Nieuwe levering van mitoxantron met hydrofoob gemodificeerde pullulan-nanodeeltjes om blaaskankercellen te remmen en het effect van de grootte van nanomedicijnen op de remmingsefficiëntie

Abstract

Het verminderen van de dosering van chemotherapeutische geneesmiddelen door het verbeteren van de afgifte-efficiëntie met behulp van nieuwe nanodeeltjes heeft een groot potentieel voor de behandeling van kanker. Hier hebben we ons gericht op het verbeteren van de afgifte van mitoxantron door het gebruik van cholesterol-gesubstitueerde pullulan-polymeren (CHP's) en hebben we een geschikte nano-medicijngrootte geselecteerd om de groei van blaaskankercellen te remmen. We hebben drie soorten WKK's gesynthetiseerd, genaamd CHP-1, CHP-2, CHP-3. Hun chemische structuren werden geïdentificeerd door NMR en de mate van cholesterolsubstitutie was respectievelijk 6,82%, 5,78% en 2,74%. Hun diameters waren 86,4, 162,30 en 222,28 nm. We hebben de afgiftesnelheid van mitoxantron in fosfaatgebufferde zoutoplossing gedurende 48 uur getest:de afgiftesnelheid was 38,73%, 42,35% en 58,89% voor de drie WKK's. De mate van hydrofobe substitutie in het polymeer was geassocieerd met het zelfassemblageproces van de nanodeeltjes, dat hun grootte en dus de afgiftesnelheid van het geneesmiddel beïnvloedde. De afgifte van de drie met medicijnen beladen nanodeeltjes werd aanzienlijk versneld in zuurafgiftemedia. Hoe groter het nanodeeltje, hoe groter de snelheid van medicijnafgifte. Om 24 uur, de IC₅₀ waarde was 0,25 M, voor de beste remming van mitoxantron op blaaskankercellen.

3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-difenyl-2-H-tetrazoliumbromide (MTT)-experimenten toonden aan dat CHP-3-nanodeeltjes met de grootste grootte met geneesmiddel beladen het meest toxisch waren voor blaaskanker cellen. Immunofluorescentie en flowcytometrie onthulden dat CHP-3-nanodeeltjes met de grootste grootte met geneesmiddel het sterkste effect hadden op het bevorderen van apoptose van blaaskankercellen. Ook zouden de drie met medicijnen beladen nanodeeltjes allemaal de migratie van MB49-cellen kunnen remmen, waarbij grote CHP-3-nanodeeltjes de krachtigste remming hebben.

Achtergrond

Chemotherapie is een veel voorkomende behandeling voor tumoren. Door het ontbreken van weefselspecificiteit is het therapeutisch effect van chemotherapie echter beperkt en heeft het vaak sterke bijwerkingen [1, 2]. Daarom is het onderzoek naar het gebruik van nanodeeltjes (NP)-preparaten om het doelvermogen van chemotherapeutische geneesmiddelen te vergroten toegenomen [3,4,5].

Na passief gericht te zijn op tumorweefsels via het verbeterde permeabiliteit en retentie (EPR)-effect, oefenen nanodrugs zoals NP-geladen kleinmoleculige antitumormiddelen hun werkzaamheid voornamelijk op twee manieren uit:(1) door vrij te komen in tumorweefsels en binnen te dringen in cellen in een vrije vorm om werkzaamheid uit te oefenen en (2) doordat ze door cellen worden opgenomen in de vorm van microdeeltjes en in de cel worden afgegeven om farmacodynamische effecten uit te oefenen [6, 7]. Wanneer een nanofarmaceutisch middel passief op een tumor wordt gericht, welke van de twee methoden een grote rol speelt of beide tegelijkertijd een grote rol spelen en of er nog andere factoren een rol spelen, is een complexe kwestie. Vanwege de metabole activiteit van tumorweefsel, ischemie en hypoxie en de ophoping van melkzuur en omdat extracellulaire vloeistof van tumorweefsel een zwakke zuurgraad vertoont, vertonen veel nanomedicijnen een verhoogde afgifte in zure omgevingen, voor een verbeterde werkzaamheid [8]. De efficiëntie van de geneesmiddelafgifte van nanodrugs in een zure omgeving hangt nauw samen met de fysisch-chemische eigenschappen van nanomaterialen en wordt ook beïnvloed door de grootte van NP's [9,10,11]. Nadat de NP's zich passief op het tumorweefsel richten, omdat de tumorcellen een fagocytosefunctie hebben, komt het nanofarmaceutische preparaat de cellen binnen, voornamelijk via pinocytose en complexe processen die worden gemedieerd door de celmembraaneiwitten [12, 13]. Onder de afbraak van intracellulaire lysozymen geven nanofarmaceutica medicijnen vrij en oefenen ze werkzaamheid uit [14].

De opname-efficiëntie van doelcellen in gericht weefsel hangt nauw samen met de eigenschappen van nanomaterialen, oppervlaktemodificatie, morfologie, lading en NP-grootte [15,16,17,18]. De celopname hangt in grote mate af van de NP-grootte. De internalisatie (endocytose) van Her-gold NP's hangt sterk af van de grootte, de meest effectieve absorptie die optreedt in NP's in het bereik van 25 tot 50 nm [19]. Extreem kleine of grote NP's zullen inefficiënte absorptie hebben. De grootte van 40 tot 50 nm is het kritieke punt voor receptor-gemedieerde endocytose [20]. Bovendien beïnvloedt de NP-grootte de cytotoxiciteit. Bij het vergelijken van NP's van 45 en 90 nm is de grootte van polymere NP's omgekeerd evenredig met cytotoxiciteit [21]. De grootte van NP's beïnvloedt de afgifte van het medicijn in tumorweefsel en ook de opname-efficiëntie van de cellen en speelt uiteindelijk een belangrijke rol in de werkzaamheid van het medicijn.

De lokale adhesie van polysachariden verbetert de lokalisatie- en targetingfunctie. De zure omgeving van externe kankercellen leidt tot een gedeeltelijke afgifte van polysacharide-nanomedicijnen, wat het dubbele therapeutische effect veroorzaakt van met medicijnen beladen NP's en vrije medicijnen na passieve targeting van tumorweefsels [22, 23].

Pullulan, dat niet-toxisch is, wordt gemakkelijk in het lichaam afgebroken en het cholesterol is een intrinsieke stof in het lichaam, dus het is veilig en geschikt als drager voor medicijnen [24, 25]. Cholesteryl hydrofoob gemodificeerde pullulan (CHP) polymeren, die hydrofobe cholesterylgroepen en hydrofiele suikerketens hebben, kunnen zichzelf assembleren tot nanosfeerachtige structuren met hydrofobe centrale kernen en hydrofiele schillen [26, 27]. Amfifiele polymeren assembleren zichzelf tot NP's in sferoïde structuren, waarbij de hydrofobe kern wordt gevormd door hydrofobe groepen zoals cholesterylgroepen [28].

Mitoxantron, een actief antikanker-antibioticum tegen kanker dat DNA kan intercaleren en topoisomerase II kan remmen, is een klassiek antitumormiddel. Vanwege de cardiotoxiciteit is het gebruik van mitoxantron echter beperkt. Mitoxantron wordt door hydrofobe interactie op het hydrofobe centrum van CHP-NP's geladen om CHP-nanometerpreparaten te vormen die een passief richtend effect hebben via het EPR-effect. Vergeleken met gratis medicijnen, vertonen medicijngeladen CHP NP's verminderde toxische effecten van medicijnen en verhoogde efficiëntie tegen kanker [29, 30]. De hydrofobe groep cholesteryl in het CHP-polymeer drijft de vorming van de kernstructuur van de NP aan, en binnen een bepaald bereik, hoe hoger de substitutiegraad van de hydrofobe groep, hoe kleiner de grootte van de NP [31, 32]. De stabiliteit van WKK's was superieur ten minste 2 maanden zonder significante veranderingen in grootte en zetapotentieel, en pullulan-nanodeeltjes kunnen zich richten op tumorweefsel om kankercellen te doden door EPR-effect [33, 34].

In deze studie gebruikten we pullulan (CHP) NP's hydrofoob gemodificeerd met cholesterol als antitumormiddeldragers om mitoxantron te laden. Verschillende maten van met mitoxantron beladen pullulan NP's werden gegenereerd door CHP-polymeren te synthetiseren in verschillende barnsteenzuuranhydride cholesterolester (CHS) ladingsverhoudingen om het effect van NP-grootte op aanhoudende afgifte van een geneesmiddel, geneesmiddelafgifte in een zure omgeving, toxiciteit voor blaaskanker te bestuderen cellen, celopname-efficiëntie en celmigratie. Dit experiment evalueerde het groottebereik van NP's met passieve targeting om een geschikte NP als medicijndrager te screenen en voor een sterkere medicijnefficiëntie.

Materialen en methoden

Reagentia en instrumenten

Mitoxantron was van Aladdin Chemistry (Shanghai); de dialysezak (BioSharp, VS, 8000 ~ 12.000 Da) was van Tianjin Junyao Biotechnology. Andere reagentia waren van Beijing Xinze Technology.

We gebruikten de Japan F-4500 fluorescentiespectrofotometer, J-810 circulaire dichroïsme-chromatograaf (Jasco Co., Japan), deeltjesgrootte-analysator (MALVERN, Nano 2S-90, Japan) en een projectie-elektronenmicroscoop (JEM-100CXII, Japan) .

Synthese en karakterisering van CHP-polymeer en berekening van de mate van substitutie van cholesterol

De synthese van barnsteenzuuranhydride CHS werd eerder gerapporteerd [35]. Een hoeveelheid van 0,5 g pullulanmonster werd voor reserve opgelost in 15 ml gedehydrateerd dimethylsulfoxide. CHS (suikereenheid/CHS = 0,20, 0,15, 0,05 mmol/mmol), 4-dimethylpyridine (DMAP∕CHS = 1 mmol/mmol) en 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimidehydrochloride (EDC∕ CHS =-1,2 mmol/mmol) werden afzonderlijk opgelost in 10 ml DMSO, bij kamertemperatuur geroerd en gedurende 1 uur geactiveerd; de activeringsreactie werd in de pullulan-oplossing gedruppeld; en de reactie werd na 48 uur gestopt. De reactie werd in 200 ml absolute ethanol gedruppeld en er vormde zich een wit neerslag. Er werd gefiltreerd door afzuiging en het product werd gewassen met geschikte hoeveelheden ethanol, tetrahydrofuran en diethylether en vervolgens gedroogd bij 80°C. Er werden drie soorten CHP-polymeren met verschillende graden van cholesterolsubstitutie verkregen:CHP-1, CHP-2 en CHP-3 [36]. Pullulan-polysaccharide en CHP-polymeer 10-20 mg werden opgelost door DMSO-d6 onder ultrasone omstandigheden en ¹ H NMR-spectra werden onderzocht. De substitutiegraad van cholesterol in het CHP-polymeer werd bepaald op basis van de α-1,4 en α-1,6 glycosidebindingen en het gebied onder de methyleenpiek.

Bereiding en karakterisering van met geneesmiddelen geladen WKK-NP's

Synthese van met mitoxantron beladen WKK NP's zoals beschreven [37, 38], met geneesmiddel beladen NP's werden verkregen door dialyse met 40 mg van elk van de drie CHP NP's vervangen door verschillende graden cholesterol en 4 mg mitoxantron als back-up. De nieuw bereide met geneesmiddel beladen NP's of met geneesmiddel beladen NP's gedispergeerd in gedestilleerd water na lyofilisatie werden op een koperen rooster gedruppeld met een koolstoffilm en het filterpapier werd uitgelekt. Roosters werden in een exsiccator geplaatst, vervolgens 2% (w /w ) fosfowolfraamzuur (2%) werd toegevoegd, dat negatief was na natuurlijk drogen, en waargenomen door transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) [38]. De oplossing van nieuw bereide met geneesmiddel beladen NP's of met geneesmiddel beladen NP's gedispergeerd in gedestilleerd water na lyofilisatie werd in cuvetten gegoten en voor detectie in een deeltjesgrootte-analysator geplaatst. Elk monster werd drie keer verwerkt om een even groot en even potentieel NP's te verkrijgen.

Meting van de efficiëntie van het laden en inkapselen van geneesmiddelen van met geneesmiddelen geladen CHP-NP's

Het gehalte aan geneesmiddellading (LC%) en inkapselingsefficiëntie (EE%) van met mitoxantron beladen CHP NP's werden als volgt gemeten zoals beschreven [31, 39]:

$$ \mathrm{EE}=\frac{\mathrm{De}\ \mathrm{bedrag}\ \mathrm{van}\ \mathrm{drug}\ \mathrm{in}\ \mathrm{de}\ \mathrm{ NPs}}{\mathrm{Totaal}\ \mathrm{bedrag}\ \mathrm{of}\ \mathrm{Drug}} $$ $$ \mathrm{LC}=\frac{\mathrm{The}\ \mathrm{ hoeveelheid}\ \mathrm{van}\ \mathrm{Drug}\ \mathrm{in}\ \mathrm{de}\ \mathrm{NPs}}{\mathrm{De}\ \mathrm{bedrag}\ \mathrm{van }\ \mathrm{NP's}\ \mathrm{gewicht}} $$

Onderzoek naar geneesmiddelafgifte

De drie soorten met mitoxantron beladen NP's werden in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en in afgiftemedia met pH-=-6,8 en 4,0 geplaatst. De afgifte van mitoxantron werd in vitro bestudeerd door middel van dialyse en het geaccumuleerde afgiftepercentage (Q%) werd berekend zoals beschreven [40].

Cellijnen en cultuurvoorwaarden

De muizenblaaskankercellijn MB49 geleverd door Dr. P Guo (Institute of Urology, Xi'an Jiaotong University, Xi'an, Shaanxi, China) werd gekweekt in DMEM (Lonza) aangevuld met 10% foetaal runderserum (Hyclone, Logan , UT, VS) en 1% penicilline-streptomycine bij 37 °C in bevochtigde lucht met 5% CO₂ .

Cell Viability Assay

De levensvatbaarheid van de cellen werd beoordeeld door middel van een op tetrazolium gebaseerde test. In het kort, cellen werden gezaaid bij 2 × 10⁴ per putje in kweekplaten met 96 putjes en men liet ze 24 uur hechten. Aan het begin van de experimenten werden verschillende zaaidichtheden geoptimaliseerd. Cellen werden 24 uur in een incubator behandeld met verschillende concentraties mitoxantron. Mitoxantron bij 0,0078, 0,0156, 0,03125, 0,0625, 0,125, 0,25, 0,5 en 1 M werd opgelost in DMEM aangevuld met 1% foetaal runderserum. Een hoeveelheid van 50 μL MTT-tetrazoliumzout (Sigma) opgelost in Hank's uitgebalanceerde oplossing van 2 mg/ml werd aan elk putje toegevoegd met de aangegeven behandeling en geïncubeerd in een CO₂ broedstoof gedurende 5 uur. Ten slotte werd het medium uit elk putje opgezogen en werd 150 L DMSO (Sigma) toegevoegd om formazankristallen op te lossen. De absorptie van elk putje werd verkregen met behulp van een Dynatech MR5000-plaatlezer bij een testgolflengte van 490 nm en een referentiegolflengte van 630 nm.

IC₅₀ waarden voor mitoxantron werden bepaald door dosis-responscurven. De drie concentraties van NP's (0,0625, 0,125, 0,25 μM) met drie substitutiegraden werden vergeleken met MTT. De experimentele procedure was dezelfde als voor mitoxantron.

Beoordeling van apoptose

De celapoptotische snelheid werd bepaald door flowcytometrie met annexine V-FITC/propidiumjodide (PI). In het kort, behandelde cellen werden tweemaal gewassen met koude PBS en vervolgens opnieuw gesuspendeerd in bindingsbuffer bij 2 × 10⁶ cellen/ml volgens de instructies van de fabrikant. Vervolgens werden 5 L Annexine V-FITC en 5 μM PI toegevoegd aan een celsuspensie van 100 L en gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in het donker geïncubeerd. Na toevoeging van 300 μL bindingsbuffer werden gelabelde cellen binnen 1 uur gedetecteerd met flowcytometrie.

Alle vroege apoptotische cellen (Annexin V-FITC-positief [groen gekleurd], PI-negatief), necrotische cellen (Annexin V-FITC-negatief, PI-positief), late apoptotische cellen (dubbel positief), evenals levende cellen ( dubbel negatief) werden gedetecteerd met flowcytometrie (FCM) en geanalyseerd met behulp van Cell Quest-software (Becton Dickinson). De excitatiegolflengte van de argonlaser was 488 nm en de emissiegolflengte 530 nm (FL-1-kanaal) voor fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC) en 670 nm (FL-3 c3-kanaal) voor PI. Ook werd apoptose onderzocht met fluorescentiemicroscopie. Ten eerste 1,0 × 10⁵ cellen werden gezaaid in kweekplaten met 96 putjes en na 24 uur werden cellen behandeld zoals hierboven, vervolgens 24 uur later werden 100 μL bindingsbuffer, 1 μL Annexine V-FITC en 1 μLPI toegevoegd aan cellen bij kamertemperatuur in het donker gedurende 15 min, op een lage temperatuur gehouden en geobserveerd met fluorescentiemicroscopie.

Cell Migration Assay

In totaal 8 × 10⁵ cellen werden gezaaid in platen met zes putjes en men liet ze volledige samenvloeiing bereiken. De monolaag werd verwond met behulp van een cocktailprikker. Cellen werden zoals aangegeven geïncubeerd met serumvrij DMEM. Digitale afbeeldingen zijn gemaakt om 0, 6, 12, 24 en 48 uur. Het gemiddelde gebied werd berekend met behulp van afbeelding J en experimenten werden drie keer herhaald.

Resultaten en discussie

CHP-conjugaten en mate van substitutie van cholesterol

De ¹ H NMR-waarde voor CHP (DMSO-d6 met TMS, ppm) was 2,53 ppm (2 methyleengroepen, –OCH₂ CH₂ O-). Afbeelding 1 toont ¹ H NMR-spectra, wat bevestigt dat cholesterol chemisch gebonden was aan de lange pullulan-keten via een barnsteenzuur spacer-arm. De spectra voor de drie CHP NP's gesynthetiseerd bij verschillende voedingsverhoudingen (a, b, c) vertoonden de karakteristieke pieken van pullulan; α-1-4 en α-1,6 glycosidische bindingen waren ∂_4,68 (1Hα_1–6 ), ∂_5,05 (1Hα_1-4 ), en ∂_2,53 (2 methyleengroepen, –OCH₂ CH₂ O–), respectievelijk, die ook gemakkelijk te onderscheiden was. Nieuwe karakteristieke pieken verschenen bij 0,40 tot 2,40 (waterstof op het cholesterische skelet), wat bevestigde dat de drie CHP-polymeren met succes werden gesynthetiseerd. Het gebied onder de piek geeft het aantal atomen weer en de mate van cholesterische substitutie kan als volgt worden berekend [41]:

NMR-spectra voor CHP-1 (a ), CHP-2 (b ), en CHP-3 (c )

$$ \mathrm{DS}=\frac{A_{\partial 2.53}}{4\left({A}_{\partial 4.68}+{A}_{\partial 5.05}\right)}\times 100\ % $$

waarbij de som van A _∂4.68 en A _∂5.05 staat voor het aantal suikereenheden, A_{∂ 2,53} is het aantal waterstofatomen in –OCH₂ CH₂ O– van het cholesterylbarnsteenzuur, en A_{∂ 2,53} /4 is het aantal –OCH₂ CH₂ O–, dat wil zeggen het aantal cholesterolen in barnsteenzuuranhydride CHS. De bovenstaande formule stelt dus de mate van cholesterische substitutie in het CHP-molecuul voor als het aantal cholesterylgroepen per 100 glucose-eenheden. De berekende voederverhoudingen en molaire verhoudingen van cholesteryl- en pullulansuikereenheden waren respectievelijk 1/5, 3/20 en 1/20, en de substitutiegraad van de drie gesynthetiseerde CHP-1, CHP-2 en CHP-3. polymeren was respectievelijk 6,82%, 5,78% en 2,74%. De mate van substitutie van cholesterol op de pullulanketen nam toe met toenemende voerverhouding. De werkelijke substitutiegraad was echter lager dan beide voerverhoudingen.

De pullulan-keten kan bestaan als een flexibele, opgerolde keten in het oplosmiddel, en na de toevoeging van een bepaalde hoeveelheid cholesterol vertoont de geënte cholesterol een grotere moleculaire sterische hinder, die de verdere directe veresteringsreactie van succinylcholesterol en de hydroxylgroep beïnvloedt op de pullulan-ketting. De moeilijkheidsgraad van de reactie was aanzienlijk toegenomen, dus de substitutiegraad werd kleiner.

Drug-geladen CHP NP's en hun grootte

De afmetingen van de drie blanco WKK NP's voor CHP-1, CHP-2 en CHP-3 waren 79,1, 104,9 en 166,8 nm. Bij een zekere mate van substitutie werd de hydrofobiciteit versterkt met toenemende mate van substitutie van cholesterol. Hoe sterker de hydrofobiciteit, hoe beter de WKK zelf-geaggregeerde NP's een compactere hydrofobe kern vormden, waardoor de NP's kleiner werden [42]. Figuur 2 toont de grootte van met medicijnen beladen WKK NP's. De deeltjesgrootten voor CHP-1, CHP-2 en CHP-3 waren respectievelijk 86,4, 162,30 en 222,28 nm. In dezelfde verhouding van geneesmiddelen en materialen was de deeltjesgrootte van het met geneesmiddel beladen NP met een hoge mate van substitutie van de hydrofobe polymeergroep klein, maar de deeltjesdiameter van het met geneesmiddel beladen NP was groter dan het niet-ingekapselde geneesmiddel -bevattende blanco NP met dezelfde substitutiegraad. Naarmate mitoxantron de hydrofobe kern binnendringt, neemt de deeltjesgrootte van de NP's toe. In figuur 2d is de zeta-potentiaal van de met geneesmiddel beladen WKK NP's -1,12 mV. Fig. 2e is een TEM-afbeelding die laat zien dat de met medicijnen beladen NP's bolvormig zijn.

Afbeeldingen van NP-formaat geladen met mitoxantron (CHP-1 (a ), CHP-2 (b ), CHP-3 (c )), mogelijke afbeeldingen (CHP-2 (d )) en TEM-afbeeldingen (CHP-2 (e ))

Drugafgifte van met medicijnen geladen NP's van verschillende grootte en onder verschillende zure media

Wanneer de geneesmiddel- en CHP-polymeerverhoudingen hetzelfde waren, waren de geneesmiddelbelading en insluitingsefficiëntie van de met geneesmiddel beladen CHP-1, CHP-2 en CHP-3 NP's 8,17% en 88,92%; 7,62% en 82,28%; en respectievelijk 4,83% en 50,67%. Hoe hoger de cholesterische hydrofobe substitutie in het CHP-polymeer, hoe kleiner de gevormde deeltjesgrootte en hoe hoger de efficiëntie van de geneesmiddelbelading en insluiting. Afbeelding 3 toont de geneesmiddelafgifteprofielen voor de drie met geneesmiddel beladen WKK NP's. In PBS werd het medicijn 48 uur vrijgegeven. De afgiftesnelheden voor CHP-1, CHP-2 en CHP-3 waren respectievelijk 38,73%, 42,35% en 58,89%. Alle drie de NP's vertoonden eigenschappen voor langdurige afgifte, maar hoe kleiner de NP-grootte, hoe sterker de hydrofobiciteit en hoe langzamer de geneesmiddelafgifte. Bij pH 6,8 waren de geneesmiddelafgiftesnelheden voor CHP-1, CHP-2 en CHP-3 respectievelijk 43,82%, 49,48% en 64,18%. In zwak zure omstandigheden gaven WKK NP's het medicijn duurzaam af, maar de afgiftesnelheid nam aanzienlijk toe. Bij pH 4,0, na 48 uur geneesmiddelafgifte, waren de geneesmiddelafgiftepercentages voor CHP-1, CHP-2 en CHP-3 respectievelijk 51,25%, 56,23% en 75,46%. De afgifte van het CHP NP-medicijn was significant sneller bij een lagere pH, vooral voor CHP-3 NP, de grootste van de drie CHP NP's.

Mitoxantrone (MTO) afgifte uit pullulan NP's in fosfaatgebufferde zoutoplossing (zwart vierkant:CHP-1, witte cirkel:CHP-2, zwarte naar beneden wijzende driehoek:CHP-3), in pH 6,8 (witte naar boven wijzende driehoek:CHP- 1, zwarte ruit:CHP-2, wit vierkant:CHP-3) en in pH 4,0 (zwarte driehoek:CHP-1, witte ruit:CHP-2, zwarte cirkel:CHP-3) bij 37 °C in vitro

Cytotoxiciteit van met mitoxantron geladen WKK NP's

Op MTT-assay (Fig. 4), de IC₅₀ waarden voor mitoxantron voor het remmen van de groei van blaaskankercellen waren respectievelijk 0,25, 0,20 en 0,06 μM na 24, 48 en 72 uur (tabel 1). We beschouwden 24 uur als de doseertijd.

Effect van behandeling met mitoxantron en NP's op celproliferatie van blaaskankercellijn MB49. De levensvatbaarheid van de cellen werd beoordeeld door middel van een op tetrazolium gebaseerde test met een behandeling van 24, 48 en 72 uur met mitoxantron en nanomedicijnen van 0 tot 0,5 μg/ml op de muizenblaaskankercellijn MB49

Omdat de concentratie van vrij mitoxantron en mitoxantron-CHP NP's hetzelfde is bij dezelfde toediening, laten de resultaten van MTT-experimenten in Fig. 5 zien dat de vrije mitoxantronconcentratie giftiger was voor blaaskankercellen dan mitoxantron-CHP NP's. Bij het vergelijken van de mitoxantron-CHP-NP's met de drie cholesterolsubstitutiegraden, was het krachtigste cytotoxische effect CHP-3, gevolgd door CHP-2, en het zwakste was CHP-1.

Cytotoxiciteit van vrij mitoxantron en met mitoxantron geladen WKK-NP's na 24 uur (blauw vierkant:mitoxantron, roze cirkel:CHP-1, groene driehoek:CHP-2, rode naar beneden wijzende driehoek:CHP-3)

Hoewel de toxische effecten van verschillende concentraties mitoxantron-CHP NP's op blaaskankercellen vergelijkbaar waren, vooral CHP-2 en CHP-3, was het effect van CHP-1 significant verminderd. Elke concentratie van CHP-1 vertoonde dit fenomeen. Dus hoe groter de mitoxantron-CHP NP-grootte, hoe sterker de cytotoxiciteit.

Het therapeutische effect van NP's bestaat uit twee delen:(1) de cellulaire opname van NP's en (2) NP's die buiten de cel worden afgegeven en medicijnen die vrij de cellen binnenkomen om hun werkzaamheid uit te oefenen. Omdat vrij mitoxantron een sterker effect heeft dan mitoxantron-CHP NP's, had CHP-3 een sterker therapeutisch effect dan de andere twee CHP NP's bij dezelfde medicijndosis. De afgifte van CHP-3 was het snelst en het therapeutische effect van CHP NP's was voornamelijk afhankelijk van de toxiciteit van het vrije mitoxantron in cellen na afgifte van het nanofarmaceutische preparaat.

Celapoptose van mitoxantron-CHP NP's

We gebruikten immunofluorescentie en flowcytometrie om het effect van dezelfde concentratie van 0, 2 μg / ml mitoxantron en de drie met geneesmiddelen beladen CHP-NP's op apoptose van MB49-cellen te vergelijken. Vrij mitoxantron was sterker voor apoptose dan de drie mitoxantron-CHP-NP's (figuur 6). CHP-3 had echter het krachtigste effect en het zwakste was CHP-1. De eerdere MTT-resultaten werden verder bevestigd.

Apoptose van mitoxantron en nanodrugs om 24 uur op MB49-blaaskankercellen(a DMSO, b mitoxantron, c CHP-3, d CHP-2, e CHP-1):A. Annexine V-FITC/PI dubbele kleuring werd gedetecteerd door fluorescentiemicroscopie, vroege apoptotische cellen vertoonden Annexine V-FITC-positieve kleuring (groen), necrotische cellen waren PI-positief (rood) en late apoptotische cellen toonde positieve dubbele kleuring (geel). B. Apoptotische snelheid werd bepaald door FCM. Levende cel (Q3), vroege apoptotische snelheid (Q4), late apoptotische snelheid (Q2), necrotische cellen (Q1). Hoe groter de celkleuring, hoe hoger de apoptotische snelheid

Celmigratie van met mitoxantron geladen WKK NP's

Het 24- en 48-uurs vermogen van vrij mitoxantron en de drie CHP-NP's om MB49-celmigratie te remmen werd waargenomen in vergelijking met controles (Fig. 7). De migratieremming was niet significant sterker voor vrij mitoxantron dan de drie CHP NP's. Op MTT-assay en apoptose-test was de migratieremming sterker voor het vrije medicijn dan de drie CHP NP's, voornamelijk omdat het vrije medicijn gemakkelijker cellen binnendrong om kankercellen te doden. Ook in het celmigratie-experiment kan het vrije medicijn celmigratie efficiënter remmen dan CHP-nanofarmaceutica, wat mogelijk te wijten is aan het feit dat sommige CHP-nanofarmaceutica niet tussen cellen worden gefagocyteerd, wat resulteert in migratieresistentie van kankercellen. Bovendien verschilden de drie WKK-NP's niet in het remmen van de migratie van kankercellen, dus de sterische resistentie die door de NP's werd gevormd, speelde een belangrijke rol bij celmigratie. Daarom remmen met medicijnen beladen CHPNP's kankercellen op twee manieren:(1) de extracellulaire afgifte is de dominante manier, waarbij nanodrugs de medicijnen buiten de cellen afgeven en kankercellen doden als vrije medicijnen, waarbij CHP-3 NP's giftiger zijn dan de andere CHP NP's, en (2) CHP NP's buiten kankercellen creëren sterische resistentie, waardoor de migratie van kankercellen wordt geblokkeerd.

Alleen mitoxantron en mitoxantron-geladen CHP NP's vertoonden verminderde migratie bij wondgenezingsassays. een DMSO, b mitoxantron, c CHP-3, d CHP-2, e WKK-1. Afbeeldingen toonden de opening van het bekraste gebied op verschillende tijdstippen; A₀ , A₂₄ , en A₄₈ vertegenwoordigen respectievelijk 0, 24 en 48 uur DMSO-behandeling

Het doel van deze studie was om WKK-NP's van geschikte grootte te screenen als dragers van geneesmiddelen en om experimenteel bewijs te leveren voor de therapeutische werking van WKK-NP's. We hebben drie soorten sterol-gesubstitueerde pullulan-polymeren (CHP's), CHP-1, CHP-2 en CHP-3 gesynthetiseerd, met een mate van cholesterolsubstitutie van respectievelijk 6,82%, 5,78%, 2,74% en een diameter van 86,4, 162,30 en 222,28. nm. De geneesmiddelafgiftesnelheid van drie soorten mitoxantron-CHP NP's gedurende 48 uur was respectievelijk 38,73%, 42,35% en 58,89%. De hydrofobe substitutiegraad in het polymeer was geassocieerd met het zelfassemblageproces van de NP's, wat hun grootte en dus de afgiftesnelheid van het geneesmiddel beïnvloedde. In zure afgiftemedia werd de afgifte aanzienlijk versneld. Hoe groter de NP, hoe groter de snelheid van geneesmiddelafgifte. Om 24 uur, de IC₅₀ waarde was 0,25 M, voor het beste remmende effect van mitoxantron op de groei van blaaskankercellen. Met geneesmiddel beladen CHP-3 NP's met de grootste grootte waren het meest toxisch voor blaaskankercellen en CHP-3 NP's hadden het sterkste effect op het bevorderen van apoptose van de cellen. Alle NP's konden de migratie van MB49-cellen remmen, maar grote CHP-3 NP's hadden de krachtigste remming.

Amfifiele polymeren kunnen zichzelf assembleren tot NP's in waterige oplossingen; voorbeelden zijn de polysachariden pullulan en chitosan, die kunnen worden gemodificeerd tot amfifiele polymeren door hydrofobe modificatie van kleine moleculen en zelf-geassembleerd tot bolvormige NP's in waterige oplossingen met hydrofobe groepen als de kern en hydrofiele suikerketenschillen [43, 44]. Tijdens zelfassemblage zijn hydrofobe groepen de drijvende kracht voor de vorming van NP's en de sleutel tot de vorming van hun schaal en kernstructuur. De eigenschappen en het molecuulgewicht van hydrofiele groepen hebben ook een belangrijk effect op de vorming en grootte van NP's [45, 46]. Wanneer hetzelfde polymeer wordt gemodificeerd met een kleine fractie van een hydrofobe groep, moet de mate van hydrofobe substitutie matig zijn, en alleen binnen een bepaald bereik kan de hydrofobe substitutie zelf worden geassembleerd tot NP's. Als de mate van hydrofobe substitutie te hoog is, is de hydrofobiciteit van het polymeer te sterk, wat niet bevorderlijk is voor zelfassemblage. Als de hydrofobe substitutie te laag is, is de hydrofobe drijvende kracht te klein om NP's te vormen [47].

In deze studie hebben we met succes drie soorten CHP-polymeren gesynthetiseerd met verschillende gradaties van substitutie van cholesterol door een geschikte voederverhouding te ontwerpen, en ze konden allemaal zichzelf assembleren tot NP's van een bepaalde grootte. Tijdens zelfassemblage van CHP-polymeren kunnen hydrofobe geneesmiddelen zoals mitoxantron worden ingebed in het hydrofobe centrum van NP's om met geneesmiddel beladen NP's te vormen (figuur 8). De grootte van met medicijnen beladen NP's is gerelateerd aan de substitutiegraad van polymeer CHP:hoe hoger de substitutiegraad, hoe kleiner de grootte. De mate van substitutie van polymeren heeft ook invloed op de hoeveelheid geneesmiddel die na zelfassemblage in NP's wordt geladen. Wanneer de verhouding van polymeer tot medicijn hetzelfde is, hoe hoger de substitutiegraad, hoe groter de medicijnbelasting [48]. Ook beïnvloedt de verhouding van polymeer tot medicijn de inkapselingsefficiëntie en medicijnbelading. Alleen wanneer de toevoerverhouding in het juiste bereik is, zal de efficiëntie van de medicijnbelading en inkapseling relatief hoog zijn [31]. Geneesmiddelafgifte van NP's heeft een directe invloed op hun therapeutische effecten, die nauw verband houden met de soorten nanomaterialen, de oppervlaktelading en hydrofobe groep van NP's, de pH-waarde van vrijkomende media en de adsorptie van het eiwit humaan serumalbumine (HSA) in vivo [49, 50]. De geneesmiddelafgifte van met mitoxantron beladen CHP NP's vertoonde een langzame afgifte. De geneesmiddelafgifte van WKK NP's met een grote omvang was sneller en die van NP's in een zure omgeving was sneller. De geneesmiddelafgiftesnelheid van grotere NP's was duidelijker en sneller.

De zelfassemblage van met mitoxantron geladen WKK-nanodeeltjes (NP's)

Kankerchemotherapie is momenteel de belangrijkste manier om kanker te behandelen, maar de chemotherapiemedicijnen zijn niet weefselspecifiek en toxisch voor normale weefsels, en sommige veroorzaken grote schade aan immuuncellen, wat het algehele behandelingseffect schaadt [51, 52]. Nanogeneeskunde kan zich passief richten op kankerweefsels via het EPR-effect, waardoor de afzetting van geneesmiddelen in niet-doelweefsels wordt verminderd en de toxiciteit en bijwerkingen worden verminderd. In deze studie gebruikten we blaaskankercellen als modelkankercellen en bespreken we de effecten van NP's en NP's op blaaskanker. Het antitumoreffect was sterker voor vrij mitoxantron dan voor WKK-NP's; als het hele geneesmiddel echter wordt gegeven, is mitoxantron niet weefselspecifiek. De afzetting en verspilling van weefsels en de toxiciteit en bijwerkingen veroorzaakt door deze medicijnen zullen niet zo effectief zijn als behandelingen met nanomedicijnen. Daarom waren de toxische effecten op kankercellen en de remming van celmigratie beter met het vrije medicijn dan met medicijn beladen NP's, wat niet aangeeft dat het algehele therapeutische effect van CHP-nanometers niet zo goed is als dat van vrij mitoxantron. We wijzen op het effect van hydrofobe substitutiegraad op de grootte van geneesmiddelen op nanoschaal en op het effect van nanogrootte op het laden van geneesmiddelen, geneesmiddelafgifte, cytotoxiciteit en migratie van kankercellen. Nadat de NP's passief zijn gericht op kankerweefsel via het EPR-effect, wordt de therapeutische effectiviteit van met medicijnen beladen NP's voornamelijk afgeleid van de afgifte van medicijnen in het weefsel en de afgifte van NP's aan cellen (Fig. 9). Het therapeutische effect van WKK NP's is of de extracellulaire of intracellulaire afgifte de dominante rol speelt. Uit de celexperimenten blijkt dat de grootte van WKK NP's een sterk effect heeft:bij grote afmetingen komen er meer medicijnen vrij, maar de hoeveelheid van het medicijn is hetzelfde. Daarom kan het therapeutische effect van CHP-NP's voornamelijk afhangen van de afgifte in het weefsel in plaats van celopname.

De werkzaamheid van de behandeling van met mitoxantron beladen WKK NP's door voornamelijk locatieafgifte in tumorweefsel

Veel klassieke NP's worden gebruikt als medicijndragers en de WKK-NP's die we hebben voorbereid, zijn superieur aan andere. Biogenetische NP's (zoals exosoom, extracellulaire blaasjes-mimetische, gemodulariseerde extracellulaire blaasjes) zijn bijvoorbeeld moeilijk te bereiden [53]. De doelverdeling van gewone liposomen is niet ideaal en de instabiliteit ervan is nog steeds een probleem [54]. Anorganische NP's zoals quantum dot NP's zijn zeer stabiel, maar als vreemd materiaal is hun biocompatibiliteit slecht, wat bijwerkingen voor mensen kan veroorzaken [55]. WKK NP's zijn gemakkelijk te bereiden en we kunnen hun grootte regelen door de mate van hydrofobe substitutie te regelen [48]. Omdat ze in vivo direct door amylase kunnen worden afgebroken, hebben ze een goede biocompatibiliteit [56]. Bovendien hebben WKK-NP's een goede stabiliteit en uitstekende eigenschappen voor geneesmiddelafgifte [57]. Het nadeel is dat ze onvermijdelijk gedeeltelijk zullen worden ingeslikt door het mononucleaire fagocytische systeem [58]. Er is meer onderzoek nodig om de verwijdering door het systeem te verminderen en de effectieve bloedconcentratie van NP's te verbeteren.

Conclusie

De grootte van met mitoxantron beladen CHP NP's is gerelateerd aan de mate van cholesterolsubstitutie in het polymeer. Hoe hoger de substitutiegraad van hydrofobiciteit, hoe kleiner de grootte en hoe groter de efficiëntie van het laden en inkapselen van het geneesmiddel, en hoe langzamer de geneesmiddelafgifte. Onder zure omstandigheden, hoe sterker de zuurgraad, hoe sneller de afgifte van WKK NP's. Bovendien is de afgifte van NP's met een grotere omvang het beste en kunnen grotere NP's de groei van blaascellen en hun migratie beter remmen dan kleinere NP's. CHP NP's doden kankercellen voornamelijk door de afgifte van medicijnen op nanoschaal buiten de cel.

Theoretisch systeem van contact-mode tribo-elektrische nanogeneratoren voor een hoge energieconversie-efficiëntie Voorbereiding en elektrochemische eigenschappen van granaatappelvormige Fe2O3/C-anoden voor Li-ionbatterijen

Nanomaterialen

Metaal

Hars

vezel

Samengesteld materiaal