Gerichte enkelwandige koolstofnanobuisjes voor fotothermische therapie gecombineerd met immuuncontrolepuntremming voor de behandeling van gemetastaseerde borstkanker

Abstract

De grootste bijdragen aan kankersterfte zijn metastase en de gevolgen van de behandeling ervan. Hier presenteren we een nieuwe behandeling van uitgezaaide borstkanker die fotothermische therapie combineert met gerichte enkelwandige koolstofnanobuisjes (SWCNT's) en immunostimulatie met een checkpointremmer. We vinden dat de selectieve nabij-infrarode fotothermische ablatie van primaire orthotope EMT6-borsttumoren in syngene BALB/cJ-muizen met behulp van een annexine A5 (ANXA5) gefunctionaliseerd SWCNT-bioconjugaat synergetisch een anti-cytotoxisch T-lymfocyt-geassocieerd eiwit 4 (anti-CTLA- 4)-afhankelijke abscopale respons, resulterend in een verhoogde overleving (55%) 100 dagen na tumorinoculatie. Ter vergelijking:er was geen overleving na 100 dagen voor zowel fotothermische therapie als alleen immunostimulatie. Voorafgaand aan fotothermische therapie werd het SWCNT-ANXA5-bioconjugaat systemisch toegediend in een relatief lage dosis van 1,2 mg/kg, waar het zich vervolgens ophoopte in tumorvasculatuur via ANXA5-afhankelijke binding. Tijdens fotothermische therapie bereikte de gemiddelde maximale temperatuur in de tumor 54 ° C (duur 175 s). Het mechanisme van verlengde overleving als gevolg van combinatorische fotothermische ablatie en immuunstimulatie werd geëvalueerd door flowcytometrische kwantificering van antitumorale immuuneffectorcellen van de milt en kwantificering van serumcytokine.

Inleiding

Metastase en de gevolgen van de behandeling ervan zijn de belangrijkste doodsoorzaak bij kanker [1]. Wanneer borstkanker bijvoorbeeld uitzaait, daalt de 5-jaarsoverleving van de patiënt tot minder dan 25%. Hoewel in de afgelopen 60 jaar meer dan 200 nieuwe antineoplastische geneesmiddelen de patiëntresultaten hebben verbeterd, blijft de algehele overleving slecht bij gemetastaseerde ziekten [2]. Hier wordt een nieuwe combinatie van fotothermische therapie, gefaciliteerd door een op tumor gerichte enkelwandige koolstof nanobuis (SWCNT) bioconjugaat en anti-cytotoxische T-lymfocyt-geassocieerde proteïne 4 (anti-CTLA-4) checkpoint-remming bestudeerd voor de behandeling van uitgezaaide borstkanker in een orthotopisch muizenmodel.

De unieke eigenschappen van SWCNT's als nanomateriaal hebben veel belangstelling gewekt voor het gebruik ervan als een potentieel hulpmiddel in de strijd tegen kanker. Hoewel SWCNT's een verscheidenheid aan biologische effecten uitoefenen, is het gebruik van SWCNT's bij de behandeling van kanker voornamelijk gericht op hun interactie met nabij-infrarood (NIR) licht en het resulterende fotothermische effect, waarbij SWCNT's de tumor snel verwarmen in het proces dat fotothermische therapie wordt genoemd. (PTT). Talloze groepen hebben het potentieel onderzocht van SWCNT's voor gebruik in op PTT gebaseerde behandelingsstrategieën in verschillende modellen van borstkanker [3,4,5,6,7,8,9,10]. Deze werken waren grotendeels gericht op het vermogen van PTT om primaire tumoren te behandelen op diepten van niet meer dan enkele mm, waar de verzwakking van NIR-licht bijna volledig is.

Eerder toonden we aan dat primaire orthotope borsttumoren bij syngene muizen bijna volledig konden worden geëlimineerd met behulp van mild NIR-laserlicht in combinatie met een fotothermisch versterkend SWCNT-bioconjugaat [11]. In dit bioconjugaat werden de SWCNT's gefunctionaliseerd met het eiwit annexine A5 (ANXA5), dat met hoge affiniteit bindt aan het anionische fosfolipide fosfatidylserine dat extern tot expressie wordt gebracht op tumorcellen en op endotheelcellen van het tumorvasculatuur, maar niet op normale cellen in het vaatstelsel [ 12,13,14]. Dit conjugaat werd gevisualiseerd met behulp van atomic force microscopie (AFM) om aan te tonen dat de hoogte van het conjugaat tussen 2,5 en 5,0 nm was, wat vergelijkbaar is met die voor andere SWCNT-eiwitconjugaten [11]. Hoewel in dit eerdere metastatische model primaire tumoren konden worden uitgeroeid, verlengde fotothermische therapie alleen de overleving slechts bescheiden. We hebben echter voorlopig bewijs gevonden dat suggereert dat gelijktijdige behandeling met immunomodulatoren zoals cyclofosfamide de overleving kon verhogen.

Onlangs is er veel belangstelling geweest voor het potentieel voor immunomodulatoren zoals cyclofosfamide om SWCNT-gerichte PTT synergetisch te verbeteren. Een categorie veelbelovende immunomodulerende middelen zijn checkpointremmers. Checkpoint-remmers zijn antilichamen zoals anti-CTLA-4, anti-PD-1 en anti-PDL-1 die cruciale celeiwitten binden die verantwoordelijk zijn voor het moduleren van de reactie van het lichaam op kanker. Deze antilichamen blokkeren belangrijke biologische "checkpoints" waar het lichaam de reactie van het immuunsysteem op kanker kan neerwaarts reguleren. Deze eiwitten spelen normaal gesproken een belangrijke rol bij het beheersen van de immunologische reactie van het lichaam. Door de werking van deze eiwitten te blokkeren, verwijderen checkpointremmers een mechanisme waardoor het immuunsysteem normaal gesproken zijn natuurlijke antitumorale respons onderdrukt. Onlangs hebben verschillende groepen waargenomen dat de combinatie van anti-CTLA-4-controlepuntremming met SWCNT-versterkte PTT het potentieel heeft om een robuuste immuunrespons bij borstkanker te bevorderen [15, 16].

In de huidige studie evalueren we de combinatie van onze nieuwe PTT-modaliteit in combinatie met het immunostimulerende anti-cytotoxische T-lymfocyt-geassocieerde eiwit 4 (anti-CTLA-4). Oorspronkelijk goedgekeurd voor de behandeling van gemetastaseerd melanoom [17], wordt anti-CTLA-4 nu getest voor de behandeling van borstkanker in klinische onderzoeken in combinatie met andere immunostimulerende middelen [18]. We evalueren het mechanisme van verhoogde antineoplastische immuniteit in PTT in combinatie met anti-CTLA-4 checkpointremming, evenals het lot op langere termijn van SWCNT's in doelorganen.

Materialen en methoden

Materialen

Het plasmide dat codeert voor ANXA5, pET-30 Ek/LIC/ANX, werd eerder in dit laboratorium geconstrueerd [11]. Runderserumalbumine (BSA), Triton X-100, EDTA, β-mercapto-ethanol, fenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) en Tris-acetaat-EDTA-buffer waren van Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Natriumfosfaat en natriumdodecylsulfaat (SDS) waren van Mallinckrodt Chemicals (Phillipsburg, NJ). Ethanol van HPLC-kwaliteit was van Acros Organics (Waltham, MA). Zijn-trapkolommen waren van GE Healthcare (Chicago, IL). Flowcytometrie kleurbuffer, fixatie / permeabilisatiebuffer, permeabilisatiebuffer, chromogene endotoxine-kwantificatiekit en Slide-A-Lyzer dialysecassettes (3,5 kDa) waren van Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA). De dialysemembranen van 2 en 100 kDa waren van Spectrum Laboratories (Rancho Dominguez, CA). Roswell Park Memorial Institute celmedium (RPMI-1640) en Hank's uitgebalanceerde zoutoplossing waren van ATCC (Manassas, VA). Foetaal runderserum (FBS) was van Atlanta Biologicals (Lawrenceville, GA). Trypton, gistextract en kanamycinemonosulfaat werden verkregen van Alfa Aesar (Ward Hill, MA). Natriumhydroxide, kaliumchloride en natriumchloride waren van VWR Inc (Radnor, PA). HRV-C3-protease was van Sino Biologics (Portland, OR). Anti-CTLA-4 muis monoklonaal antilichaam (kloon:9H10) en muis cytokine ELISA kits (TNF-a, IFN-a, IL-6) werden verkregen van BioLegend (San Diego, CA). CoMoCAT SWCNT's (gemiddelde diameter 0,8 ± nm, gemiddelde lengte 1,5 ± 0,5 m) werden verkregen van CHASM (Boston, MA). Van de CoMoCAT-methode is bekend dat deze SWCNT van een klein aantal (n ,m ) chiraliteiten met hoge selectiviteit [19]. Het monster dat in dit onderzoek is gebruikt, is sterk verrijkt met [5, 6] SWCNT's, die een sterke NIR-lichtabsorptie vertonen bij een golflengte van 980 nm. Deze absorptie komt overeen met de S₁₁ overgang voor dit type nanobuis tussen een bezette singulariteit van Van Hove naar de overeenkomstige onbezette singulariteit. Daarom, om de stralingsabsorptie door de SWCNT die op de tumoren is afgezet te maximaliseren, was de golflengte van de laser die in dit onderzoek werd gebruikt 980 nm om exact overeen te komen met die van de S₁₁ optische overgang [20]. Afbeelding S1 in het aanvullende bestand 1 toont de fluorescentiespectra, met duidelijk de S₁₁ NIR-emissie na het opwekken van de S22-overgang met zichtbaar licht.

Celkweek

EMT6-borstkankercellen van ATCC (Manassas, VA) werden gekweekt in Waymouth's MB 752/1-medium met 2 mM L-glutamine aangevuld met 15% FBS. Alle cellen werden gekweekt bij 37 ° C en 100% vochtigheid onder 5% CO₂ . Alle cellen werden gepasseerd met 0,25% (w/v) trypsine in 0,53 mM EDTA. Celafstamming en mycoplasma-vrije status werden bevestigd via STR-testen (Charles River) en getest op endotoxinevrij door limulus-assay.

ANXA5- en SWCNT-ANXA5-productie

Het SWCNT-ANXA5-conjugaat is bereid met behulp van een procedure die we eerder hebben ontwikkeld en die 2,5 mg ANXA5/mg SWCNT [11] oplevert. In het kort, E. coli getransfecteerd met een plasmide dat codeert voor ANXA5, pET-30 Ek/LIC/ANX, werden gekweekt en gezuiverd met behulp van geïmmobiliseerde metaalaffiniteitschromatografie met geïmmobiliseerd Ni²⁺ om de ANXA5 te isoleren, waarbij enzymatische splitsing betrokken was om een (His)₆ te verwijderen label. Gevriesdroogde CoMoCAT SWCNT's werden gedispergeerd in 1% natriumdodecylsulfaat (SDS) met behulp van twee cycli van sondesonicatie bij 20 W en centrifugatie bij 29.600 g gedurende 30 minuten elk. De gesuspendeerde SWCNT's werden gekenmerkt door NIR-fluorescentie (aanvullend bestand 1:figuur S1) en vervolgens gedurende 30 minuten geconjugeerd aan een 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamine-polyethyleenglycol-maleimide (DSPE-PEG-maleimide) linker bij kamertemperatuur om hydrofobe interactie tussen SWCNT's en de DSPE-functionele groep mogelijk te maken. Dit werd vervolgens gevolgd door een dialyse van 8 uur in gedestilleerd water om overmaat linker en SDS te verwijderen. Het gedialyseerde conjugaat liet men vervolgens reageren met ANXA5, dat één cysteïnegroep bevat, gedurende 2 uur en geblokkeerd met 1,5 mg ml⁻¹ L-cysteïne. Het eindproduct, SWCNT-ANXA5, werd gedurende 8 uur gedialyseerd tegen 20 mM natriumfosfaatbuffer om overtollig ANXA5 en L-cysteïne te verwijderen. Eiwitgewicht en -zuiverheid werden gekarakteriseerd via SDS-PAGE. Het SWCNT- en ANXA5-gehalte van het bioconjugaat werd gekenmerkt door UV-Vis-NIR-fluorescentiespectroscopie, Fourier-transform infraroodspectroscopie (FT-IR) Raman-analyse en Bradford-assay (aanvullend bestand 1:figuur S2).

In vivo-onderzoeken

Alle procedures voldeden aan een protocol dat is goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de University of Oklahoma. Vrouwelijke BALB/cJ-muizen van 6 weken oud werden gebruikt (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME). Muizen kregen een standaard voer. Tijdens fotothermische bestraling van tumoren met een NIR-laserlicht werden muizen verdoofd met 2% isofluraan en 98% zuurstof met behulp van een neuskegel.

Tumoren werden geïnduceerd door orthotope injectie van 10⁶ EMT6-muisborstkankercellen in 100 µL PBS in het IV-borstvetkussentje. Tumoren mochten 12 dagen groeien, en toen ze een volume van 60 mm bereikten³ (~ 5 mm in diameter), kregen muizen een systemische i.v. injectie van 1,2 mg/kg SWCNT-ANXA5 (mg SWCNT per kg lichaamsgewicht) bioconjugaat via de laterale staartader. Na 3 uur werd een gebied 5 mm boven de tumorgrens bestraald met NIR-licht (980 nm) met een energie- en vermogensniveau van 175 J/cm² en 1 W/cm² , respectievelijk (tijd van 175 s; Diodevet-50 NIR-laser, B&W Tek Inc., Newark, DE). Controlepuntremming werd bereikt door seriële i.p. toediening van 200 µg anti-CTLA-4 antilichaam in 100 µl PBS op dag 8, 11 en 16 na tumorinoculatie. Het tumorvolume werd berekend met de gewijzigde ellipsoïde formule \(V =\frac{1}{2} \times {\text{length}} \times {\text{width}}^{2}\) met behulp van schuifmaatmetingen van de langste afmeting en loodrechte breedte. De tumortemperatuur werd gevolgd door een draagbare FLIR TG165 Spot thermische camera (Raymarine ITC, Fareham, VK) die was ingesteld op autoscan voor de maximale gedetecteerde temperatuur. Doelorganen werden geoogst voor evaluatie van de toxiciteit en gefixeerd in 10% neutraal gebufferde formaline, en gekleurd formaline-fixed-paraffin-embedded (FFPE) objectglaasjes werden bereid en gekleurd met hematoxyline en eosine voor toxiciteitsanalyse.

Ex Vivo SWCNT-detectie

Muizen kregen een systemische injectie van 1,2 mg/kg SWCNT-ANXA5 (mg SWCNT/kg lichaamsgewicht) via de laterale staartader. Op bepaalde tijdstippen, muizen (n = 3) werden geëuthanaseerd, aan necropsie onderworpen en doelorganen werden verwijderd voor analyse. Weefselmonsters werden bereid zoals eerder beschreven [21]. De aanwezigheid van SWCNT's in ex vivo weefselmonsters werd vervolgens bepaald door relatieve NIR-fluorescentiespectroscopie met behulp van een NS3 NanoSpectralyzer (Applied NanoFluorescence, Houston, TX).

Flowcytometrie

Muizen werden 14 dagen na de behandeling geëuthanaseerd en milt-antitumorale immuun-effectorcellen werden gekwantificeerd zoals eerder beschreven [21].

Cytokinedetectie

Na behandeling zoals hierboven beschreven, kunnen muizen (n = 4-5) werden geëuthanaseerd 7 dagen na fotothermische therapie voor bloedafname. De concentratie van de tumornecrosefactor alfa (TNF-α), interferon-gamma (IFN-γ) en interleukine 6 (IL-6) in verdunde serummonsters werd gekwantificeerd door ELISA volgens het protocol van de leverancier.

Statistische analyse

Gegevens werden geanalyseerd met Graphpad Prism-software. Statistische significantie werd beoordeeld met behulp van een one-way ANOVA en Tukey-Kramer meervoudige vergelijkingstest. De statistische significantie van overlevingscurven werd bepaald door de Mantel-Haenszel log-rank-test. De statistische significantie van de cytokineserumconcentratie werd geanalyseerd door middel van eenrichtings-ANOVA en de meervoudige vergelijkingstest van Dunnett. Meerdere vergelijkingen werden gecorrigeerd door de Bonferroni-drempel. Fout wordt grafisch weergegeven als de standaardfout van het gemiddelde, tenzij de fout de grootte van het geplotte symbool voor het gemiddelde punt niet overschrijdt, in welk geval de balken voor de duidelijkheid zijn uitgesloten.

Resultaten

Thermische kinetiek

Met een dosis van 1,2 mg/kg SWCNT-ANXA5 werd de maximale temperatuur van tumoren geregistreerd tijdens de behandeling met NIR-licht, zoals aangegeven in Fig. 1. Muizen die SWCNT-ANXA5 kregen voorafgaand aan bestraling hadden hogere tumortemperaturen voor de volledige NIR-lichtbehandeling vergeleken met muizen die fysiologische zoutoplossing kregen. De gemiddelde temperatuur van de tumor voor muizen die SWCNT-ANXA5 kregen, was significant anders dan voor muizen die fysiologische zoutoplossing kregen (54 °C vs. 37 °C, p < 0.05). Als gevolg van deze verbeterde fotothermische therapie trad alleen in de SWCNT-ANXA5-groep zichtbare tumorablatie op. Tumorablatie werd gekenmerkt door snelle verkleuring, gevolgd door huidcontractuur en het verschijnen van rimpels. Binnen 48 uur vormde zich een aanzienlijke korst op de plaats van fotothermische ablatie. Volledige hergroei van de huid duurde enkele weken.

Thermische kinetiek als gevolg van bestraling van tumoren met NIR-licht bij 980 nm. BALB/cJ-muizen met EMT6-tumoren werden geïnjecteerd door i.v. in de staartader met 1,2 mg/kg SWCNT-ANXA5. Na 3 uur wachten om SWCNT's uit de bloedsomloop te verwijderen, werden tumoren bestraald met een NIR-laser met een energie- en vermogensdichtheid van 175 J/cm² en 1 W/cm² , respectievelijk (t = 175 s). De maximale temperatuur van de tumor werd geregistreerd als functie van de tijd. De temperatuur van tumoren van muizen die SWCNT kregen was significant hoger dan van muizen die fysiologische zoutoplossing kregen op t = 175 s (p < 0.05). Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SE (n = 3)

Fotothermische therapie en remming van checkpoints

De resultaten van het combineren van fotothermische therapie met checkpointremming met behulp van anti-CTLA-4 monoklonaal antilichaam worden getoond in Fig. 2. Hoewel fotothermische therapie alleen primaire borstkankerneoplasie gemakkelijk uitroeide, beperkte het onvermogen van het NIR-laserlicht om verder te penetreren dan een paar mm de behandeling van uitzaaiingen van borstkanker. Om de tekortkomingen van gelokaliseerde NIR fotothermische antineoplastische behandeling te verhelpen, hebben we de combinatie van deze unieke therapeutische behandelingsmodaliteit met systemische checkpoint-remming onderzocht (Fig. 2). Hoewel fotothermische therapie uitblinkt in het vernietigen van primaire EMT6-tumoren (figuur 2a), slaagde deze behandeling er niet in om metastase uit te roeien en verhoogde de overleving van muizen met EMT6-orthotope tumoren slechts bescheiden (figuur 2b). Daarentegen verhoogde checkpoint-remming met anti-CTLA-4 de algehele overleving, maar vertraagde de primaire tumorgroei slechts tijdelijk. Hoewel geen van beide therapieën op zich enige toename van de algehele overleving opleverde, verbeterde de combinatie van zowel SWCNT-ANXA5 verbeterde fotothermische therapie als anti-CTLA-4 checkpointremming de algehele overleving, wat leidde tot 55% overleving 100 dagen na de tumorinoculatie.

Resultaten van combinatorische fotothermische therapie (PTT) en checkpoint-remming (anti-CTLA-4) in EMT6-tumoren. Muizen met goed ontwikkelde orthotope syngene tumoren (d ≥ 5 mm) kregen een i.v. systemische dosis van 1,2 mg/kg SWCNT-ANXA5. een De tumorvolumes werden vervolgens gevolgd na bestraling (pijl) met NIR-laserlicht gedurende 175 s bij een vermogensdichtheid van 1 W/cm² op dag 12 na inoculatie. Naast PTT kregen geselecteerde groepen anti-CTLA-4 (100 µg) op dag 8, 11 en 16. Muizen in de controlegroep werden i.v. met fysiologische zoutoplossing. Tumorvolume weergegeven als gemiddelde ± SE (n = 7). Significantie ten opzichte van de controle wordt aangegeven met * (p < 0.05). b De combinatie van fotothermische therapie en remming van het immuuncheckpoint verhoogde de overleving significant in vergelijking met controles (p < 0.05, n = 7). c , d Alleen wanneer muizen fotothermische therapie kregen in combinatie met anti-CTLA-4-controlepuntremming, waren de relatieve aantallen CD4⁺ significant verhoogd. en CD8⁺ splenocyten waargenomen 2 weken na PTT. Splenocyten weergegeven als gemiddelde ± SE (n = 3). Betekenis wordt aangegeven met *** (p < 0.005)

Cytometrische analyse van milt-effectorcellen na behandeling onthulde een vermoedelijk mechanisme van verbeterde overleving bij muizen die combinatorische fotothermische therapie en checkpoint-remming kregen. Muizen werden ingeënt met EMT6 en behandeld zoals eerder beschreven. Twee weken na de behandeling werden muizen opgeofferd en zowel de percentages als het relatieve aantal van meerdere typen immuuneffector werden gekwantificeerd. Populaties van helper-T-cellen, cytotoxische T-cellen, neutrofielen, van myeloïde afgeleide suppressorcel (MDSC) monocyten, FoxP3-regulerende T-cellen en macrofagen werden geëvalueerd (aanvullend bestand 1:figuur S3). Analyse van deze populaties bracht significante verschillen aan het licht tussen behandelingspopulaties en controles, alleen bij muizen die de combinatie van zowel fotothermische therapie als anti-CTLA-4-controlepuntremming samen kregen. Bij de dieren die deze combinatie kregen, zagen we een toename van het relatieve aantal helper-T-cellen (CD4⁺ ) en cytotoxische T-cellen (CD8⁺ ), (Fig. 2c, d). Verhogingen in CD4⁺ en CD8⁺ celtellingen correleerden met een grote toename van de miltgrootte die werd waargenomen na necropsie.

Naast cytometrische analyse van milteffectorcellen, werd de serumcytokineconcentratie 7 dagen na PTT bepaald om de mechanismen van antitumorale immuniteit te helpen ophelderen. De niveaus van de pro-inflammatoire cytokines IL-6, IFN-γ en TNF-α worden weergegeven in Fig. 3. Noch SWCNT noch anti-CTLA-4 behandeling alleen verhoogde de niveaus van cytokines significant in vergelijking met de onbehandelde controlegroep. PTT-behandeling alleen was echter in staat om TNF-α significant te verhogen. De verdere toevoeging van anti-CTLA-4 aan PTT-behandeling verhoogde de niveaus TNF-α, IL-6 en IFN-γ aanzienlijk.

Serum cytokine concentratie. Kwantificering van serumcytokineniveaus in muizenserum 7 dagen na PTT toonde een significante toename van IL-6-, IFN-γ- en TNF-α-niveaus bij muizen na PTT in combinatie met check-pointremming (anti-CTLA-4). De resultaten worden getoond voor de onbehandelde controle, alleen SWCNT-behandeling, alleen anti-CTLA-4-behandeling, PTT-behandeling en PTT + anti-CTLA-4-behandeling. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SE (n = 4–5). Statistische significantie werd geanalyseerd voor de behandelde groepen vergeleken met de onbehandelde controlegroep door middel van eenrichtings-ANOVA met Dunnett's meervoudige vergelijkingstest. Statistische significantie wordt aangegeven met * (p < 0.05) en **** (p < 0.0001)

Biodistributie en toxiciteit van SWCNT-ANXA5

De biodistributie van SWCNT-ANXA5 na toediening voor verbetering van fotothermische therapie in verschillende organen werd gevolgd met fluorescente kwantificering van SWCNT in ex situ weefsellysaten in vergelijking met standaarden (aanvullend bestand 1:figuur S4). Biodistributie in doelorganen werd gevolgd gedurende een periode van 4 maanden na i.v. injectie van 1,2 mg/kg SWCNT-ANXA5 bij gezonde muizen (Fig. 4a, b). Daarentegen werd de accumulatie van SWCNT-ANXA5 in EMT6-tumordragende muizen na toediening, volgens het eerder beschreven injectieprotocol, 3 uur na toediening bepaald. (Het tijdstip waarop fotothermische therapie werd uitgevoerd in de behandelingsstudie.) Tijdens de periode van 4 maanden voorafgaand aan de orgaanoogst werden muizen gecontroleerd op fysieke bijwerkingen en abnormaal gedrag. Er werden geen bijwerkingen waargenomen bij muizen die gedurende deze periode waren geïnjecteerd met SWCNT-ANXA5. Er werd geen histopathologische toxiciteit waargenomen tijdens onderzoek van met hematoxyline en eosine gekleurde FFPE-coupes van doelorganen aan het einde van het onderzoek (aanvullend bestand 1:figuur S5).

Biodistributie van SWCNT-ANXA5 gemeten als % van de geïnjecteerde dosis (a ) en weefselconcentratie in g/L (b ). Het SWCNT-ANXA5-conjugaat was i.v. geïnjecteerd in Balb/cJ-muizen in een dosis van 1,2 mg/kg. De SWCNT-concentratie werd gemeten in verschillende organen van muizen zonder tumoren na 1, 2, 3 en 4 maanden (van links naar rechts). Voor muizen met tumoren werd de concentratie van SWCNT's gemeten op het moment dat deze onmiddellijk voorafgaand aan de fotothermische therapiebehandeling zou zijn. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SE (n = 3)

Discussie

De hier gepresenteerde gegevens ondersteunen de effectiviteit van het combineren van gerichte fotothermische therapie en remming van het immuunsysteem voor de behandeling van uitgezaaide borstkanker. Dit fenomeen staat bekend als het "abscopale effect", dat het vermogen van gelokaliseerde straling beschrijft om een antitumorrespons te initiëren die tumorgroei op afstand van het primaire doelwit onderdrukt. Al in de jaren vijftig merkten onderzoekers op dat gelokaliseerde tumorbestraling een significant effect had op verre tumoren [22]. Studies hebben aangetoond dat de systemische aard van het abscopale effect te wijten is aan de immuunrespons van de gastheer [23,24,25]. Hoewel γ-bestraling de belangrijkste focus is geweest van het meeste abscopale onderzoek, toont een groeiend oeuvre aan dat fotothermische therapie ook een abscopal effect kan induceren. Talrijke studies hebben aangetoond dat thermische ablatie in combinatie met de checkpointremmer anti-CTLA-4 een verhoogde immuunrespons geeft [16, 26,27,28,29]. We zien een vergelijkbare abscopale respons na gerichte fotothermische ablatie en anti-CTLA-4-blokkade in het EMT6-model van borstkanker.

Het abscopale effect wordt geïllustreerd door de gegevens in Fig. 2a, b. Orthotope EMT6-tumoren groeien snel en zijn uitgezaaid tegen de tijd dat ze worden behandeld met fotothermische therapie. Dit is de reden waarom muizen met tumoren die alleen met fotothermische therapie werden behandeld, slechts een lichte toename in overleving hadden in vergelijking met de onbehandelde muizencontrole, hoewel de primaire tumor volledig was verwijderd. De toediening van alleen anti-CTLA-4 vertraagde de tumorgroei in vergelijking met de controle en verhoogde de overlevingstijd tot 68 dagen, maar leidde niet tot genezing. Een vergelijkbaar resultaat van vertraagde EMT6-tumorgroei werd waargenomen door Jure-Kunkel et al. wanneer anti-CTLA-4 werd toegediend [30]. Voor de combinatie van fotothermische therapie en anti-CTLA-4 overleefde 55% van de behandelde muizen 100 dagen na tumorinoculatie en is waarschijnlijk genezen.

Inzicht in het mechanisme van antitumorimmuniteit werd geëvalueerd met behulp van flowcytometrie om de populaties van immuuneffectorcellen in de milt te kwantificeren. Vergeleken met fotothermische therapie of alleen anti-CTLA-4, resulteerde de combinatietherapie in een zevenvoudige toename van helper CD4⁺ T-cellen en een drievoudige toename van cytolytische CD8⁺ T-cellen, beide resultaten zijn zeer statistisch significant (p < 0,005). Deze resultaten leveren verder bewijs van een mogelijke abscopale respons door de combinatie van fototherapie en T-cel co-stimulatietherapie met remming van het immuunsysteem.

Verhogingen in CD4⁺ en CD8⁺ celtellingen correleerden met een toename van de miltgrootte die werd waargenomen tijdens necropsie. Een grotere milt duidt op een verhoogde immuunrespons. De milt bestaat uit meerdere celtypen, waarvan de meest voorkomende zijn van de CD4⁺ , CD8⁺ , en B-cellijnen [31, 32]. Hoewel niet onderzocht in dit werk, zouden we verwachten dat het aantal B-cellen samen met CD4⁺ toeneemt en CD8⁺ T-cellen tellen [33]. Helper CD4⁺ T-cellen helpen bij humorale immuniteit door andere immuuncellen te vergemakkelijken door cytokinestimulatie en directe cel-celinteracties. Cytolytische CD8⁺ T-cellen doden tumorcellen direct. Verhogingen in CD4⁺ en CD8⁺ celaantallen zijn indicatief voor een systemische abscopale immuunrespons.

De aanwezigheid van een systemische abscopale immuunrespons na de combinatiebehandeling wordt verder ondersteund door verhogingen van pro-inflammatoire cytokineniveaus in muizenserum (Fig. 3). TNF-α activeert tumor-geassocieerde macrofagen om antitumorale effecten te vertonen [34, 35]. IFN-γ speelt een belangrijke rol bij tumorsurveillance [36, 37]. IL-6 bevordert de proliferatie van macrofagen en lymfocyten [38]. De significante toename van deze effectormoleculen in muizenserum 7 dagen na PTT-behandeling in combinatie met anti-CTLA-4 ondersteunt verder het bestaan van een antitumorale immuunrespons.

Aan het einde van de bestraling van muizen die SWCNT hadden gekregen, was de gemiddelde maximale tumortemperatuur 54 °C; deze temperatuur was voldoende om de tumor volledig weg te nemen (Fig. 1). Dit ligt binnen het bereik van 45-60 ° C waarin enzyminactivering en mitochondriaal letsel optreedt [39]. De temperatuur van tumoren in de controlegroep met zoutoplossing bleef onder de 40 °C, een temperatuur die minimaal therapeutisch voordeel biedt [39,40,41].

We hebben waargenomen dat de meeste SWCNT-ANXA5-accumulatie op basis van concentratie voornamelijk in de lever, het hart, de milt, de nieren, de longen en de tumor was (figuur 4a). Bij muizen met EMT6-tumoren zagen we dat de SWCNT-ANXA5-concentratie vergelijkbaar was met die in de lever en de nieren (Fig. 4a, b). Sporenhoeveelheden SWCNT-ANXA5 werden gedetecteerd in de hersenen, dikke darm en dunne darm. Het is belangrijk op te merken dat de biodistributie van SWCNT op basis van % van de geïnjecteerde dosis (ID) niet goed correleert met de absolute concentratie van SWCNT in een doelweefsel. Dit komt voornamelijk door de verschillen tussen orgelgewichten. Een gegeven % ID binnen een orgaan zal bijvoorbeeld overeenkomen met een hogere concentratie in kleinere organen en kleinere concentraties in grotere organen. Vergelijking van monsters op basis van SWCNT-concentratie laat zien dat de hoogste concentratie zich in de nier bevindt, op de voet gevolgd door de lever en de milt (Fig. 4a).

Er is enig bewijs van afbraak van SWCNT's in de verschillende organen gedurende de periode van het biodistributieonderzoek (Fig. 4a, b). Afbraak van SWCNT's in organen wordt verwacht op basis van een eerdere bevinding dat meerwandige koolstofnanobuisjes worden afgebroken in macrofagen [42]. De SWCNT's die in ons onderzoek zijn gebruikt, hebben een gemiddelde diameter van 0,8 nm en een gemiddelde lengte van 1500 µm. Op basis van een onderzoek van Zhu et al. wordt niet voorspeld dat deze grootte cytotoxisch is. [43], die het potentieel voor beschadiging van de lipide dubbellaag door toxiciteit van koolstofnanobuizen classificeerde op basis van lengte en diameter. Volgens deze classificatie vallen de SWCNT's die we hebben gebruikt in de categorie "biologisch zacht", waardoor de cytotoxiciteit wordt geminimaliseerd, wat consistent is met onze waarnemingen in de onderzoeken bij muizen waarbij we geen bijwerkingen of histopathologische toxiciteit hebben waargenomen als gevolg van het toedienen van de SWCNT -ANXA5 geconjugeerd.

Conclusies

Hier demonstreren we een nieuwe combinatorische behandelingsmodaliteit waarbij we een relatief hoog overlevingspercentage verkrijgen bij muizen met agressieve uitgezaaide borstkanker met behulp van fotothermische therapie met het SWCNT-ANXA5-bioconjugaat in combinatie met op anti-CTLA-4 gebaseerde checkpoint-remming. Het gebruik van het tumor-vasculaire targeting-eiwit ANXA5 minimaliseerde de hoeveelheid systemisch afgegeven SWCNT die nodig is om primaire tumoren uit te roeien in een lage eenmalige dosis. Interessant is dat we een toename in overleving zagen van muizen met uitgezaaide kanker die werden behandeld met combinatorische therapie, hoewel alleen de primaire tumor werd bestraald. Een mechanistische studie die het aantal belangrijke milt-antitumoreffectorcellen kwantificeerde, onthulde dat alleen de combinatie van beide behandelingsmodaliteiten het aantal CD4⁺ verhoogde helper en CD8⁺ cytotoxische T-cellen. We veronderstellen dat deze toename van T-cellen een abscopale respons weerspiegelt, waarbij antitumorale effectorcellen tumormetastase onderdrukten. Hoewel er 4 maanden na toediening nog steeds SWCNT's in organen aanwezig waren, werden tijdens de experimenten geen bijwerkingen of duidelijke weefseltoxiciteit waargenomen.

Beschikbaarheid van gegevens en materialen

Alle gegevens zijn onbeperkt beschikbaar.

Afkortingen

SWCNT:: Enkelwandige koolstof nanobuis
ANXA5:: Bijlage in A5
anti-CTLA-4:: Anti-cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4
EDTA:: Ethylenediamine tetraacetic acid
SDS-PAGE:: Sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gel electrophoresis
DSPE:: 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine
PTT:: Photothermal therapy

Voorbereiding van SnIn4S8/TiO2 nanobuis fotoanode en zijn fotokathodische bescherming voor Q235 koolstofstaal onder zichtbaar licht Verbeterde UV-emissie van ZnO op arrays van zilveren nanodeeltjes door het Surface Plasmon Resonance-effect

Nanomaterialen

Metaal

Hars

vezel

Samengesteld materiaal