Gerichte Koolstofnanobuizen Fotothermische Therapie Plus Checkpoint Remming: Een Nieuwe Strategie voor Metastaseerende Borstkanker

Samenvatting

De grootste bijdragers aan kankerstervfte zijn metastasering en de gevolgen van de behandeling ervan. Hier presenteren we een nieuwe behandeling van metastaseerende borstkanker die fotothermische therapie combineert met gerichte enkelwandige koolstofnanobuizen (SWCNTs) en immuunstimulatie met een checkpoint remmer. We vonden dat de selectieve nabij-infrarode fotothermische ablatie van primaire orthotope EMT6 borsttumoren in syngene BALB/cJ muizen met behulp van een annexine A5 (ANXA5) gefunctionaliseerd SWCNT bioconjugaaat synergistisch een anti-cytotoxische T-lymfocyt-geassocieerd proteïne 4 (anti-CTLA-4)-afhankelijke abscopale reactie versterkt, wat resulteert in een verhoogde overleving (55%) op 100 dagen na tumorinoculatie. In vergelijking, was er geen overleving op 100 dagen voor zowel fotothermische therapie op zich als immuunstimulatie op zich. Voorafgaand aan fotothermische therapie, werd het SWCNT-ANXA5 bioconjugaaat systemisch toegediend bij een relatief lage dosis van 1,2 mg/kg, waarna het accumuleerde in tumor vasculatuur via ANXA5-afhankelijke binding. Tijdens fotothermische therapie bereikte de gemiddelde maximumtemperatuur in de tumor 54 °C (duur 175 s). Het mechanisme van verlengde overleving als gevolg van combinatoire fotothermische ablatie en immuunstimulatie werd geëvalueerd door flowcytometrische kwantificering van splenische antitumorale immuun effectorcellen en serum cytokinen kwantificering.

Inleiding

Metastasering en de gevolgen van de behandeling ervan zijn de enkele grootste doodsoorzaak bij kanker. Bijvoorbeeld, wanneer borstkanker metastaseert, vallen de 5-jaar overlevingscijfers van patiënten onder de 25%. Hoewel in de afgelopen 60 jaar meer dan 200 nieuwe antineoplastische geneesmiddelen de patiëntuitkomsten hebben verbeterd, blijft de algehele overleving slecht bij metastaserende ziekte. Hier wordt een nieuwe combinatie van fotothermische therapie gefaciliteerd door een tumor gerichte enkelwandige koolstofnanobuizen (SWCNT) bioconjugaaat en anti-cytotoxische T-lymfocyt-geassocieerd proteïne 4 (anti-CTLA-4) checkpoint remming bestudeerd voor de behandeling van metastaseerende borstkanker in een orthotoop muizenmodel.

De unieke eigenschappen van SWCNTs als nanomateriaal hebben significante belangstelling gegenereerd in hun gebruik als potentiële tool in de strijd tegen kanker. Terwijl SWCNTs een verscheidenheid aan biologische effecten uitoefenen, heeft het gebruik van SWCNTs in de behandeling van kanker zich voornamelijk gericht op hun interactie met nabij-infrarood (NIR) licht en het resulterende fotothermische effect, waar SWCNTs de tumor snel verwarmen in het proces fotothermische therapie (PTT). Talrijke groepen hebben het potentieel van SWCNTs onderzocht om te worden gebruikt in PTT-gebaseerde behandelstrategieën in verschillende modellen van borstkanker. Deze werken hebben zich voornamelijk gericht op de capaciteit van PTT om primaire tumoren te behandelen op diepten niet groter dan enkele mm, waar de demping van NIR licht bijna compleet is.

Eerder lieten we zien dat primaire orthotope borsttumoren in syngene muizen bijna volledig konden worden geëlimineerd met milde NIR laserlicht in combinatie met een fotothermische versterkende SWCNT bioconjugaaat. In dit bioconjugaaat waren de SWCNTs gefunctionaliseerd met het eiwit annexine A5 (ANXA5), wat met hoge affiniteit bindt aan het anionische fosfolipide fosfatidylserine dat extern geëxprimeerd wordt op tumorcellen en op endotheelcellen van de tumor vasculatuur, maar niet op normale cellen in de vasculatuur. Dit conjugaaat werd gevisualiseerd met atoomkrachtmicroscopie (AFM) om te tonen dat de hoogte van het conjugaaat tussen 2,5 en 5,0 nm lag, wat vergelijkbaar is met dat voor andere SWCNT-eiwit conjugaten. Hoewel in staat om primaire tumoren in dit metastatisch model te eradiceren, verlengde fotothermische therapie op zich de overleving slechts matig. Echter, vonden we voorlopige bewijzen die suggereerden dat gelijktijdige behandeling met immunmodulatoren zoals cyclofosfamide in staat was om de overleving te verhogen.

Recent is het potentieel voor immunmodulatoren zoals cyclofosfamide om synergistisch SWCNT gerichte PTT te versterken, het onderwerp van veel belangstelling. Een categorie van veelbelovende immunomodulerende agenten zijn checkpoint remmers. Checkpoint remmers zijn antilichamen zoals anti-CTLA-4, anti-PD-1, en anti-PDL-1 die binden aan kritische celproteïnen verantwoordelijk voor het moduleren van de reactie van het lichaam op kanker. Deze antilichamen blokkeren sleutel biologische "checkpoints" waar het lichaam de immuunreactie op kanker kan down-reguleren. Deze proteïnen dienen normaal een belangrijke rol in het controleren van de immunologische reactie van het lichaam. Door de werking van deze proteïnen te blokkeren, verwijderen checkpoint remmers een mechanism waarmede het immuunsysteem normaal zijn natuurlijke antitumorale reactie onderdrukt. Recent hebben diverse groepen waargenomen dat de combinatie van anti-CTLA-4 checkpoint remming met SWCNT versterkte PTT het potentieel heeft om een robuuste immuunreactie in borstkanker te promoten.

In de huidige studie evalueren we de combinatie van onze nieuwe PTT modaliteit in combinatie met het immuunstimulerende middel anti-cytotoxische T-lymfocyt-geassocieerd proteïne 4 (anti-CTLA-4). Oorspronkelijk goedgekeurd voor de behandeling van metastaserend melanoom, wordt anti-CTLA-4 nu getest voor de behandeling van borstkanker in klinische studies gecombineerd met andere immuunstimulerende agenten. We evalueren het mechanisme van versterkte antineoplastische immuniteit in PTT in combinatie met anti-CTLA-4 checkpoint remming, alsook het langetermijn lot van SWCNTs in doelorganen.

Materialen en Methodes

Materialen

Het plasmide dat ANXA5 codeert, pET-30 Ek/LIC/ANX, was eerder in dit laboratorium geconstrueerd. Bovine serum albumine (BSA), Triton X-100, EDTA, β-mercaptoethanol, fenylmethylsulfonylfluoride (PMSF), en Tris-acetaat-EDTA buffer waren van Sigma-Aldrich (St Louis, MO). Natriumfosfaat en natrium dodecyl sulfaten (SDS) waren van Mallinckrodt Chemicals (Phillipsburg, NJ). HPLC graad ethanol was van Acros Organics (Waltham, MA). His-trap kolommen waren van GE Healthcare (Chicago, IL). Flowcytometrie kleurbuffer, fixatie/permeabilisatie buffer, permeabilisatie buffer, chromogene endotoxine kwantificeringskit, en Slide-A-Lyzer dialysecassettes (3,5 kDa) waren van Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA). De 2 en 100 kDa dialysemembranen waren van Spectrum Laboratories (Rancho Dominguez, CA). Roswell Park Memorial Institute celmedium (RPMI-1640) en Hank's gebalanceerde zoutoplossing waren van ATCC (Manassas, VA). Foetaal kalfserum (FBS) was van Atlanta Biologicals (Lawrenceville, GA). Trypton, gist extract, en kanamycine monosulfaat werden verkregen van Alfa Aesar (Ward Hill, MA). Natriumhydroxide, kaliumchloride, en natriumchloride waren van VWR Inc (Radnor, PA). HRV-C3 protease was van Sino Biologics (Portland, OR). Anti-CTLA-4 muis monoklonale antilichaam (clone: 9H10) en muis cytokinen ELISA kits (TNF-α, IFN-γ, IL-6) werden verkregen van BioLegend (San Diego, CA). CoMoCAT SWCNTs (gemiddelde diameter 0,8 ± nm, gemiddelde lengte 1,5 ± 0,5 µm) werden verkregen van CHASM (Boston, MA). De CoMoCAT methode is bekend om SWCNT van een klein aantal (n,m) chiraliteiten met hoge selectiviteit op te leveren. Het monster gebruikt in deze studie is hoog verrijkt in [5, 6] SWCNTs, wat een sterke NIR lichtabsorptie vertoont bij een golflengte van 980 nm. Deze absorptie correspondeert met de S₁₁ overgang voor dit type nanobuizen tussen een bezette van Hove singulariteit naar de corresponderende onbezette. Daarom, om de stralingsabsorptie door de SWCNT gedeponeerd op de tumoren te maximaliseren, was de golflengte van de laser gebruikt in deze studie 980 nm om precies te matchen met die van de S₁₁ optische overgang. Figuur S1 in Bijlage 1 toont de fluorescentiespectra, duidelijk de S NIR emissie na opwekking van de S22 overgang met zichtbaar licht.

Celcultuur

EMT6 borstkankercellen van ATCC (Manassas, VA) werden gekweekt in Waymouth's MB 752/1 medium met 2 mM L-glutamine aangevuld met 15% FBS. Alle cellen werden gekweekt bij 37 °C en 100% vochtigheid onder 5% CO. Alle cellen werden gepasseerd met 0,25% (w/v) trypsine in 0,53 mM EDTA. Cellijn en mycoplasma-vrije status werden bevestigd via STR testen (Charles River) en geanalyseerd om endotoxine-vrij te zijn door limulus assay.

ANXA5 en SWCNT-ANXA5 Productie

Het SWCNT-ANXA5 conjugaaat werd bereid met een procedure die we eerder ontwikkelden die 2,5 mg ANXA5/mg SWCNT oplevert. Kort, E. coli getransfecteerd met een plasmide dat ANXA5 codeert, pET-30 Ek/LIC/ANX, werden gekweekt en gezuiverd met geïmmobiliseerde metaalaffiniteitschromatografie met geïmmobiliseerd Ni²⁺ om de ANXA5 te isoleren, wat enzymatische splitsing omvatte om een (His) tag te verwijderen. Vriesgedroogde CoMoCAT SWCNTs werden gedispergeerd in 1% natrium dodecyl sulfaten (SDS) met behulp van twee cycli van zoonsonde bij 20 W en centrifugatie bij 29.600 g gedurende 30 min elk. De gesuspendeerde SWCNTs werden gekarakteriseerd door NIR fluorescentie (Bijlage 1: Figuur S1) en vervolgens geconjugeerd aan een 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamine-polyethyleenglycol-maleimide (DSPE-PEG-maleimide) linker gedurende 30 min bij kamertemperatuur om hydrofobe interactie tussen SWCNTs en de DSPE functionele groep toe te laten. Dit werd gevolgd door een 8 uur dialyse in gedestilleerd water om overtollige linker en SDS te verwijderen. Het gedialyseerde conjugaaat werd vervolgens gereageerd met ANXA5, wat één cysteinegroep bevat, gedurende 2 uur en geblokkeerd met 1,5 mg ml⁻¹ L-cysteine. Het eindproduct, SWCNT-ANXA5, werd gedialyseerd tegen 20 mM natriumfosfaatbuffer gedurende 8 uur om overtollige ANXA5 en L-cysteine te verwijderen. Eiwitgewicht en zuiverheid werden gekarakteriseerd via SDS-PAGE. De SWCNT en ANXA5 inhoud van het bioconjugaaat werd gekarakteriseerd door UV–Vis–NIR fluorescentiespectroscopie, Fourier-transformatie infrarood spectroscopie (FT-IR) Raman analyse, en Bradford assay (Bijlage 1: Figuur S2).

In Vivo Studies

Alle procedures voldeden aan een protocol goedgekeurd door Institutioneel Dierverzorgings- en Gebruikscommissie (IACUC) van de Universiteit van Oklahoma. Vrouwelijke BALB/cJ muizen 6 weken oud werden gebruikt (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME). Muizen werden gevoed met een standaard dieet. Tijdens fotothermische bestraling van tumoren met een NIR laserlicht, werden muizen geanesthetiseerd met 2% isofluraan en 98% zuurstof met een neuskegel.

Tumoren werden geïnduceerd door orthotope injectie van 10⁶ EMT6 muis borstkankercellen in 100 µL PBS in de IV borstvetklier. Tumoren werden toegestaan te groeien gedurende 12 dagen, en toen ze een volume van 60 mm³ bereikten (~ 5 mm in diameter), kregen muizen een systemische i.v. injectie van 1,2 mg/kg SWCNT-ANXA5 (mg SWCNT per kg lichaamsgewicht) bioconjugaaat via de laterale staartvleet. Na 3 uur werd een gebied van 5 mm in overmaat van de tumorgrens bestraald met NIR licht (980 nm) bij een energie en vermogensniveau van 175 J/cm² en 1 W/cm², respectievelijk (tijd van 175 s; Diodevet-50 NIR laser, B&W Tek Inc., Newark, DE). Checkpoint remming werd bereikt door seriële i.p. toediening van 200 µg anti-CTLA-4 antilichaam in 100 µl PBS op dagen 8, 11 en 16 na tumorinoculatie. Tumorvolume werd berekend met de gewijzigde ellipsoïde formule \(V = \frac{1}{2} \times {\text{lengte}} \times {\text{breedte}}^{2}\) met behulp van schuifmaatmetingen van de langste dimensie en loodrechte breedte. Tumortemperatuur werd gemonitord door een handgehouden FLIR TG165 Spot thermische camera (Raymarine ITC, Fareham, UK) ingesteld op autoscan voor maximum gedetecteerde temperatuur. Doelorganen werden geoogst voor toxiciteitsevaluatie en vastgelegd in 10% neutraal gebufferde formaline, en formaline-gefixeerde-paraffine-ingebedde (FFPE) preparaten werden gekleurd met hematoxyline en eosin voor toxiciteitsanalyse.

Ex Vivo SWCNT Detectie

Muizen kregen een systemische injectie van 1,2 mg/kg SWCNT-ANXA5 (mg SWCNT/kg lichaamsgewicht) via de laterale staartvleet. Op geselecteerde tijdstippen, werden muizen (n = 3) gedood, geautopsideerd, en doelorganen verwijderd voor analyse. Weefselmonsters werden bereid zoals eerder beschreven. De aanwezigheid van SWCNTs in ex vivo weefselmonsters werd vervolgens bepaald door relatieve NIR fluorescentiespectroscopie met behulp van een NS3 NanoSpectralyzer (Applied NanoFluorescence, Houston, TX).

Flowcytometrie

Muizen werden gedood 14 dagen na behandeling, en splenische antitumorale immuun effectorcellen werden gekwantificeerd zoals eerder beschreven.

Cytokine Detectie

Na behandeling zoals hierboven beschreven, werden muizen (n = 4–5) gedood 7 dagen na fotothermische therapie voor bloedafname. De concentratie van tumornecrosefactor alfa (TNF-α), interferongamma (IFN-γ), en interleukine 6 (IL-6) in gedunne serummonsters werd gekwantificeerd door ELISA volgens het protocol van de leverancier.

Statistische Analyse

Gegevens werden geanalyseerd met Graphpad Prism software. Statistische significantie werd beoordeeld met een eenvoudige ANOVA en Tukey-Kramer meervoudige vergelijkingstest. Statistische significantie van overlevingscurves werd bepaald door de Mantel-Haenszel log-rank test. Statistische significantie van cytokine serumconcentratie werd geanalyseerd door eenvoudige ANOVA en Dunnett's meervoudige vergelijkingstest. Meervoudige vergelijkingen werden gecorrigeerd door de Bonferroni drempel. Fout wordt grafisch weergegeven als standaardfout van het gemiddelde tenzij de fout de grootte van het geplotte gemiddelde punt symbool niet overschreed, in welk geval de balken werden weggelaten voor duidelijkheid.

Resultaten

Thermische Kinetiek

Met een dosis van 1,2 mg/kg SWCNT-ANXA5, werd de maximumtemperatuur van tumoren vastgelegd gedurende de behandeling met NIR licht, zoals aangegeven in Fig. 1. Muizen die SWCNT-ANXA5 ontvingen vóór bestraling hadden hogere tumortemperaturen gedurende de hele NIR lichtbehandeling vergeleken met muizen die fysiologische zoutoplossing ontvingen. De gemiddelde temperatuur van de tumor voor muizen die SWCNT-ANXA5 ontvingen was significant verschillend van die voor muizen die fysiologische zoutoplossing ontvingen (54 °C vs. 37 °C, p < 0,05). Als resultaat van deze versterkte fotothermische therapie, trad zichtbare tumorablatie alleen op in de SWCNT-ANXA5 groep. Tumorablatie werd gekarakteriseerd door snelle verkleuring, gevolgd door huidcontractie en het verschijnen van rimpels. Binnen 48 uur vormde een significante eschar aan de plaats van fotothermische ablatie. Volledige hergroei van de huid duurde enkele weken.

Fotothermische Therapie en Checkpoint Remming

De resultaten van het combineren van fotothermische therapie met checkpoint remming met anti-CTLA-4 monoklonaal antilichaam worden getoond in Fig. 2. Terwijl fotothermische therapie op zich gemakkelijk primaire borstkankerneoplasie eradiceren, beperkte de onvermogen van het NIR laserlicht om verder dan een paar mm te penetreren de behandeling van borstkankermetastasen. Om de tekortkomingen van gelokaliseerde NIR fotothermische antineoplastische behandeling te overwinnen, onderzochten we de combinatie van deze unieke therapeutische behandelmodaliteit met systemische checkpoint remming (Fig. 2). Terwijl fotothermische therapie uitblonk in het vernietigen van primaire EMT6 tumoren (Fig. 2a), faalde deze behandeling om metastasen te eradiceren en verhoogde de overleving van muizen met EMT6 orthotope tumoren slechts matig (Fig. 2b). Integendeel, verbeterde checkpoint remming met anti-CTLA-4 de algehele overleving maar vertraagde alleen tijdelijk de primaire tumorgroei. Terwijl geen van beide therapieën op zich enige toename in algehele overleving opleverde, verbeterde de combinatie van zowel SWCNT-ANXA5 versterkte fotothermische therapie en anti-CTLA-4 checkpoint remming de algehele overleving, wat leidde tot 55% overleving op 100 dagen na tumorinoculatie.

Cytometrische analyse van splenische effectorcellen na behandeling onthulde een vermeend mechanisme van verbeterde overleving in muizen die combinatoire fotothermische therapie en checkpoint remming ontvingen. Muizen werden geïnculeerd met EMT6 en behandeld zoals eerder beschreven. Twee weken na behandeling, werden geoffereerd en zowel de percentages als relatieve aantallen van meerdere immuun effectortypes gekwantificeerd. Populaties van helper T-cellen, cytotoxische T-cellen, neutrofielen, myeloïde-afgeleide suppressor cel (MDSC) monocyten, FoxP3 regulatoire T-cellen, en macrofagen werden geëvalueerd (Bijlage 1: Figuur S3). Analyse van deze populaties onthulde significante verschillen tussen behandelpopulaties en controles alleen in muizen die de combinatie van zowel fotothermische therapie en anti-CTLA-4 checkpoint remming samen ontvingen. In die dieren die deze combinatie ontvingen, observeerden we een toename in de relatieve aantallen helper T-cellen (CD4⁺) en cytotoxische T-cellen (CD8⁺), (Fig. 2c, d). Toename in CD4⁺ en CD8⁺ celtellingen correleerde met brute toename in miltgroottes waargenomen na autopsie.

Naast cytometrische analyse van splenische effectorcellen, werd serum cytokinconcentratie bepaald 7 dagen na PTT om de mechanismen van antitumorale immuniteit te verhelderen. De niveaus van de pro-inflammatoire cytokines IL-6, IFN-γ, en TNF-α worden gepresenteerd in Fig. 3. Noch SWCNT noch anti-CTLA-4 behandeling op zich verhoogde de niveaus van cytokines significant vergeleken met de onbehandelde controlegroep. Echter, PTT behandeling op zich was in staat om TNF-α significant te verhogen. De verdere toevoeging van anti-CTLA-4 aan PTT behandeling verhoogde de niveaus van TNF-α, IL-6, en IFN-γ significant.

Biodistributie en Toxiciteit van SWCNT-ANXA5

De biodistributie van SWCNT-ANXA5 na toediening voor fotothermische therapie versterking in verschillende organen werd gemonitord met fluorescentie kwantificering van SWCNT in ex situ weefsellysaten vergeleken met standaarden (Bijlage 1: Figuur S4). Biodistributie in doelorganen werd gevolgd over een periode van 4 maanden na i.v. injectie van 1,2 mg/kg SWCNT-ANXA5 in gezonde muizen (Fig. 4a, b). In tegenstelling, werd de accumulatie van SWCNT-ANXA5 in EMT6 tumordragende muizen na toediening, volgens het eerder beschreven injectieprotocol, bepaald op 3 uur na toediening. (Het tijdstip waarop fotothermische therapie uitgevoerd werd in de behandelstudie.) Gedurende de 4-maanden periode voorafgaand aan orgaanoogst, werden muizen gemonitord op fysieke bijwerkingen en abnormaal gedrag. Geen bijwerkingen werden waargenomen in enige muizen geïnjecteerd met SWCNT-ANXA5 gedurende deze tijdsperiode. Geen histopathologische toxiciteit werd waargenomen tijdens onderzoek van hematoxyline en eosin gekleurde FFPE coupes van doelorganen aan het einde van de studie (Bijlage 1: Figuur S5).

Discussie