CKAP4 Antilichaam-geconjugeerde Si Quantum Dot Micellen voor gerichte beeldvorming van longkanker

Abstract

Op dit moment zijn verschillende fluorescerende nanomaterialen ontworpen en gesynthetiseerd als optische contrastmiddelen voor chirurgische navigatie. Er zijn echter geen rapporten over de bereiding van fluorescerende contrastmiddelen voor navigatie bij longkankerchirurgie met behulp van siliciumquantumdots (Si QD's). Deze studie verbeterde en wijzigde de in water dispergeerbare Si QD-micellen gerapporteerd door Pi et al. om Si QD-micellen-CKAP4 te bereiden. De gegevens toonden aan dat de Si QD-micellen-CKAP4 bolvormige deeltjes waren met een gemiddelde hydrodiameter van ongeveer 78,8 nm. UV-zichtbare absorptie van de Si QD-micellen-CKAP4 varieerde van 200 tot 500 nm. Met een excitatiegolflengte van 330 nm werd een sterke fluorescentie bij 640 nm waargenomen in de fluorescentie-emissiespectra. Laserconfocale microscopie en fluorescentiemicroscopie-assay toonde aan dat de Si QD-micellen-CKAP4 in vitro een goed richtvermogen vertoonden op longkankercellen en longkankerweefsels. De in vivo fluorescentie-beeldvormingstest toonde aan dat de Si QD-micellen-CKAP4 werd gemetaboliseerd door de lever en uitgescheiden door de nier. Bovendien richtten Si QD-micellen-CKAP4 zich specifiek op longkankerweefsel in vivo in vergelijking met gezond longweefsel. Cytotoxiciteit en hematoxyline- en eosinekleuringsassays toonden aan dat de Si QD-micellen-CKAP4 een hoge bioveiligheid vertoonden in vitro en in vivo. Si QD-micellen-CKAP4 is een specifiek gericht beeldvormend middel voor longkanker en zal naar verwachting in de toekomst een fluorescerend contrastmiddel zijn voor chirurgische navigatie bij longkanker.

Inleiding

Kanker is een van de belangrijkste ziekten die de menselijke gezondheid wereldwijd bedreigt [1]. Onder hen behoren de incidentie en mortaliteit van longkanker tot de hoogste van alle kwaadaardige tumoren en vertonen ze elk jaar een stijgende trend [2]. Chirurgische resectie is de primaire behandeling voor solide tumoren. De methoden om kwaadaardig weefsel te onderscheiden van gezond weefsel zijn echter voornamelijk beperkt tot tactiele en visuele aanwijzingen en de ervaring van de chirurg [3].

In de afgelopen jaren is fluorescentiegeleide chirurgie populair geworden in het onderzoeksveld in realtime intra-operatieve begeleiding voor tumorresectie [4]. Met behulp van een fluorescentiecontrastmiddel en een fluorescentiebeeldvormingssysteem kunnen chirurgen realtime beeldgeleiding gebruiken om de primaire tumoren te verwijderen en resterende tumoren in de operatieholte te identificeren. Vergeleken met traditionele biomedische beeldvormingsmethoden biedt het fluorescentiebeeldvormingssysteem verschillende voordelen, zoals de afwezigheid van ioniserende straling en een hoge ruimtelijke resolutie [3, 5, 6].

Op dit moment hebben onderzoekers verschillende fluorescerende nanomaterialen gerapporteerd voor biologische beeldvorming [7, 8]. Onder hen zijn silicium kwantumdots (Si QD's) populair geworden op het gebied van biologische beeldvorming [9,10,11]. Er zijn echter geen rapporten over de bereiding van fluorescerende contrastmiddelen voor navigatie bij longkankerchirurgie met behulp van Si QD's.

In 2014 hebben Pi et al. rapporteerde een synthesemethode voor nieuwe in water dispergeerbare Si QD-micellen [12]. De onderzoeksgegevens toonden aan dat Si QD-micellen voordelen vertoonden, waaronder regelbare grootte, hoge fluorescentiekwantumefficiëntie en uitstekende lichtstabiliteit [12]. Deze studie is gericht op het verbeteren en wijzigen van de in water oplosbare Si QD-micellen die zijn gerapporteerd door Pi et al. om een nieuw fluorescerend contrastmiddel te bereiden, dat naar verwachting in de toekomst zal worden gebruikt als fluorescerend contrastmiddel voor navigatie bij longkankerchirurgie.

In 2018 hebben Yanagita et al. rapporteerde dat CKAP4 in hoge mate tot expressie wordt gebracht in het serum en kankerweefsel van longkankerpatiënten en dat het kan worden gebruikt als een nieuwe biomarker voor de vroege diagnose van longkanker [13]. Daarom kunnen CKAP4-antilichaam-geconjugeerde Si QD-micellen een nieuw fluorescerend contrastmiddel zijn, dat zou kunnen worden gebruikt als een fluorescerend contrastmiddel voor navigatie bij longkankerchirurgie.

In deze studie werd DSPE-PEG-COOH gebruikt om Si QD-micellen te bereiden met carboxylgroepen op hun oppervlak. Vervolgens hebben we het CKAP4-antilichaam geconjugeerd met Si QD-micellen met behulp van EDC. De resultaten toonden aan dat de Si QD-micellen-CKAP4 goed dispergeerden in een waterige oplossing. De Si QD-micellen-CKAP4 vertoonden sterke rode fluorescentie onder bestraling met ultraviolet licht bij 365 nm. Door de conjugatie van antilichaam vertoonden Si QD-micellen-CKAP4 een goed richtvermogen op longkankercellen en -weefsels, zowel in vitro als in vivo. Bovendien vertoonden de Si QD-micellen-CKAP4 zowel in vitro als in vivo een hoge bioveiligheid. In deze studie hebben we een potentieel fluorescerend contrastmiddel voorbereid voor navigatie bij longkankerchirurgie.

Methoden

Reagentia

Runderserumalbumine (BSA) werd gekocht bij Sigma (assay -98%; Missouri, VS); tetrahydrofuran (THF) van Adamas-beta (zuiverheid:99,9%; Bazel, Zwitserland); DSPE-PEG-COOH van Aladdin (Shanghai, China); CKAP4-antilichaam van Abcam (0,55 mg/ml; Cambridge, VK); Dulbecco's gemodificeerd adelaarsmedium (DMEM) en fosfaatbufferzout (PBS) van Hyclone (Utah, VS); foetaal runderserum (FBS) en tyrisine van Gibco (New York, VS); paraformaldehyde (4%), immunokleuring permeabilisatiebuffer met Triton X-100 en blokkeerbuffer voor immunokleuring van Beyotime (Shanghai, China); glycerine van Solarbio (zuiverheid ≥ 99%; Beijing, China); en trypsine uit Kingmorn (0,25%; Shanghai, China).

Instrumentatie

Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) -beelden werden gemaakt met behulp van JEM-2100F elektronenmicroscopie (JEOL, Tokyo, Japan). Hydrodiameter werd bepaald met behulp van JEM Zetasizer Nano-ZS90 (Malvern Instruments, Malvern, VK). UV-Vis-absorptiespectra werden verkregen met behulp van Cary 50-spectrofotometer (Varian, Palo Alto, CA, VS). Fluorescentie-emissiespectrum werd verkregen met behulp van F-182 4500 spectrofotometer (Hitachi Ltd., Tokyo, Japan). Röntgenfoto-elektronspectroscopie (XPS) werd uitgevoerd met behulp van RBD-opgewaardeerd PHI-5000C ESCA-systeem (Perkin Elmer, Waltham, MA, VS). Fotoluminescentie (PL) kwantumopbrengsten (QY's) werden geschat met behulp van fluorescentiespectrometer (FLS1000, Edinburgh Instruments, Livingston, Engeland). Fourier-transformatie infraroodspectroscopie (FTIR) werd uitgevoerd met behulp van Thermo IS50 (Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, VS). Röntgendiffractie (XRD) is getest door SmartLab (Rigaku Corporation, Tokyo, Japan).

Cellen

A549- en 293 T-cellijnen zijn gekocht bij het Shanghai Institute of Cell Biology (Shanghai, China).

Voorbereiding van Si QD-micellen

Eerst werden dodecly-Si QD's bereid door een hydrosilyleringsreactie en opgelost in THF om een dodecly-Si QDs-oplossing (15 mg/ml) te bereiden volgens een eerder gerapporteerde methode [12]. Vervolgens werd 20 mg DSPE-PEG-COOH opgelost en gemengd in 10 ml gedeïoniseerd water om DSPE-PEG-COOH-oplossing (2 mg/ml, 10 ml) te bereiden. Vervolgens werd langzaam druppelsgewijs een dodecly-Si QDs-oplossing (15 mg/ml, 66 µL) toegevoegd aan een 10 ml DSPE-PEG-COOH-oplossing. Na 3 minuten ultrasoon roeren werd een heldere en transparante oplossing verkregen. De oplossing werd vervolgens in een zuurkast geplaatst en 12 uur in het donker geroerd. Vervolgens werd de oplossing 24 uur gedialyseerd en vervolgens 3 dagen gevriesdroogd om de Si QD-micellen te verkrijgen.

Voorbereiding van Si QD Micelles-CKAP4

In deze studie werd CKAP4-antilichaam geconjugeerd met Si QD-micellen door de carboxylgroep te activeren door EDC [14]. De methode was als volgt:4 mg Si QD-micellen werd gedispergeerd in 900 µL PBS om de Si QD-micellen-oplossing te bereiden. EDC (10 mg) werd toegevoegd aan 100 µL PBS om de EDC-oplossing te bereiden. Vervolgens werd 100 L EDC-oplossing langzaam toegevoegd aan 900 µL Si QD-micellen, met ultrasoon roeren gedurende 5 minuten. Verder werd langzaam 20 µL CKAP4-antilichaam toegevoegd en werd het mengsel van de oplossing gedurende 2 uur bij kamertemperatuur in het donker geroerd. Het product werd vervolgens gedurende 15 minuten bij 4000 rpm aan ultrafiltratie onderworpen. Na drie keer wassen met PBS werd het product Si QD-micellen-CKAP4 genoemd.

Cytotoxiciteitstest

In deze studie werd trypanblauw gebruikt om de bioveiligheid van de nanomaterialen te testen [15]. De A549- en 293 T-cellen werden geïncubeerd in een plaat met 24 putjes (1 × 10⁶ /putje) bij 37 ° C gedurende 12 uur. Na het weggooien van het medium werd een reeks concentraties Si QD-micellen of Si QD-micellen-CKAP4 (Si-concentratie:0-152 µg/ml) toegevoegd aan een 24-wells plaat en gedurende 2 uur bij 37 ° C geïncubeerd. Na het weggooien van het medium werden de cellen verzameld en tweemaal gewassen met PBS. Trypanblauw werd gemengd met de celsuspensie in een verhouding van 1:1. Het aantal levende en dode cellen werd gedetecteerd en geregistreerd met Countstar. Levensvatbaarheid van de cellen (%) = aantal levende cellen/(aantal levende cellen + aantal dode cellen) × 100. Er werden drie biologische replica's gebruikt. Prism-software (versie 7.01; GraphPad Software, San Diego, CA, VS) werd gebruikt voor statistische analyse. De gegevens werden geanalyseerd met behulp van tweerichtings-ANOVA met de posttest van Dunnett. Statistische significantie werd vastgesteld op P < 0.05. *P < 0,05; **P < 0,01; en ***P < 0.001.

Nanomaterialen richten zich in vitro op longkankercellen

Het richtend vermogen van Si QD-micellen en Si QD-micellen-CKAP4 op longkankercellen in vitro werd als volgt gedetecteerd:eerst werden A549-cellen geïncubeerd in confocale laserschalen (3 × 10⁵ cellen/schaal) bij 37 ° C gedurende 12 uur. Na het weggooien van het medium werden de cellen driemaal gewassen met PBS. Vervolgens werd 1 ml paraformaldehyde (4%) aan de cellen toegevoegd en gedurende 10 minuten bij 25 ° C geïncubeerd. Na het weggooien van het paraformaldehyde werden de cellen driemaal gewassen met PBS. Vervolgens werd 1 ml permeabilisatiebuffer voor immunokleuring met Triton X-100 aan de cellen toegevoegd en gedurende 10 minuten bij 25 ° C geïncubeerd. Na het weggooien van de immunokleuring-permeabilisatiebuffer met Triton X-100, werden de cellen driemaal gewassen met PBS. Vervolgens werd 1 ml blokkeringsbuffer voor immunokleuring aan de cellen toegevoegd en gedurende 10 minuten bij 25 ° C geïncubeerd. Na het weggooien van de blokkeerbuffer voor immunokleuring, werden de cellen driemaal gewassen met PBS. Vervolgens werden 200 µL Si QD-micellen of Si QD-micellen-CKAP4 (Si-concentratie 150 g / ml) aan de cellen toegevoegd en gedurende 2 uur bij 37 ° C geïncubeerd. Na het weggooien van de nanomaterialen werden de cellen drie keer gewassen met PBS. Foto's werden gemaakt met behulp van een laserconfocale microscoop (Leica, Wetzlar, Duitsland). Het excitatielicht was ingesteld op 405 nm en de emissiegolflengte was ingesteld op 630 nm.

Het vermogen van Si QD-micellen en Si QD-micellen-CKAP4 naar normale cellen in vitro werd als volgt gedetecteerd:eerst werden 293 T-cellen verzameld in Eppendorf-buisjes van 1,5 ml met een dichtheid van 1 × 10⁶ cellen/buis. Na 5 minuten centrifugeren bij 1000 rpm werd het supernatant weggegooid. Vervolgens werd 1 ml paraformaldehyde (4%) aan de cellen toegevoegd en gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd. Na 5 minuten centrifugeren bij 1000 rpm werd het supernatant weggegooid. De cellen werden vervolgens driemaal gewassen met PBS. Vervolgens werd 1 ml permeabilisatiebuffer voor immunokleuring met Triton X-100 aan de cellen toegevoegd en gedurende 10 minuten bij 25 ° C geïncubeerd. De cellen werden vervolgens gedurende 5 minuten bij 1000 tpm gecentrifugeerd. Na het weggooien van het supernatant werden de cellen driemaal gewassen met PBS. Vervolgens werd 1 ml blokkeringsbuffer voor immunokleuring aan de cellen toegevoegd en gedurende 10 minuten bij 25 ° C geïncubeerd. De cellen werden vervolgens gedurende 5 minuten bij 1000 tpm gecentrifugeerd. Na het weggooien van het supernatant werden de cellen driemaal gewassen met PBS. Vervolgens werden 200 µL Si QD-micellen of Si QD-micellen-CKAP4 (Si-concentratie 150 μg / ml) aan de cellen toegevoegd en gedurende 2 uur bij 37 ° C geïncubeerd. Na 5 minuten centrifugeren bij 1000 rpm, werd het supernatant weggegooid en werd het sediment driemaal gewassen met PBS. De cellen werden geoogst en microscoopglaasjes werden bereid. Microscopie werd uitgevoerd met behulp van een confocale lasermicroscoop. Het excitatielicht was ingesteld op 405 nm en de emissiegolflengte was ingesteld op 630 nm.

Er werden drie onafhankelijke experimenten uitgevoerd. Kwantitatieve analyse van de gemiddelde fluorescentie-intensiteit werd uitgevoerd met behulp van ImageJ-software (Bethesda, MD, VS). Prism-software (versie 7.01) werd gebruikt voor statistische analyse. De gegevens werden geanalyseerd met behulp van eenrichtings-ANOVA met de posttest van Dunnett. Statistische significantie werd vastgesteld op P < 0.05. ***P < 0.001.

Model van tumordragende muizen

Tien mannelijke naakte muizen (5-6 weken oud) werden gekocht bij Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd. (Shanghai, China). Alle muizen werden gehuisvest onder specifieke pathogeenvrije (SPF) omstandigheden in het Experimental Animal Center van Tongji University (Shanghai, China). Om het tumordragende muismodel vast te stellen, werden muizen subcutaan geïnjecteerd met 1 × 10⁶ A549-cellen. Tumordragende muizen werden in het experiment gebruikt toen de tumordiameter 6 mm bereikte. Alle muisexperimenten werden uitgevoerd volgens institutionele richtlijnen en werden goedgekeurd door de Institutional Animal Use and Care Committee van de Tongji University.

Si QD Micelles-CKAP4 gericht op longkankerweefsels in vitro

Tumordragende muizen werden onder narcose gedood. De tumor en het normale longweefsel werden verzameld om paraffinecoupes te bereiden. Na dehydratie, antigeenwinning en serumblokkering werden Si QD-micellen of Si QD-micellen-CKAP4 (Si-concentratie 150 µg/ml) aan weefsels toegevoegd en gedurende 2 uur bij 37 °C geïncubeerd. Na het weggooien van de nanomaterialen werden de weefsels driemaal gewassen met PBS. De weefsels werden 10 minuten gekleurd met 4 ', 6-diamidino-2-fenylin-dole (DAPI). Na drie keer wassen met PBS werd een antifade-medium aan de weefsels toegevoegd en gedurende 5 minuten bij 25°C geïncubeerd. Na het weggooien van het antifade-medium werden de weefsels driemaal gewassen met PBS. Foto's werden gemaakt met behulp van een fluorescentiemicroscoop (Nikon, Tokyo, Japan) met een excitatiegolflengte van 405 nm en een emissiegolflengte van 630 nm. Er werden drie onafhankelijke experimenten uitgevoerd. Een kwantitatieve analyse van de gemiddelde rode fluorescerende intensiteit werd uitgevoerd met behulp van ImageJ-software. Prism-software (versie 7.01) werd gebruikt voor statistische analyse. De gegevens werden geanalyseerd met behulp van eenrichtings-ANOVA met de posttest van Dunnett. Statistische significantie werd vastgesteld op P < 0.05. ***P < 0.001.

Fluorescentie-imaging in vivo

In het experiment werden negen tumordragende muizen verdeeld in drie groepen (Si QD-micellen-CKAP4-injectiegroep, Si QD-micellen-injectiegroep en zoutoplossing-injectiegroep). Muizen in de Si QD-micellen-CKAP4-injectiegroep werden intraveneus geïnjecteerd met 200 µL Si QD-micellen-CKAP4 (Si:4 mg/kg). Muizen in de Si QD micel-injectiegroep werden intraveneus geïnjecteerd met 200 µL Si QD-micellen (Si:4 mg/kg). Muizen in de zoutoplossing-injectiegroep werden intraveneus geïnjecteerd met 200 L zoutoplossing. Fluorescentiebeelden werden op verschillende tijdstippen verkregen (0, 0,25, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5 en 4 uur). De muizen in de Si QD-micellen-CKAP4-injectiegroep werden na 4 uur verdoofd en geëuthanaseerd om het fluorescentiesignaal in hun hart, lever, milt, long, nier en tumor te detecteren. In deze studie werd fluorescentiebeeldvorming uitgevoerd met behulp van een VISQUE Invivo Smart-LF (VIEWORKS, Gyeonggi-do, Korea) met een PE-filterset (λ _opwinding 450–500 nm, λ _emissie 600-650 nm). Prism-software (versie 7.01) werd gebruikt voor statistische analyse. Gegevens werden geanalyseerd met behulp van een one-way ANOVA met Dunnett's post-test. Statistische significantie werd vastgesteld op P < 0.05. *P < 0,05; **P < 0.01.

Hematoxyline en eosine (H&E) kleuring

In deze studie werden 12 tumordragende muizen geïnjecteerd met zoutoplossing (200 µL), Si QD-micellen (Si:4 mg/kg, 200 µL) of Si QD-micellen-CKAP4 (Si:4 mg/kg, 200 µL) door de staartader. Na 24 uur werden de muizen geëuthanaseerd. H &E-kleuring werd uitgevoerd op hun hart, lever, milt, longen en nieren. Pathologische veranderingen werden waargenomen door optische microscopie [14, 16].

Resultaten

Voorbereiding en karakterisering van Si QD-micellen

Eerst werden dodecyl-Si QD's bereid door hydrosilylering volgens een eerder gepubliceerd rapport (schema 1, stap 1) [12]. Vergelijkbaar met de gerapporteerde gegevens, waren dodecyl-Si QD's gesynthetiseerd door onze groep goed gedispergeerd in methylbenzeen [12]. TEM toonde aan dat de dodecyl-Si QD's bolvormig waren met relatief uniforme afmetingen. De afmetingen van de dodecyl-Si QD's in de TEM-afbeeldingen werden gemeten met behulp van ImageJ-software. Gegevens toonden aan dat de diameter van dodecyl-Si QD's varieerde van 4,1 tot 5,3 nm, met een gemiddelde diameter van ongeveer 4,7 nm (figuur 1a). In de vergrote afbeeldingen van de dodecyl-Si QD's kunnen duidelijke roosterranden worden waargenomen (figuur 1a). In deze studie werd de vlakafstand van het rooster gemeten met behulp van de ImageJ-software. Gegevens toonden aan dat de gemiddelde afstand tussen roosterranden ongeveer 0,35 nm is, wat bijna hetzelfde is als die van de eerder gerapporteerde dodecyl-Si QD's (0,34 nm). Daarom vertoonden de in deze studie gesynthetiseerde dodecyl-Si QD's een goede kristalliniteit [12]. Dynamische lichtverstrooiing (DLS) toonde de hydrodynamische diameters van dodecyl-Si QD's variërend van 4,8 tot 13,5 nm met een gemiddelde van 6,5 nm (figuur 1b).

Schematische voorstelling van de bereiding van Si QD-micellen-CKAP4 en gerichte biologische beeldvorming in longkankerweefsels

een TEM-afbeeldingen van dodecyl-Si QD's; b hydrodiameterverdeling van dodecyl-Si QD's; c TEM-beelden van Si QD-micellen; d hydrodiameterverdeling van Si QD-micellen; e TEM-afbeeldingen van Si QD-micellen-CKAP4; v hydrodiameterverdeling van Si QD-micellen-CKAP4; g C1s Röntgenfoto-elektronspectroscopie (XPS) spectra van Si QD-micellen; u C1s XPS-spectra van Si QD-micellen-CKAP4

Om in water dispergeerbare Si QD-micellen te bereiden, werden dodecyl-Si QD's gemodificeerd door zelfassemblage van DSPE-PEG-COOH (schema 1, stap 2) [12]. Hier werd DSPE-PEG-COOH gebruikt in plaats van F127 om Si QD-micellen te bereiden met carboxylgroepen op het oppervlak. De resultaten toonden aan dat de Si QD-micellen goed in water verspreidden. TEM-afbeeldingen toonden aan dat de Si QD-micellen bolvormige deeltjes waren waarin Si QD's waren ingevoegd. De diameter van Si QD-micellen varieerde van 22,7 tot 54,6 nm, met een gemiddelde diameter van ongeveer 34,3 nm (figuur 1c). DLS toonde aan dat de hydrodynamische diameters van Si QD-micellen varieerden van 43,8 tot 615,9 nm, met een gemiddelde van 58,7 nm (figuur 1d). De gemiddelde zeta-potentiaal van de Si QD-micellen was ongeveer -20,7 mV. In deze studie werd FTIR uitgevoerd om de samenstelling van de Si QD-micellen te onderzoeken (aanvullend bestand 1:figuur S1A). Uit de gegevens bleek dat de absorptiepieken van rektrillingen van N–H, C–H, O–H en C=O 3430, 2920, 2850 en 1640 cm⁻¹ waren respectievelijk; de buigtrillingsabsorptiepieken van C–H en O–H waren 1460 en 1400 cm⁻¹ respectievelijk; de absorptiepieken van strektrillingen van Si–C, C–O en P–O–C waren 1250, 1100 en 951 cm⁻¹ respectievelijk; de buigtrillingsabsorptiepieken van Si–H en O=C–N waren 850 en 526 cm⁻¹ , respectievelijk. Deze gegevens laten zien dat de karakteristieke groepen van DSPE-PEG-COOH (zoals N–H, O–H, C=O, C–O, P–O–C en O=C–N) en de karakteristieke groepen van dodecyl-Si QD's (zoals Si-C en Si-H) konden worden gevonden in het FTIR-spectrum van Si QD-micellen, wat aangeeft dat dodecyl-Si QD's met succes waren ingekapseld in micellen die zelf geassembleerd waren door DSPE-PEG-COOH. Bovendien werden de Si QD-micellen gekenmerkt door XRD (aanvullend bestand 1:figuur S1B). De diffractiepiek van de Si QD-micellen was scherp, wat aangeeft dat de kristalliniteit van de Si QD-micellen goed was. In het XRD-patroon pieken bij 2θ van 27.073, 28.451, 56.598 en 73.145 komen overeen met de (100), (002), (112) en (203) kristalvlakken van silicium (PDF # 80-0005), wat aangeeft dat de Si QD's met succes waren ingekapseld in de Si QD micellen. De pieken bij 2θ van 31.692, 45.431, 66.200, 75.260 en 83.955 komen overeen met de (200), (220), (400), (420) en (422) kristalvlakken van NaCl (PDF # 77-2064). Een rationele verklaring voor de aanwezigheid van NaCl in de Si QD-micellen zou als volgt kunnen zijn:Na de bereiding van Si QD-micellen hebben we Si QD-micellen opgelost in PBS, wat leidde tot de aanwezigheid van NaCl in de Si QD-micellen.

Het UV-zichtbare absorptiespectrum toonde aan dat de absorptie van Si QD-micellen varieerde van 200 tot 500 nm (figuur 2a). Met een excitatiegolflengte van 330 nm werd een sterke fluorescentie bij 650 nm waargenomen in de fluorescentie-emissiespectra van de Si QD-micellen (figuur 2b). De waterige oplossing van Si QD micel (Si-concentratie:80 µg/ml) was transparant en helder in natuurlijk licht; het straalde echter sterke rode fluorescentie uit onder 365 nm UV-licht (figuur 2c). In deze studie werden de absolute PL QY's getest met behulp van een fluorescentiespectrometer (FLS1000). De excitatiegolflengte was 365 nm. De gegevens toonden aan dat de absolute PL QY van de Si QD-micellen ongeveer 14,49% was.

een UV-zichtbaar absorptiespectrum van Si QD-micellen en Si QD-micellen-CKAP4; b fluorescentie-emissiespectrum van Si QD-micellen en Si QD-micellen-CKAP4; c afbeeldingen van Si QD-micellen en Si QD-micellen-CKAP4 belicht in natuurlijk licht (links) en 365 nm UV-licht (rechts)

Voorbereiding en karakterisering van Si QD Micelles-CKAP4

We hebben het CKAP4-antilichaam geconjugeerd met Si QD-micellen met behulp van EDC (schema 1, stap 3) [14]. TEM-afbeeldingen toonden aan dat de Si QD-micellen-CKAP4 bolvormige deeltjes waren waarin Si QD's waren ingevoegd. De diameter van Si QD-micellen-CKAP4 varieerde van 24,4 tot 67,7 nm, met een gemiddelde diameter van ongeveer 35,5 nm (figuur 1e). DLS toonde aan dat de hydrodynamische diameters van de Si QD-micellen-CKAP4 varieerden van 58,7 tot 824,9 nm met een gemiddelde van 78,8 nm, wat iets groter was dan die van Si QD-micellen (figuur 1f). Deze toename kan het gevolg zijn van de conjugatie van CKAP4-antilichaam. De C1s XPS-spectra toonden zes soorten koolstofatomen in het C1s-gebied:C(O)O (288,81 eV), C=O (286,5 eV), C-O (285,76 eV), C-N (285,25 eV), C –C (284,88 eV) en C-H (284,34 eV) (Fig. 1g). De piek van C(O)O verdween echter bijna in de XPS-spectra van de Si QD-micellen-CKAP4, wat aangeeft dat de conjugatie tussen de carboxylgroepen en primaire aminen succesvol was; daarom werd het CKAP4-antilichaam met succes geconjugeerd met de Si QD-micellen (figuur 1h). Het gemiddelde zeta-potentieel van de Si QD-micellen-CKAP4 was ongeveer -10,7 mV, hoger dan dat van de Si QD-micellen. De verklaring voor het bovenstaande fenomeen zou als volgt kunnen zijn:Er zijn veel carboxylgroepen op het oppervlak van Si QD-micellen; daarom vertoonden Si QD-micellen een sterke negatieve elektriciteit. In de Si QD-micellen-CKAP4 leidde de koppeling van CKAP4-antilichaam echter tot de afname van carboxylgroepen op het oppervlak van de Si QD-micellen-CKAP4; daarom nam het gemiddelde zeta-potentieel van de Si QD-micellen-CKAP4 toe.

Het UV-zichtbare absorptiespectrum toonde aan dat de absorptie van de Si QD-micellen-CKAP4 varieerde van 200 tot 500 nm, vergelijkbaar met het resultaat van Si QD-micellen (figuur 2a). Met een excitatiegolflengte van 330 nm werd een sterke fluorescentie bij 640 nm waargenomen van Si QD-micellen-CKAP4 in de fluorescentie-emissiespectra (figuur 2b). Deze resultaten gaven aan dat antilichaamconjugatie geen significante invloed uitoefende op de fluorescentie-eigenschappen van de Si QD-micellen-CKAP4. De waterige Si QD-micellen-CKAP4-oplossing (Si-concentratie:80 µg/ml) was transparant en helder in natuurlijk licht. Onder 365 nm UV-licht zou het sterke rode fluorescentie kunnen uitzenden, consistent met de resultaten van de Si QD-micellen (Fig. 2c). PL QY-tests toonden aan dat de absolute PL QY van de Si QD-micellen-CKAP4 ongeveer 16,96% was.

Cytotoxiciteitstest van Si QD Micellen-CKAP4 in vitro

De menselijke longkankercellijn A549 en menselijke nierepitheelcellijn 293 T werden gebruikt als doelcellen om de bioveiligheid van Si QD-micellen en Si QD-micellen-CKAP4 te onderzoeken. In deze studie werden verschillende concentraties Si QD-micellen en Si QD-micellen-CKAP4 (Si-concentratie 0, 2,375, 4,75, 9,5, 19, 38, 76 en 152 µg/ml) eerst geïncubeerd met A549- of 293 T-cellen op 37 °C gedurende 2 uur. De levensvatbaarheid van de cellen werd gedetecteerd met behulp van trypaanblauw (Fig. 3) [15]. De ID50 van Si QD-micellen en Si QD-micellen-CKAP4 werd verkregen met behulp van de GraphPad-software. Gegevens toonden aan dat de ID50 van Si QD-micellen groter was dan 152 µg/ml in A549- en 293 T-cellen. De ID50 van Si QD-micellen-CKAP4 was 25,94 µg/ml in A549-cellen en 72,69 µg/ml in 293 T-cellen. Deze resultaten gaven aan dat de cytotoxiciteit van Si QD-micellen-CKAP4 significant hoger was dan die van Si QD-micellen en dat de cytotoxiciteit van Si QD-micellen-CKAP4 in A549-cellen significant hoger was dan die van 293 T-cellen. Dit fenomeen kan te wijten zijn aan complementafhankelijke cytotoxiciteit [17]. Bovendien gaven deze resultaten ook aan dat Si QD-micellen-CKAP4 een hogere biologische veiligheid vertoonden in normale cellen dan in longkankercellen, wat de basis legde voor de toepassing ervan in vivo.

Cellevensvatbaarheid van A549 a en 293 T b geïncubeerd met verschillende concentraties Si QD-micellen en Si QD-micellen-CKAP4 (Si-concentratie:0, 2,375, 4,75, 9,5, 19, 38, 76 en 152 µg/ml) gedurende 2 uur (n = 3; gemiddelde ± SD; tweerichtings-ANOVA met de posttest van Dunnett; *P < 0,05; **P < 0,01; en ***P < 0.001)

Si QD Micelles-CKAP4 gericht op longkankercellen in vitro

Om de targetingfunctie van Si QD-micellen-CKAP4 in longkankercellen in vitro verder te onderzoeken, werden A549- en 293 T-cellen als doelwitcellen gebruikt. Si QD-micellen en Si QD-micellen-CKAP4 werden eerst 2 uur bij 37 ° C geïncubeerd met A549- en 293 T-cellen. Het targeting-effect werd gedetecteerd met behulp van laserconfocale microscopie (Fig. 4). De resultaten toonden aan dat de rode fluorescentie in de Si QD-micellen-CKAP4 geïncubeerd A549 significant hoger was dan die van de Si QD-micellen-CKAP4 en 293 T co-incubatiegroep, Si QD-micellen en A549 co-incubatiegroep, en Si QD-micellen en 293 T co-incubatiegroep. Deze resultaten gaven aan dat de Si QD-micellen-CKAP4 zich specifiek in vitro op A549-cellen zouden kunnen richten.

Detectie van het vermogen van Si QD-micellen-CKAP4-targeting op A549-cellen in vitro. een A549 en 293 T werden gedurende 2 uur bij 37 geïncubeerd met Si QD-micellen-CKAP4 en Si QD-micellen (de concentratie van Si 150 µg/ml). Na het weggooien van het supernatant en tweemaal wassen, werden cellen afgebeeld met een confocale laserscanmicroscoop (Bar, 25 m). b Een kwantitatieve analyse van de gemiddelde fluorescentie-intensiteit werd gemeten door ImageJ (n = 3; gemiddelde ± SD; eenrichtings-ANOVA met de posttest van Dunnett; ***P < 0.001)

Si QD Micelles-CKAP4 gericht op longkankerweefsels in vitro

Om de mogelijkheid te onderzoeken dat Si QD-micellen-CKAP4 gericht is op longkankerweefsels, hebben we een in vitro experiment ontworpen om de targeting-eigenschap van Si QD-micellen-CKAP4 op A549-weefsels te verifiëren. In deze studie werden A549-cellen subcutaan in de muizen geïnoculeerd. Na tumorvorming werden A549-tumorweefsels en normale longweefsels verzameld en 2 uur bij 37 ° C geïncubeerd met Si QD-micellen en Si QD-micellen-CKAP4. Het targeting-effect werd gedetecteerd met behulp van laserconfocale microscopie (Fig. 5). De resultaten toonden aan dat Si QD-micellen-CKAP4-geïncubeerd A549-weefsel sterke rode fluorescentie kon uitzenden bij een excitatiegolflengte van 405 nm. Er werd echter alleen een zwakke rode fluorescentie waargenomen in Si QD-micellen-geïncubeerd A549-weefsels, Si QD-micellen-CKAP4-geïncubeerd normaal longweefsel en Si QD-micellen-geïncubeerd normaal longweefsel. De rode fluorescentie in het met Si QD-micellen-CKAP4 geïncubeerde A549-weefsel was significant hoger dan die van met Si QD-micellen geïncubeerd A549-weefsel, met Si QD-micellen-CKAP4 geïncubeerd normaal longweefsel en met Si QD-micellen geïncubeerd normaal longweefsel. Deze gegevens geven aan dat de Si QD-micellen-CKAP4 zich in vitro effectief zouden kunnen richten op longkankerweefsels, wat verondersteld wordt een potentieel fluorescerend contrastmiddel te zijn voor longkanker.

Detectie van het vermogen van Si QD-micellen-CKAP4-targeting op A549-weefsel in vitro. een A549-weefsel en normaal longweefsel werden gedurende 2 uur bij 37 gekweekt met Si QD-micellen-CKAP4- en Si QD-micellen (de concentratie van Si:150 µg/ml). Na tweemaal wassen werden weefsels gekleurd met DAPI om de kern zichtbaar te maken. Weefsels werden afgebeeld met een confocale laserscanmicroscoop (Bar, 200 m). b Een kwantitatieve analyse van de gemiddelde rode fluorescentie-intensiteit werd gemeten door ImageJ (n = 3; gemiddelde ± SD; eenrichtings-ANOVA met de posttest van Dunnett; ***P < 0.001)

Fluorescence-Imaging In Vivo

Nine tumor-bearing mice were divided into three groups (Si QD micelles-CKAP4 injection group, Si QD micelles injection group, and saline injection group). Mice in the Si QD micelles-CKAP4 injection group were intravenously injected with 200 µL Si QD micelles-CKAP4 (Si:4 mg/kg). Mice in the Si QD micelle injection group were intravenously injected with 200 µL of Si QD micelles (Si:4 mg/kg). Mice in the saline injection group were intravenously injected with 200 µL saline. Fluorescence images were acquired at different time points (0, 0.25, 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, and 4 h). The significant fluorescence signals were not observed in lung cancer tissues among all the mice in the three groups (data not shown). This might be because of the weak fluorescence penetration of the Si QD micelles-CKAP4 and Si QD micelles.

The mice in the Si QD micelles-CKAP4 injection group were anesthetized and euthanized at 4 h to detect the fluorescence signal in their heart, liver, spleen, lung, kidney, and tumor. Data showed that a significant fluorescence signal could be observed in the liver, kidney, and tumor tissues. However, there was no significant fluorescence signal in the heart, spleen, or healthy lung tissues (Fig. 6). The significant fluorescence signal in the liver and kidney indicated that the Si QD micelles-CKAP4 was metabolized by the liver and excreted by the kidney. In addition, the fluorescence signal in A549 tumor tissues was significantly higher than that in healthy lung tissues. This phenomenon contributed to the targeting ability of the Si QD micelles-CKAP4 to lung cancer tissues. These results indicate that Si QD micelles-CKAP4 specifically targets lung cancer tissue, which is expected to be a fluorescent contrast agent for lung cancer surgical navigation in the future.

een Bright photograph of the heart, liver, spleen, lung, kidney, and tumor in Si QD micelles-CKAP4 injected mice. b Fluorescence photograph of the heart, liver, spleen, lung, kidney, and tumor in Si QD micelles-CKAP4 injected mice. c Relative fluorescence intensities of heart, liver, spleen, lung, kidney and tumor tissue (n = 3; mean ± SD; one-way ANOVA with Dunnett’s post test; *P < 0.05; **P < 0.01)

Biosafety Evaluation of Si QD Micelles-CKAP4 In Vivo

Finally, we investigated the acute toxicity of the Si QD micelles-CKAP4 in vivo. In this study, tumor-bearing mice (n = 12) were intravenously injected with saline (200 µL), Si QD micelles (Si:4 mg/kg, 200 µL), or Si QD micelles-CKAP4 (Si:4 mg/kg, 200 µL) and then euthanized 24 h later. H&E staining images of the heart, liver, spleen, lungs, and kidneys are shown in Fig. 7. Compared with saline-injected mice, there were no evident pathological changes in the major organs of Si QD micelles-injected mice and Si QD micelles-CKAP4-injected mice. The above data indicated that Si QD micelles (Si:4 mg/kg) and Si QD micelles-CKAP4 (Si:4 mg/kg) showed no significant toxicity in vivo.

H&E staining images of the heart, liver, spleen, lungs, and kidneys in tumor-bearing mice injected with saline, Si QD micelles (Si:4 mg/kg), and Si QD micelles-CKAP4 (Si:4 mg/kg) for 24 h (magnification:200×)

Discussion

At present, various fluorescent nanomaterials have been designed and synthesized as optical contrast agents for surgical navigation [3, 4]. In 2020, On et al. prepared fluorophore [indocyanine green (ICG) or cyanine 5.5 (Cy5.5)]-conjugated glycol chitosan nanoparticles (CNPs) as a fluorescent contrast agent in lung cancer surgery navigation [18]. However, there are no reports on the preparation of fluorescent contrast agents for lung cancer surgery navigation using Si QDs.

This study successfully synthesized Si QD micelles-CKAP4, which could target the imaging of lung cancer tissues. Si QD micelles-CKAP4 is expected to be used as an optical contrast agent for navigation in lung cancer surgery in the future. The advantages of Si QD micelles-CKAP4 are as follows:(1) We synthesized a fluorescent contrast agent for lung cancer surgery navigation using Si QDs for the first time, which expands the toolbox of the lung cancer surgery navigation tool library. (2) This study optimized water-dispersible Si QD micelles reported by Pi et al. to add targeting ability to Si QD micelles [12]. Thus, it provides a new possibility for applying Si QDs in the biomedical field. (3) The principle of Si QD micelles-CKAP4 targeting lung cancer is based on the high expression of CKAP4 protein in lung cancer tissue. Owing to the conjugation of CKAP4 antibody, Si QD micelles-CKAP4 could actively target lung cancer tissue. Compared with the nanomaterials that passively target tumors via the EPR effect, Si QD micelles-CKAP4 showed stronger specificity to lung cancer tissue. (4) Si QD micelles-CKAP4 showed selective toxicity to tumor cells in a specific range of concentrations. Therefore, Si QD micelles-CKAP4 showed high biological safety in the range of rational drug concentrations, which exhibited its potential clinical application value.

In this study, PL QY tests showed that the absolute PL QY of Si QD micelles was approximately 14.49% and the absolute PL QY of the Si QD micelles-CKAP4 was approximately 16.96%. A study by Pi et al. showed that the PL QY of dodecyl-Si QDs was approximately 26%, which was very high for Si QDs that emit red light with a PL peak at less than 700 nm [12, 19, 20]. However, the PL QY of the Si QD micelles in this study was approximately 14.49%, which was lower than that of dodecyl-Si QDs. This might be because of the surface defects introduced during the emulsion process, which was nearly consistent with the decrease in PL QY in Si-QD micelles (dodecyl-passivated Si QDs were encapsulated in the micelles self-assembled from F127 in the emulsion) in the study reported by Pi et al. [12, 21]. In this study, the PL QY of Si QD micelles-CKAP4 was approximately 16.96%, which was slightly higher than that of Si QD micelles (14.49%). This could be because in the Si QD micelles-CKAP4, the coupling of the CKAP4 antibody repaired some surface defects of the Si QD micelles, leading to a slight enhancement of the PL QY.

As we all know, there is a challenge in Si QDs biological imaging applications:Although Si exhibits little cytotoxicity, Si particles may exhibit cytotoxicity as the size decrease to a certain extent. In this study, cytotoxicity tests showed that Si QD micelles-CKAP4 exhibited selective cytotoxicity to lung cancer cells at 9.5–19 µg/mL. Therefore, as a result of CKAP4 antibody conjugation, the cytotoxicity of Si QD micelles-CKAP4 to normal cells was significantly less than that of lung cancer cells, which provides a powerful condition for the biological application of Si QD micelles-CKAP4.

In this study, human lung cancer cell line A549 and human renal epithelial cell line 293 T were used as target cells to investigate the targeting ability of Si QD micelles and Si QD micelles-CKAP4. A549 and 293 T cells were adherent and semi-adherent, respectively. During the experiment, the number of 293 T cells decreased because of repeated centrifugation and washing. Therefore, as shown in Fig. 4, the number of 293 T cells was lower than that of A549 cells.

In addition, it should be noted that A549 cells belong to the p53 wild-type lung cancer cell line. Therefore, only A549 cells cannot fully reflect the targeting ability of the Si QD micelles-CKAP4 to lung cancer. Further studies will be conducted to test the targeting ability and imaging effect of Si QD micelles-CKAP4 on p53-negative cell lines (such as H1299) to provide a solid experimental basis for the clinical application of Si QD micelles-CKAP4 [22].

Conclusions

This study improved and modified the Si QD micelles reported by Pi et al. to prepare water-dispersible Si QD micelles-CKAP4. Si QD micelles-CKAP4 were spherical particles with a mean hydrodiameter of approximately 78.8 nm. UV–visible absorption of the Si QD micelles-CKAP4 ranged from 200 to 500 nm. With an excitation wavelength of 330 nm, strong fluorescence at 640 nm was observed in the fluorescence emission spectra. Si QD micelles-CKAP4 exhibited good targeting ability to lung cancer cells and lung cancer tissues both in vitro and in vivo. In addition, the in vivo fluorescence-imaging assay further showed that the Si QD micelles-CKAP4 was metabolized by the liver and excreted by the kidney. Cytotoxicity and H&E staining assays showed that the Si QD micelles-CKAP4 exhibited high biosafety both in vitro and in vivo. Si QD micelles-CKAP4 is a specifically targeted imaging agent for lung cancer and is expected to be a fluorescent contrast agent for lung cancer surgical navigation in the future.

Beschikbaarheid van gegevens en materialen

The data and the analysis in the current work are available from the corresponding authors on reasonable request.

Afkortingen

Si QD:: Si quantum dot
Si QD micelles-CKAP4:: CKAP4 antibody-conjugated Si quantum dot micelles
Dodecyl-Si QDs:: Dodecyl-passivated Si QDs
BSA:: Bovine serum albumine
THF:: Tetrahydrofuran
DMEM:: Dulbecco’s modified eagle’s medium
PBS:: Phosphate buffer saline
FBS:: Foetaal runderserum
TEM:: Transmissie-elektronenmicroscopie
DLS:: Dynamische lichtverstrooiing
XPS:: Röntgenfoto-elektronenspectroscopie
FTIR:: Fourier transform infrared spectroscopy
XRD:: Röntgendiffractie
SPF:: Specific pathogen free
DAPI:: 4′, 6-Diamidino-2-phenylin-dole
H&E:: Hematoxylin and eosin

Ge N-Channel MOSFET's met ZrO2-diëlektricum voor verbeterde mobiliteit De fotodetectoren gebaseerd op laterale monolaag MoS2/WS2 heterojuncties

Nanomaterialen

Metaal

Hars

vezel

Samengesteld materiaal