¹³¹I-Gelabelde PLGA-Lipide Nanodeeltjes voor Gerichte Paclitaxel Aflevering en Imaging in Melanoomtherapie

Samenvatting

Hierin werden foliumzuur (FA) geconjugeerde Poly(d,l-lactide-co-glycolide) (PLGA)-lipide composieten (FA-PL) ontwikkeld als nanodragers voor de gerichte aflevering van onoplosbare anti-kankermedicijn paclitaxel (PTX), wat resulteerde in FA-PLP nanodeeltjes. Verder werd ¹³¹I, als radioactieve tracer, gebruikt om FA-PLP nanodeeltjes te labelen (FA-PLP-¹³¹I) om hun celopname-activiteit, in vivo bloedsomloop, en biodistributie te evalueren. De FA-PLP-¹³¹I nanodeeltjes hadden een sferische morfologie met grote stabiliteit, een smalle grootteverdeling (165,6 en 181,2 nm), en -22,1 mV in gemiddeld zeta-potentieel. Confocale laserscanningmicroscopie toonde aan dat het doelwit-molecuul FA de opname van PLP-¹³¹I door melanoom B16F10-cellen bevordert, wat verder bevestigd werd door de celincorporatiesnelheid via ¹³¹I activiteitsdetectie gemeten door een gamma-teller. FA-PLP-¹³¹I zonder PTX (FA-PL-¹³¹I) toont geringe cytotoxiciteit, goede biocompatibiliteit, terwijl FA-PLP-¹³¹I gedemonstreerd werd efficiënte cellevensvatbaarheid-onderdrukking te hebben vergeleken met vrij PTX en PLP-¹³¹I. Na intraveneuze injectie werd de bloedsomloop halfwaarde-tijd van vrij PTX (t₁/₂ = 5,4 ± 0,23 uur) verlengd tot 18,5 ± 0,5 uur door FA-PLP-¹³¹I. Door FA-targeting was de tumoropname van FA-PLP-¹³¹I ongeveer 4,41- en 12,8-voudig hoger vergeleken met die van PLP-¹³¹I en vrij PTX-¹³¹I, respectievelijk. Bovendien, na 40 dagen behandeling, toonde FA-PLP-¹³¹I een verbeterde tumor-inhibitie-effect vergeleken met vrij PTX en PLP-¹³¹I, zonder recidief en zonder opvallende systemische in vivo toxiciteit. De resultaten tonen aan dat de ¹³¹I-gelabelde PLGA-lipide nanodeeltjes simultaan toegepast kunnen worden voor gerichte medicijnaflevering en betrouwbare tracking van medicijnen in vivo.

Achtergrond

Een van de meest agressieve huidkankers, melanoom, ontstaat uit de maligne transformatie van melanocyten. Gegeven de gemakkelijke recidief en hoge potentieel voor metastasering, is de 5-jaars overleving van gemetastaseerde melanoom-patiënten slechts 10%. Tot nu toe is de meest voorkomende behandeling voor melanoom-patiënten chemotherapie, wat vergezeld wordt door ongewenste ernstige bijwerkingen, lage biobeschikbaarheid, slechte tumor-selectiviteit, en dosis-beperkende systemische toxiciteit, wat grote uitdagingen vormt in tumor-chemotherapie.

Paclitaxel (PTX), een natuurlijke plantenextract afkomstig van de gedroogde wortels, takken, bladen, en bast van taxus, een geslacht van naaldbomen, toont effectieve antitumor-activiteit tegen diverse soorten tumoren, inclusief ovariaal carcinoom en longkanker. Daarnaast is PTX ook gerapporteerd als efficiënt tegen humaan melanoom. Niettemin, naast de bovengenoemde nadelen van chemotherapeutische middelen, wordt een Cremophor EL en gedroogde alcohol (1:1, v/v) mengsel in de huidige klinische praktijk gebruikt als verdunningsmedium voor PTX, wat kan leiden tot ernstige bijwerkingen, inclusief overgevoeligheid. Daarom is de ontwikkeling van nieuwe strategieën om de wateroplosbaarheid en tumor-accumulatie van chemotherapeutica te verbeteren om hun perifele blootstelling te verminderen en hun in vivo toxiciteit te minimaliseren, van cruciaal belang. De recente ontwikkeling van biocompatibele medicijn-nanodragers biedt het potentieel om de fysiologische stabiliteit van PTX te verbeteren. Bovendien zou de conjugatie van doelwit-moleculen aan deze nanodragers de selectieve aflevering van chemotherapeutica aan tumorplaatsen met verminderde perifele blootstelling via een tumorcel-oppervlakte-receptor-gemediaal gericht effect toelaten.

Hierin prepareerden we een Poly(d,l-lactide-co-glycolide) (PLGA)-lipide composiet dat covalent foliumzuur (FA: een tumor-doelwit-molecuul) conjungeert en PTX encapsuleert als chemotherapeutisch medicijn voor melanoombehandeling. Bovendien werd ¹³¹I, een radioactieve marker, gebruikt om de PLGA-lipide nanodeeltjes radioactief te labelen om hun in vivo gedrag duidelijk te beoordelen. Vanwege zijn negatieve bètastraalting, fysieke halfwaarde-tijd, en brede reeks vervalseigenschappen, wordt ¹³¹I veel gebruikt als radiolabel in de kliniek. De morfologie, stabiliteit, en dispersiteit van de ¹³¹I-gelabelde PLGA-lipide nanodeeltjes (FA-PLP-¹³¹I) werden in vitro geëvalueerd. Verder werden de celopname, bloedsomloop, en biodistributie van FA-PLP-¹³¹I onderzocht door de radioactiviteit van ¹³¹I te meten. Bovendien werd de gerichte anticancereffectiviteit van FA-PLP-¹³¹I bestudeerd in vitro en in vivo. De resultaten wijzen erop dat FA-PLP-¹³¹I een veelzijdig nanoplatform kan zijn voor gebruik als potentiële tumor-medicijnafleveringsnanodrager voor chemotherapeutische middelen.

Methoden

Materialen

Poly(d,l-lactide-co-glycolide) (PLGA, MW: 5000–15.000, lactide:glycolide (50:50)) en chloramine-T werden aangeschaft bij Sigma Aldrich (St. Louis, MO, VS). Na¹³¹I werd verkregen van Atomic Hitech (Peking, China). PTX (99%) en 4′,6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) werden aangeschaft bij Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. (Shanghai, China). Sojalecithine bestaande uit 90–95% fosfatidylcholine, 1,2-distearoil-sn-glycero-3-fosfoethanolamine-N-[folaat (polyethyleenglycol)-2000] (DSPE-PEG₂₀₀₀-FA), en 1,2-distearoil-sn-glycero-3-fosfoethanolamine-N-[carboxy (polyethyleenglycol)-2000] (DSPE-PEG₂₀₀₀-COOH) werden verkregen van Avanti (Alabaster, AL, VS). Alle celcultuurreagentia werden aangeschaft bij Sigma Aldrich.

Preparatie van FA-PLP Nanodeeltjes

FA-PLP nanodeeltjes werden gesynthetiseerd door een zelf-assemblage nanoprecipitatie-methode. In detail, 10 mg PTX werd opgelost in 1 mL ethanol en 2 mg PLGA werd opgelost in 1 mL dichloormethaan. Na het mengen ervan, werd lecithine/DSPE-PEG₂₀₀₀-FA (4:1) ethanol-wateroplossing (4 gew.%) druppelgewijs toegevoegd aan de mengseloplossing voor 4 uur zacht roeren bij 25 °C. Het mengsel werd gefiltreerd en driemaal gewassen met gedemineraliseerd water met behulp van een Millipore ultrafiltratiecentrifugebuis om het niet-geencapsuleerde medicijn en organisch oplosmiddel te verwijderen. Als controle werden nanodeeltjes zonder FA-molecuul-grafting geprepareerd door dezelfde methode, DSPE-PEG₂₀₀₀-FA te vervangen door DSPE-PEG₂₀₀₀-COOH. De gezuiverde FA-PLP nanodeeltjes werden op 4 °C bewaard tot verder gebruik.

Preparatie van ¹³¹I-Gelabelde FA-PLP Nanodeeltjes

Radioactieve FA-PLP (FA-PLP-¹³¹I) nanodeeltjes werden geprepareerd door de chloramine-T oxidatiemethode. Een mengsel van 1 mL FA-PLP (1 mg/mL), 500 μCi Na¹³¹I (wat de maximale radioactiviteit is die op FA-PLP gegraft kan worden), en 100 μL van 5 mg/mL chloramine-T werden gereageerd in een pH 7,5 fosfaatbuffer voor 10 min bij kamertemperatuur. De reactie werd vervolgens gekweld door 200 μL natriummetabisulfiet (5 mg/mL) toe te voegen. ¹³¹I-gelabelde PLP en PTX werden volgens dezelfde procedure geprepareerd. Ze werden gezuiverd met een centrifugatiebuis (Millipore) om de overgebleven vrije Na¹³¹I te verwijderen tot geen gamma-activiteit detecteerbaar was in de filtraatoplossing. De radiolabelingsopbrengst en zuiverheid van de gelabelde nanodeeltjes werden geanalyseerd met een gamma-teller (LKB gamma 1261; LKB Instruments).

Karakterisering

UV-vis absorptiespectra werden opgemeten met een UV-vis spectrophotometer (UV7502, Shanghai Advanced Photoelectric Technology Co., Ltd., Shanghai, China). Transmissie elektronenmicroscopie (TEM) beelden werden verzameld op een Zeiss LIBRA 120 TEM. De grootte, zeta-potentieel, en polydispersiteitsindex (PDI) van nanodeeltjes werden gedetecteerd door dynamische lichtverstrooiing (DLS) analyse met een Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments). Optische foto's werden genomen met een Nikon D3200 digitale camera.

Celcultuur

De muis melanoom-celijn B16F10 werd verkregen van de Celbank van de Type Cultuurverzameling van de Chinese Academie van Wetenschappen (Shanghai, China) en gekweekt in DMEM bevattende 10% foetaal kalfserum en 100 U/mL penicilline/streptomycine in een gevochtigde 5% CO₂-atmosfeer bij 37 °C.

In Vitro Incorporatie Assays

Tijdsafhankelijke in vitro incorporatie-assays werden uitgevoerd om de optimale celbindings-efficiëntie-tijden voor de ¹³¹I-gelabelde verbindingen te bepalen. B16F10-cellen werden gezaaid in 24-wells platen bij 1 × 10⁵ cellen per put en gekweekt tot confluentie. Radiojodide monsters (¹³¹I, PL-¹³¹I, FA-PL-¹³¹I, PLP-¹³¹I, FA-PLP-¹³¹I) werden in DMEM-media geprepareerd en apart aan de celcultuurputten toegevoegd. Na 0,5, 1, 2, 4, en 6 uur incubatie werden de cellen driemaal gewassen met PBS en hun radioactiviteit gemeten met een gamma-teller (Wetenschaps- en Technologie-instituut van China, Jia Branch Innovation Co., Ltd.). Incorporatiewaarden (%) werden berekend zoals beschreven in eerdere literatuur. Bovendien werden nanodegtjes gelabeld met de fluorescente kleurstof fluoresceïne-isothiocyaan (FITC, Sigma) en geïncueerd met B16F10-cellen. De fluorescente afbeeldingen van cellen werden vastgelegd met een commerciële confocale laserscanningmicroscoop (FV1200, Olympus, Tokio, Japan).

In Vitro Cytotoxiciteitsassay

De MTT-cellevensvatbaarheidsassay werd gebruikt om de cytotoxiciteit van de controle nanodragers, PL-¹³¹I, en FA-PL-¹³¹I, alsook die van vrij PTX, PLP-¹³¹I, en FA-PLP-¹³¹I, tegen B16F10-cellen te bestuderen. Kortweg, B16F10-cellen werden geplaate in 96-wells platen voor 24 uur en blootgesteld aan PL-¹³¹I en FA-PL-¹³¹I (met 0–100 μg/mL PLGA-lipide), of vrij PTX, PLP-¹³¹I, en FA-PLP-¹³¹I (bij verschillende concentraties van 0–40 μg/mL) voor 24 uur. Het experiment werd in drievoud uitgevoerd. Alle data werden uitgedrukt als het gemiddelde ± SD.

Diermodel

3- tot 5-wekelijke Balb/c muizen werden aangeschaft bij Shanghai Slack Laboratorium Dier Co., Ltd. (Shanghai, China). Alle dierproeven werden goedgekeurd door het Dierverzorgings- en Gebruikscomité van Fudan Universiteit, wat voldoet aan de NIH-richtlijnen voor de verzorging en het gebruik van laboratoriumdieren.

B16F10-cellen (1 × 10⁶) in PBS werden subcutaneus geïnjecteerd in de rechter flank van muizen. De groeiende tumorvolume werd gemeten met een schuifmaat, en het tumorvolume werd berekend met de formule: volume = (lengte × breedte²)/2. Toen het tumorvolume ongeveer 80 mm³ bereikte, werden de muizen gerandomiseerd in de experimentele groepen.

Bloedsomloop en Biodistributie Studie

Gezonde Balb/c muizen werden intraveneus geïnjecteerd met PTX-¹³¹I en FA-PLP-¹³¹I (100 μL van 10 μCi per muis, 5 mg/kg). Bloedsomloop werd gemeten door ongeveer 10 μL bloed af te nemen van de staart van muizen. De radioactiviteit in bloed werd gemeten met een gamma-teller. Om de nanodeeltjesbiodistributie te detecteren, werden muizen dragend een B16F10-tumor geïnjecteerd met PTX-¹³¹I, FA-PL-¹³¹I, PLP-¹³¹I, en FA-PLP-¹³¹I bij dezelfde dosis en 24 uur na injectie geoogst. De hoofdorganen werden geweegd en verzameld voor gamma-telling.

In Vivo Tumor Chemotherapie

Balb/c muizen dragende B16F10-tumor werden geïnjecteerd met 150 μL zoutoplossing, vrij PTX, PLP-¹³¹I, en FA-PLP-¹³¹I (bij dezelfde PTX-concentratie, 5 mg/kg). De tumor-grootte en lichaamsgewicht werden gemeten met een schuifmaat elke 4 dagen. Relatieve tumorvolumes werden berekend als V/V₀ (V₀ was het tumorvolume toen de behandeling gestart werd). Na ongeveer 40 dagen behandeling werden de muizen geoogst en de hoofdorganen verzameld, vastgezet in 4% formaline, in paraffine inbedd en gesneden, gekleurd met hematoxyline en eosine, en onderzocht onder een digitale microscoop.

Resultaten en Discussie

Preparatie en Karakterisering van ¹³¹I-Gelabelde FA-PLP Nanodeeltjes

Het syntheseschema van FA-PLP-¹³¹I nanodeeltjes wordt getoond in Fig. 1. In het kort, FA-PLP nanodeeltjes werden gesynthetiseerd door een zelf-assemblage nanoprecipitatie-methode en radioactieve FA-PLP (FA-PLP-¹³¹I) werd geprepareerd met de chloramine-T oxidatiemethode. PTX werd geencapsuleerd door het PLGA-lipide composiet, dat vervolgens gekoppeld werd met covalente geconjugeerde FA op het oppervlak van de schil via PEGylatie. Ten slotte werd ¹³¹I op het buitenste nanodeeltjesoppervlak gegraft. TEM-beelden toonden aan dat de FA-PLP-¹³¹I nanodeeltjes een sferische morfologie hadden met smalle grootteverdeling (165,6 tot 181,2 nm), wat bevestigd werd door dynamische lichtverstrooiing (Fig. 2a, b). Het zeta-potentieel varieerde van -39,1 tot -3,2 mV (Fig. 2c). De UV-vis-spectra van vrij PTX en FA-PLP-¹³¹I (met dezelfde PTX-concentratie) toonden hetzelfde kenmerkende piek bij 233 nm (Fig. 2d), wat aangeeft dat PTX geencapsuleerd was binnen FA-PLP-¹³¹I en dat encapsulatie de absorptie-intensiteit van PTX niet beïnvloedde. Na berekening werd de encapsulatie-efficiëntie van PTX in FA-PLP-¹³¹I getoond als 56,35 ± 1,6%. De radiolabelingsopbrengst van PTX-¹³¹I, PL-¹³¹I, FA-PL-¹³¹I, PLP-¹³¹I, en FA-PLP-¹³¹I was 45,6 ± 2,3, 52,1 ± 4,1, 48,9 ± 1,9, 56,3 ± 2,5, en 54,8 ± 2,7, respectievelijk.

Stabiliteit is essentieel voor de biomedische toepassing van nanodeeltjes. Na 4 weken opslag toonden FA-PLP-¹³¹I opgelost in water, celmedia, foetaal kalfserum, en PBS geen veranderingen in gemiddelde grootte, zeta-potentieel, PDI-index (Fig. 3a–c), wat grote stabiliteit en dispersiteit aangeeft. Bovendien werd de radiolabelingsstabiliteit van FA-PLP-¹³¹I gedetecteerd in muisplasma bij 37 °C (Fig. 3d), wat minder dan 15% de-jodering binnen 7 dagen toonde.

In Vitro Cellulaire Opname

Figuur 4 toont de in vitro tijdsafhankelijke incorporatie van ¹³¹I, PL-¹³¹I, FA-PL-¹³¹I, PLP-¹³¹I, en FA-PLP-¹³¹I in B16F10-cellen gemeten door een gamma-teller. FA-PLP-¹³¹I, alsook FA-PL-¹³¹I, toonden de hogere incorporatiewaarden dan die van alle geteste tijdspunten, toenemend met de tijd. De incorporatiewaarden van FA-PLP-¹³¹I op 6 uur waren 3,12- en 23,4-voudig hoger dan die van ¹³¹I en PLP-¹³¹I, in overeenstemming met de resultaten van confocale laserscanningmicroscopie-afbeeldingen van B16F10-cellen geïncueerd met fluoresceïne-isothiocyaan-gelabelde FA-PLP-¹³¹I en PLP-¹³¹I nanodeeltjes (Aanvullend bestand 1: Figuur S1). Deze resultaten tonen de hoge cellulaire opname van FA-PLP-¹³¹I, waarschijnlijk door het FA-gemediaal target-effect op B16F10-cellen.

In Vitro Cytotoxiciteit

De cytotoxiciteit van de controle nanodragers, PL-¹³¹I, en FA-PL-¹³¹I werd getest door MTT-assay. Cellen behandeld met PL-¹³¹I en FA-PL-¹³¹I gedurende 24 uur hadden een gelijke levensvatbaarheid als de controle (Fig. 5a), wat een goede biocompatibiliteit aangeeft. Bovendien was FA-PLP-¹³¹I veel effectiever in het onderdrukken van B16F10-celproliferatie dan vrij PTX en PLP-¹³¹I bij dezelfde PTX-concentratie (Fig. 5b), wat uitstekende cel-gerichte chemotherapie aangeeft. De resultaten tonen aan dat FA-PLP-¹³¹I een hoge chemotherapeutische effect heeft zonder radiotoxiciteit en cytotoxiciteit.

Bloedsomloop en Biodistributie Studie

Radiolabeling is gerapporteerd als betrouwbaarder dan fluorescentie-imaging voor de kwantitatieve en nauwkeurige in vivo tracking van nanodeeltjes. ¹³¹I-gelabelde FA-PLP nanodeeltjes werden geprepareerd om hun in vivo gedrag te onderzoeken, inclusief bloedsomloop en biodistributie, gemeten door een gamma-teller. De bloedsomloop halfwaarde-tijd van vrij PTX (t₁/₂ = 5,4 ± 0,23 uur) werd verlengd tot 18,5 ± 0,5 uur door FA-PLP-¹³¹I (Fig. 6a) door nanodeeltjesencapsulatie, wat gunstig was voor tumor-targeting-accumulatie. Vervolgens werd de biodistributie van vrij PTX-¹³¹I, PLP-¹³¹I, en FA-PLP-¹³¹I in B16F10-tumor-dragende muizen op 1 dag post-injectie onderzocht (Fig. 6b). FA-PLP-¹³¹I, alsook FA-PL-¹³¹I, vertoonde een duidelijke verbetering van tumoropname, wat 4,41- en 12,8-voudig was dan die van PLP-¹³¹I en vrij PTX-¹³¹I, respectievelijk, waarschijnlijk door de verlengde bloedsomloop van FA-PLP-¹³¹I, FA-PL-¹³¹I, en het FA-targeting-effect. Bovendien vertoonden de lever en milt ook een relatief hoge opname door hun nanodeeltjes-metaolisme, wat de normale metabolische organen zijn.

In Vivo Tumor Chemotherapie

Vrij PTX-, PLP-¹³¹I-, en FA-PLP-¹³¹I-behandelde muizen vertoonden inhibitie van tumorgroei vergeleken met de zoutoplossing-controlegroep (Fig. 7a). Over het algemeen was FA-PLP-¹³¹I het meest effectief in tumor-groei-onderdrukking zonder recidief vergeleken met alle behandelde groepen na ongeveer 40 dagen behandeling. Deze resultaten zijn zoals verwacht gegeven de significant verlengde bloedsomloop van FA-PLP-¹³¹I en daarom zijn vermogen om FA-gemediaal tumor-gerichte accumulatie te bevorderen. Verder leidde tumor-gerichte accumulatie ook tot een reductie in perifele blootstelling van PTX, waardoor systemische toxiciteit geminimaliseerd werd. Zoals verwacht was er gedurende het complete behandelproces geen opvallende verlies in lichaamsgewicht (Fig. 7b), en de hoofdorganen, inclusief hart, lever, milt, long, en nier, toonden geen duidelijke histologische letsels in enige groep (Fig. 7c).

Conclusies

Samenvattend, we hebben ¹³¹I-gelabelde PLGA-lipide nanodeeltjes gesynthetiseerd als medicijnafleveringsdragers voor melanoom-gerichte chemotherapie. Door de radioactiviteit van ¹³¹I te meten, werden de in vitro en in vivo gedragingen van FA-PLP-¹³¹I nanodeeltjes bestudeerd. De verkregen FA-PLP-¹³¹I toonde grote dispersiteit en colloïdale en radiolabelingsstabiliteit. De controle nanodragers, PL-¹³¹I, en FA-PL-¹³¹I toonden ook goede biocompatibiliteit. Na encapsulatie van PTX, was FA-PLP-¹³¹I het meest effectief in het onderdrukken van B16F10-celproliferatie zonder cytotoxiciteit, toegeschreven aan het FA-targeting-effect. Bovendien werd FA-PLP-¹³¹I aangetoond de bloedsomloop van PTX significant te verlengen en effectief te accumuleren binnen de gerichte tumorregio. Dus had FA-PLP-¹³¹I een uitstekende tumor-groei-inhibitie en grote in vivo biocompatibiliteit. De resultaten benadrukken de veelbelovende potentieel van deze veelzijdige FA-PLP-¹³¹I nanodragers als betrouwbare medicijn-tracking-agenten alsook hun toepassing in tumor-gerichte therapie.