd werden minder stabiel in gedemineraliseerd water door verhoogde π–π stapeling in de gedesoxideerde oppervlakken [43]. Hoewel enkele vrije amine groepen aanwezig waren op het oppervlak van chitosaan [44], werd een hogere zeta-potentiaal van ChrGO niet bereikt. De lagere zeta-potentiaal waarde van ChrGO kan toegeschreven worden aan de overvloedige negatieve aminozuurmoleculen uit het gistextract, die de colloïdale stabiliteit in fysiologische oplossing verbeterden [20]. Het negatief geladen oppervlak van ChrGO maakt ze potentiëel toepasbaar voor de lading en levering van het medicijn.

Bio-compatibiliteit van Zo Gesynthetiseerde ChrGO

De bio-compatibiliteit van zo gesynthetiseerde ChrGO is belangrijk voor zijn toepassingen in medicijnlevering. De celcytotoxiciteit van ChrGO en GO werd onderzocht door cytotoxiciteitsassay. Cos-7 cellen en BT-474 cellen werden geïncubeerd in de aanwezigheid van zowel ChrGO als GO gedurende 24 u. De resultaten van celcytotoxiciteit worden getoond in Fig. 6. Het kon worden geconcludeerd dat ChrGO geen duidelijke celcytotoxiciteit vertoonde aan Cos-7 en BT-474 cellen. Zelfs bij een concentratie van 100 μg/mL, was de cellevensvatbaarheid boven 90%. Echter, GO vertoonde significante celcytotoxiciteit in een dosis-afhankelijke manier, met slechts 73,0 ± 0,5% en 71,0 ± 0,5% celoverleving voor Cos-7 en BT-474 cellen bij een concentratie van 100 μg/mL, respectievelijk. De resultaten toonden aan dat chitosaan gefunctionaliseerd op het oppervlak van GO de cytotoxiciteit sterk verlaagde en de bio-compatibiliteit verbeterde. Oppervlaktefunctionaliserings van GO met macromoleculen is gerapporteerd om de cytotoxische effecten opmerkelijk te verzwakken [45]. Hu et al. rapporteerden dat foetaal runderserum in celmedium de celcytotoxiciteit van GO in niet-kleincel longkanker A549 cellen aanzienlijk verlaagde [46].

Lading en Afgifte van Medicijn

De potentiële biomedische toepassing van ChrGO als medicijndrager wordt gemeten door de medicijnlading en -afgiftegedrag. De structurele kenmerken van grafene-derivaten zijn hoogst effectief voor aromatische medicijnlevering vanwege hun zeer grote specifieke oppervlakte. Adriamycine is een van de primaire tumorchemotherapeutica tegen een verscheidenheid aan hematologische maligniteiten en solide tumoren en wordt vaak gebruikt als modelmedicijn om grafene-derivaat medicijnleveringssystemen te evalueren [47]. De ladingscapaciteit van adriamycine op ChrGO nanovellen werd geverifieerd door de karakteristieke UV-Vis absorbantiepieken van adriamycine bij 490 nm. Zoals verwacht, was de maximale ladings-efficiëntie van adriamycine gebonden aan ChrGO nanovellen zo hoog als 169,8%, wat deels toegeschreven werd aan de grote oppervlakte van de ChrGO nanovellen. De adriamycine-geladen ChrGO/adriamycine nanocomposieten waren gemakkelijk te disperseren in een fysiologische buffer, met een transparante oplossing met een licht roodachtige kleur.

Om het afgifteprofiel van adriamycine van de ChrGO/adriamycine complexen te verkennen, werden de verschillende pH waarden van PBS geïntroduceerd om tumorcelomgevingen na te bootsen. Aanvullend bestand 1: Fig. S2 toont de cumulatieve afgifteprofielen van adriamycine van de ChrGO/adriamycine bij pH 5 en 7,4. De adriamycine vrijgegeven van ChrGO/adriamycine werd gekarakteriseerd door een initiële snelle afgifte en dan een stadium van langzamere afgifte in pH 5,0 PBS oplossing. De cumulatieve afgifte van adriamycine was 6,5% in de eerste 3 u en toonde toen een langzame toename tot 26,7% in 96 u bij pH 5,0. In tegenstelling, nam de adriamycine percentage van de ChrGO/adriamycine langzamer en lager toe bij pH 7,4, met een afgiftepercentage van adriamycine van 2,5% in de vroege 3 u tot 7,4% in 96 u. Eerdere studies hebben de afgifteprofielen van medicijnen van gefunctionaliseerde GO heel langzaam in een medium bij pH 7,4 getoond [48]. De protonering van carboxylgroepen op ChrGO verlaagt π–π stapeling, H-bindingen en electrostatische interacties tussen adriamycine en ChrGO, wat de afgifte van adriamycine in het azijnzuur medium vergemakkelijkt [49]. De pH-gevoeligheid geeft ChrGO/adriamycine potentieel voor specifieke plaats medicijnlevering, wat vervolgens de cytotoxiciteit in tumorcellen verhoogt.

Therapeutische Effectiviteit van ChrGO/Adriamycine Complexen

De therapeutische effectiviteit van de ChrGO/adriamycine complexen binnen HER2-overexprimerende BT-474 kankercellen werd onderzocht door de proliferatie-inhibitie assay. Overexpressie van de HER2 receptor heeft een sleutelrol in de transformatie van BT-474 borstkankercellen. Behandeling met trastuzumab alleen, een anti-HER2 monoclonale antilichaam, resulteert in significante groeiremming van BT-474 cellen [50]. Zoals getoond in Fig. 7a, na behandeling met ChrGO/adriamycine complexen, daalde de cellevensvatbaarheid van BT-474 cellen significant, demonstrerend een dosis-afhankelijk toxisch effect. Daarnaast, vergeleken met vrije adriamycine, toonden de ChrGO/adriamycine complexen een minder effectieve prestatie in het doden van BT-474 cellen, wat toegeschreven werd aan de geleidelijke diffusie van geladen adriamycine in plaats van directe behandeling met vrije adriamycine [51]. Echter, de therapeutische effectiviteit van de ChrGO/adriamycine complexen was dicht bij die van vrije adriamycine als hun concentratie van ChrGO/adriamycine complexen toenem, wat kan worden verklaard door de gesustineerde adriamycine afgifte van de ChrGO drager.

Om te bestuderen of trastuzumab, een anti-HER2 monoclonale antilichaam, de antitumoractiviteit van equivalente hoeveelheden adriamycine geladen op ChrGO kon verbeteren, werden BT-474 cellen behandeld met trastuzumab alleen of in combinatie met ChrGO/adriamycine. Behandeling met trastuzumab alleen produceerde een significante inhibitie van BT-474 proliferatie, wat consistent is met een eerdere rapportage [52]. De gecombineerde therapie met trastuzumab en ChrGO/adriamycine resulteerde in een verbeterd celgroei-inhibitie-effect, zoals getoond door een reductie van 88,5% vergeleken met een reductie van 54,5% met trastuzumab alleen (5 μg/mL) en 59,5% met equivalent ChrGO/adriamycine alleen (5 μg/mL) versus de negatieve controle (Fig. 7b). De resultaten suggereren dat het ChrGO systeem effectief kan worden gebruikt om composieten te ontwikkelen voor combinatietherapieën, en de gecombineerde behandeling van ChrGO/adriamycine en trastuzumab resulteerde in een bescheiden, maar significante reductie van cellevensvatbaarheid vergeleken met elk medicijn alleen.

Celcyclusanalyse en Apoptose

Om te bepalen of de ChrGO/adriamycine complexen effecten hebben op celcyclusvoortgang, werd een celcyclusassay van ChrGO/adriamycine complexen alleen of in combinatiebehandeling met trastuzumab uitgevoerd op BT-474 cellen. Zoals getoond in Fig. 8a, onthulde stroomcytometrieanalyse dat trastuzumab alleen de celpopulatie in de G0/G1 fase verhoogde. Behandeling met ChrGO/adriamycine alleen gemedieerde een significante reductie in het aantal G0/G1 cellen en accumulatie in S-fase en G2/M-fase vergeleken met controlecellen. Daarnaast gemedieerde ChrGO/adriamycine gecombineerd met trastuzumab S-fase arrest, vergezeld van een significante afname in het aantal cellen in de G0/G1 fase. Terwijl ChrGO/adriamycine meest actief is in de S-fase van de celcyclus, kan ChrGO/adriamycine behandeling met trastuzumab een toename in G0/G1 fase veroorzaken vergeleken met ChrGO/adriamycine alleen. Een eerdere rapportage toonde aan dat trastuzumab celarrest in de G1 fase kan veroorzaken [53]. Adriamycine remt celproliferatie en DNA-replicatie, wat uiteindelijk leidt tot celcyclusarrest [54].

Om de effecten van ChrGO/adriamycine op apoptotische moleculen te beoordelen, werden BT-474 cellen gedurende 48 u behandeld met ChrGO/adriamycine, trastuzumab, of een combinatiebehandeling van beide agenten. Voor de visualisatie van apoptose, is caspase 3/7 activiteit uitgebreid gebruikt als apoptose-specifieke marker vanwege zijn activiteit gerelateerd aan het proces van apoptose [55]. Zoals waargenomen uit Fig. 8b, vergeleken met de negatieve controle, verhoogde behandeling met ChrGO/adriamycine (5 μg/mL) alleen significant de caspase 3/7 activiteit. Echter, trastuzumab (5 μg/mL) alleen verhoogde caspase 3/7 expressie niet significant, wat suggereert dat trastuzumab geen apoptose induceert. In tegenstelling, verhoogde behandeling met ChrGO/adriamycine (5 μg/mL) plus trastuzumab (5 μg/mL) significant de caspase 3/7 activiteit vergeleken met die met elk medicijn alleen. De dubbele-gerichte therapie toonde hogere apoptose, wat superieure therapeutische effectiviteit aangeeft door de aanwezigheid van verschillende werkingsmechanismen. Vergelijkbaar met andere studies, versterkt adriamycine de apoptotische respons in HER2-overexprimerende kankercellen [56]. Concluderend, induceert ChrGO/adriamycine gecombineerd met trastuzumab celcyclusarrest en apoptose, wat uiteindelijk resulteert in verhoogde celdood.

Conclusies

In het huidige werk werden de chitosaan-gefunctionaliseerde grafene-oxide nanovellen gestructureerd met microgolf-geassisteerde reductie, wat bio-compatibiliteit en goede dispersiestabiliteit demonstreerde. De zo bereide nanocomposieten toonden hoge efficiëntie van medicijnencapsulatie en -levering. De ChrGO/adriamycine nanovellen toonden significante groeiremming van BT-474 in een dosis-afhankelijke manier. De gecombineerde behandeling van ChrGO/adriamycine en trastuzumab resulteerde in superieure therapeutische effectiviteit in BT-474 cellen vergeleken met die met elk agent alleen. De resultaten zijn gunstig voor de ontwikkeling van intracellulaire nanodragers om medicijnen op een gecontroleerde manier te leveren, wat verwacht wordt de therapeutische effect te verbeteren op HER2-overexprimerende kankertherapieën.

Beschikbaarheid van data en materialen

De datasets die de conclusies van deze huidige studie ondersteunen, zijn beschikbaar van de corresponderende auteurs op redelijk verzoek.

Afkortingen

ChrGO:

Chitosaan-gefunctionaliseerde grafene-oxide

EGFR:

Epidermale groeifactorreceptor

HER2:

Humane epidermale groeifactorreceptor-2

GO:

Grafene-oxide

DMEM:

Dulbecco's modified Eagle medium

FBS:

Foetale runderserum

TEM:

Transmissie elektronenmicroscopie

UV-Vis:

Ultraviolet-zichtbaar

FTIR:

Fourier transform infrarood

XRD:

Röntgendiffractie

XPS:

Röntgenfotoelektronspectroscopie

TGA:

Thermogravimetrische analyse

PBS:

Fosfaatgebufferde saline

SAED:

Geselecteerd-gebied elektrondiffractie

TGA:

Zwaarteanalyse