Fe(II) en met looizuur gehulde MOF als drager van artemisinine voor de toevoer van ijzerionen om de behandeling van triple-negatieve borstkanker te verbeteren

Abstract

Onderdrukking van tumorontwikkeling door het induceren van ferroptosis kan een mogelijke remedie bieden voor triple-negatieve borstkanker, die gevoelig is voor intracellulaire oxidatieve onbalans. Onlangs zijn artemisinine (ART) en zijn derivaten onderzocht als potentiële antikankermiddelen voor de behandeling van zeer agressieve kankers via de inductie van ferroptose door ijzer-gemedieerde splitsing van de endoperoxidebrug. Vanwege de slechte oplosbaarheid in water en het beperkte intracellulaire ijzergehalte is het een uitdaging voor verdere toepassing in antitumortherapie. Hierin hebben we ferro-supply nano-carrier voor ART ontwikkeld op basis van looizuur (TA) en ferro-ion (Fe(II)) gecoat op het zeolietimidazolaatraamwerk-8 (ZIF) met ingekapselde ART (TA-Fe/ART@ZIF ) via coördinatiegestuurde zelfassemblage. Experimenten met geneesmiddelafgifte toonden aan dat ART bijna niet werd afgegeven bij pH 7,4, terwijl 59% ART na 10 uur werd afgegeven bij pH 5,0, wat de uitstekende door pH veroorzaakte afgifte aantoont. Ondertussen vertoonde een hoog niveau van intracellulaire ROS en MDA, vergezeld van afnemende GSH en GPX4, een nieuw ontwikkeld nanodrugssysteem dat duidelijk verbeterde ferroptosis vertoonde. Vergeleken met monotherapie toonden in vitro en vivo tumorremmingsexperimenten een hogere efficiëntie van tumorsuppressie van TA-Fe/ART@ZIF aan. Dit werk biedt een nieuwe benadering om de potentie van ferroptotische nanogeneeskunde en nieuwe richtingen voor TBNC-therapie te verbeteren.

Inleiding

Ferroptose, een nieuw ontdekt subtype van celdood, zou kunnen leiden tot accumulatie van ijzerafhankelijke lipide hydroperoxiden (LPO), wat leidt tot schade aan de celstructuur en integriteit [1,2,3]. Opkomend bewijs impliceerde dat de activering van ferroptosis door verschillende kleine moleculen een effectieve benadering is voor tumoronderdrukking in verschillende experimentele kankermodellen en wekte hoge verwachtingen van het potentieel van ferroptosis als een nieuwe antikankertherapie [4,5,6]. Triple-negatieve borstkanker (TNBC) is het meest agressieve subtype van borstkanker zonder gerichte therapieën en wordt vaak geassocieerd met tumorrecidief, metastasen op afstand en therapieresistentie [7]. Eerdere studies hebben aangetoond dat xCT cystine/glutamaat antiporter in hoge mate tot expressie wordt gebracht in tal van TNBC-cellen, en een belangrijke rol spelen bij het handhaven van de glutathion (GSH)-niveaus en redox-balans [8]. Verlaging van het intracellulaire GSH-gehalte kan TNBC-cellen gevoelig maken voor ferroptose, waardoor tumorcellen worden gedood [8]. Met name kan ferroptose ook de weerstand van TNBC tegen routinematig geprogrammeerde apoptose omzeilen [9]. Daarom kunnen strategieën of geneesmiddelen die gebaseerd zijn op het induceren van ferroptose therapeutisch potentieel hebben voor de klinische behandeling van refractaire TNBC.

Artemisinine (ART), een sesquiterpeenlacton dat een peroxidegroep bevat, werd geïsoleerd uit de traditionele Chinese plant Artemisia annua en heeft een gewenste antitumoractiviteit aangetoond in meerdere kankercellijnen [10, 11]. Toenemend bewijs toonde aan dat kankercellen significant meer intracellulaire ijzerpool bevatten dan normale cellen, terwijl door ijzer gemedieerde splitsing van de endoperoxidebrug ART in staat stelt selectief celdood te veroorzaken in meerdere kankercellijnen [12, 13]. De van ijzerionen afhankelijke antitumoractiviteit heeft een toenemende aandacht getrokken voor ART-gereguleerde ferroptosis [13]. Mechanistisch gezien kan ART lysosomale afbraak van ferritine induceren op een autofagie-onafhankelijke manier, waardoor de cellulaire niveaus van ferro-ionen worden verhoogd en cellen gevoelig worden voor ferroptose [11].

Of ART ferroptosis in TNBC induceert, blijft echter onduidelijk. Bovendien beperken een reeks factoren, zoals een slechte oplosbaarheid in water en onvoldoende beschikbaarheid van intracellulaire ferro-ionen, de verdere toepassing van ART in antitumortherapie [13]. Verwacht wordt dat ART-nanocomplexen met succes zullen worden gebruikt als een prospectief nanodrugsafgiftesysteem voor op ART gebaseerde antitumormedicijnen [14,15,16]. In de afgelopen jaren trekken metaal-organische raamwerken (MOF's), een klasse van poreus polymeer materiaal, de aandacht vanwege demonstraties van hun grote poriegroottes, hoge schijnbare oppervlakten en selectieve opname van kleine moleculen [17,18,19]. Als een vertegenwoordiger van MOF-type materialen, wordt het zeolitische imidazolaatraamwerk (ZIF-8) veel gebruikt bij de ontwikkeling van nanogeneesmiddelen met kenmerken van pH-responsiviteit, hoge medicijnbelading en goede biocompatibiliteit [20,21,22,23 ]. Bovendien maakt de mogelijkheid om een verstelbaar oppervlak op MOF op te nemen de controle over de oppervlakte-eigenschappen en de multifunctionaliteit ervan mogelijk [24, 25]. De supramoleculaire assemblage van een metaal-fenolische coördinatielaag op het MOF-oppervlak heeft onlangs belangstelling getrokken vanwege de gewenste eigenschappen, zoals op stimuli reagerende demontage, colloïdale stabiliteit en biocompatibiliteit [26, 27]. De metaal-fenolische coördinatiematerialen op de MOF zouden een ideaal voertuig kunnen zijn voor het leveren van de hydrofobe ART.

Hierdoor geïnspireerd, ontwikkelden we ferro-ion-looizuur-coördinatie-gehuld ZIF-8 nanosysteem dat ART (TA-Fe/ART@ZIF) inkapselt voor het reguleren van ferroptose in TNBC-cellen, wat wordt aangetoond in Fig. 1. ZIF-8 was geselecteerd als nano-drager om ART in te kapselen vanwege de goede biocompatibiliteit en pH-responsieve afgifte. De ferro-ion-TA-coördinatielaag werd geïmmobiliseerd op het oppervlak van ART@ZIF met het oog op dispersiestabiliteit en toevoer van ferro-ionen (Fe(II)). Na de internalisering van het zoals voorbereide nanosysteem in cellen, zou zure degradatie van de voertuigen de afgifte van ART en accumulatie van Fe(II) vergemakkelijken. De opregulatie van Fe (II) -niveaus in cellen zou ART in radicalen ontleden door splitsing van de ijzer-gemedieerde endoperoxidebrug, waardoor de effecten van ferroptosis aanzienlijk worden versterkt. Concluderend kan de ontdekking van door TA-Fe/ART@ZIF gemedieerde ferroptosis nieuwe perspectieven bieden voor de ontwikkeling van nieuwe behandelingen tegen TNBC.

Schematische weergave van de bereiding van TA-Fe/ART@ZIF nanodeeltjes en de synergetische inductie van apoptose/ferroptose in tumorcellen

Materiaal en methoden

Reagentia

Artemisinine (99%), 2-methylimidazol (98%), zinknitraat (ZnNO₃; 98%), Ta (98%), ferrosulfaat (FeSO₄; 98% en watervrije methanol werden geleverd door Aladdin-Reagent Co. Ltd. (Shanghai, China).

Vervaardiging van TA-Fe/ART@ZIF nanodeeltjes

Voor de bereiding van ART@ZIF-nanodeeltjes werd 200 mg ART opgelost in 1 ml watervrije methanol en werd 2 g 2-methylimidazol (het oplosmiddel was 8 ml absolute methanol) langzaam toegevoegd aan de verkregen ART-oplossing. Onder magnetisch roeren werd langzaam 0,2 g zinknitraat (het oplosmiddel was 1 ml absolute methanol) toegevoegd. Ten slotte werd het volume van de oplossing ingesteld op 15 ml en 10 minuten geroerd om een lichtwitte oplossing te verkrijgen. Na centrifugeren bij 10.000 rpm werd het monster driemaal gewassen met methanol. Het supernatant moest het gehalte aan ART meten, terwijl het neerslagmiddel werd gevriesdroogd om de vaste toestand te verkrijgen voor verder gebruik.

Voor de bereiding van TA-Fe/ART@ZIF-nanodeeltjes werd TA-oplossing (40 mg/ml in gedeïoniseerd water, 2 ml) langzaam toegevoegd aan de ART@ZIF-oplossing (10 mg/ml, 4 ml). Na 20 min roeren, 5 mg/ml FeSO₄ werd langzaam aan de bovenstaande oplossing toegevoegd. Na herhaald roeren gedurende 30 min werd een donkerpaarse oplossing verkregen. Ten slotte werd het precipitaat verzameld door centrifugatie bij 10.000 rpm. Het neerslag werd drie keer gewassen met gedeïoniseerd water en gevriesdroogd om de TA-Fe/ART@ZIF te verkrijgen voor verder gebruik.

Karakterisering

TEM (JEM-1230; JEOL, Tokyo, Japan) werd gebruikt om de morfologische en elementaire samenstelling van elk deel van het nanodeeltje te bepalen. Dynamische lichtverstrooiing en zeta-potentiaal (DLS; Zetasizer Nano-systeem Malvern Instruments, Malvern, VK) werden gebruikt om de deeltjesgrootte en elektrische stabiliteit van de nanodeeltjes te evalueren. Fourier-transformatie-infraroodspectroscopie (VERTEX 70; Bruker, Bremen, Duitsland) en thermogravimetrische analyse werden gebruikt om de samenstelling van de bestanddelen van de nanodeeltjes te analyseren. Röntgenfoto-elektronspectroscopische (XPS) metingen werden gedaan met behulp van een PHI 5000 Versa Probe III (Physical Electronics). De elementaire samenstelling van het TA-Fe/ART@ZIF-materiaal werd uitgevoerd met behulp van EDX (Carl Zeiss Model:Neon-40).

Meting van inkapselingsefficiëntie en laadcapaciteit

Hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC) (Agilent 1200; Agilent Technologies, Santa Clara, CA) werd gebruikt om de hoeveelheid ART in het supernatant te meten. De medicijnbelading en inkapselingssnelheden van ART kunnen als volgt worden berekend:

$${\text{Drug}}\,{\text{loading}}\,(\%) =\frac{{{\text{Actual}}\,{\text{amount}}\,{\text {of}}\,{\text{drug}}\,{\text{encapsulated}}\,{\text{in}}\,{\text{NPs}}}}{{{\text{Bedrag} }\,{\text{of}}\,{\text{NPs}}}} \times 100\%$$$${\text{Entrapment}}\,{\text{efficiency}}\,\% =\frac{{{\text{Werkelijke}}\,{\text{bedrag}}\,{\text{of}}\,{\text{drug}}\,{\text{encapsulated}}\, {\text{in}}\,{\text{NPs}}}}{{{\text{Initial}}\,{\text{of}}\,{\text{bedrag}}\,{\text {of}}\,{\text{drug}}\,{\text{gebruikt}}}} \times 100\%$$

In vitro afgifte en pH-respons van TA-Fe/ART@ZIF nanodeeltjes

Het behandelde dialysemembraan omwikkeld met 2 mg nanodeeltjes werd geplaatst in 50 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) met een pH van respectievelijk 7,4 en 5,0 en continu geschud bij 37 ° C. De oplossing buiten het dialysemembraan werd bemonsterd 15 min, 30 min, 45 min, 1 uur, 2 uur, 4 uur, 6 uur, 8 uur en 10 uur na de start van het experiment. De inhoud van ART in de bufferoplossing werd gemeten met HPLC.

Celcultuur

MDA-MB-231- en L929-cellijnen werden verkregen van de American Type Culture Collection (American Type Culture Collection, Manassas, VA, VS). Cellen werden gekweekt bij 37 ° C en 5% CO₂ vochtigheid in RPMI-1640-medium (Solarbio, Beijing, China), dat werd aangevuld met 10% foetaal runderserum (Cyclone, Utah, VS), 100 g / ml natriumpyruvaat, penicilline en streptomycine (Solarbio Beijing, China).

Cellulaire toxiciteitstest in vitro

De levensvatbaarheid van de cellen werd bepaald met behulp van de 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromide (MTT)-assay volgens de literatuurprocedures [28, 29].

MDA-MB-231-cellen en L929-cellen werden gekweekt in standaard celmedia in platen met 96 putjes (5.000 cellen per putje) en geïncubeerd in 5% CO₂ bij 37 ° C gedurende 24 uur. De vloeistof in het putje werd weggegooid en 100 μL per putje van het serumvrije medium met PBS en verschillende concentraties van ART, TA-Fe/ZIF, TA-Fe/ART@ZIF, deferoxamine (DFO, MedChemExpress, Shanghai, China ), N-benzyloxycarbonyl-Val-Ala-Asp (O-Me) fluormethylketon (Z-VAD-FMK, MedChemExpress, Shanghai, China) en ferrostatine-1 (Fer1, MedChemExpress, Shanghai, China) werden toegevoegd aan de 96 -goede platen. Na 48 uur werd 10 μL MTT (5 mg/ml) toegevoegd en nog eens 4 uur geïncubeerd. Ten slotte werd een automatische enzymmarker (BioTek Instruments Inc., VS) gebruikt om de absorptie in elk putje te meten. De resultaten werden uitgedrukt als het percentage levensvatbaarheid van de cellen.

Calceïne-acetoxymethyl (calceïne-AM) kleuringsassay

MDA-MB-231-cellen werden gekweekt in platen met 24 putjes (2 × 10⁴ cellen per putje) en 24 uur geïncubeerd. Vervolgens werden de cellen 24 uur lang behandeld met verschillende concentraties TA-Fe/ART@ZIF-nanodeeltjes. Nadat het medium was weggegooid, werden de cellen gekleurd met Calcein-AM (Beyotime Biotechnology, Shanghai, China) in het donker bij 4 ° C gedurende 20 minuten en waargenomen onder een fluorescentie-geïnverteerde microscoop (Olympus, Tokyo, Japan).

Flowcytometrie voor apoptose

MDA-MB-231-cellen werden in een plaat met zes putjes geplaatst met een dichtheid van 2,5 × 10⁵ cellen per putje onder dezelfde omstandigheden. Na behandeling met PBS werden ART, TA-Fe/ZIF en TA-Fe/ART@ZIF gedurende 24 uur aangebracht. Vervolgens werden de cellen gecentrifugeerd en verzameld van de plaat met zes putjes. Na propidiumjodide en Annexin-V dubbele kleuring (Annexin V-FITC Kit; Beckman Coulter, Marseille, Frankrijk), werd flowcytometrie gebruikt om te detecteren.

In vitro bepalingstest voor reactieve zuurstofspecies (ROS)

Het ROS-gehalte in cellen werd uitgevoerd met behulp van een ROS-fluorescentieprobe (dichloor-dihydro-fluoresceïnediacetaat (DCFH-DA, Beyotime Biotechnology, Shanghai, China). MDA-MB-231-cellen werden gekweekt in platen met zes putjes (2,5 × 10⁵ cellen per putje) en geïncubeerd in 5% CO₂ bij 37 ° C gedurende 24 uur. De vloeistof uit de putjes werd weggegooid en cellen werden als volgt behandeld:blanco controlegroep (serumvrij medium), positieve controlegroep en experimentele groep (verschillende concentraties nanodeeltjes). Na 8 uur incubatie bij 37°C werd 0,1% DCFH-DA aan elk putje toegevoegd en werden de cellen 30 minuten geïncubeerd. Cellen die niet reageerden op DCFH-DA werden verwijderd met PBS en waargenomen onder een fluorescentie-geïnverteerde microscoop (Olympus, Tokyo, Japan).

Malondialdehyde (MDA) en GSH-inhoudsbepaling

De MDA-assaykit (TBA-methode; Jiancheng Bioengineering, Nanjing, China) en GSH-assaykit (Beyotime Biotechnology, Shanghai, China) werden gebruikt om de intracellulaire niveaus van MDA en GSH te meten. Na behandeling met PBS, ART, TA-Fe/ZIF en TA-Fe/ART@ZIF werden MDA-MB-231-cellen verzameld en geteld. Het intracellulaire gehalte aan MDA en GSH werd bepaald volgens de instructies in de kits.

Western Blot-analyse

De MDA-MB-231-cellen, die werden behandeld met verschillende nanodeeltjes, werden gelyseerd met RIPA-lysisbuffer. Nadat de eiwitconcentratie was bepaald, werden de eiwitten van verschillende monsters gescheiden met behulp van 10% SDS-PAGE-gel en overgebracht naar nitrocellulosemembraan. Het nitrocellulosemembraan dat geladen was met monstereiwitten werd gedurende 1 uur geblokkeerd door 0,5% BSA-eiwitoplossing en het nitrocellulosemembraan en de primaire antilichamen werden 24 uur bij 4 ° C geïncubeerd. We spoelden de primaire antilichamen van het nitrocellulosemembraan met TBST en bleven het gedurende 2 uur met de overeenkomstige secundaire antilichamen bij gewone temperatuur plaatsen. Na het afwassen van de secundaire antilichamen op het cellulosemembraan, werd het nitrocellulosemembraan gebruikt in een chemiluminescente oplossing en bekeken onder het gelbeeldvormingssysteem.

In vivo antitumor-experiment

Alle dierproeven werden goedgekeurd door de ethische commissie van de Weifang Medical University. Gezonde vrouwelijke naaktmuizen (leeftijd:4 weken; gewicht:13–17 g; Vital River, Beijing, China) kregen 5 × 10⁶ toegediend MDA-MB-231 cellen in 150 µl fosfaatgebufferde zoutoplossing. Toen het tumorvolume toenam tot 70–120 mm³ , werden de muizen willekeurig verdeeld in vier groepen. Elke groep muizen werd afzonderlijk behandeld met PBS, ART (20 mg/kg), TA-Fe/ZIF (80 mg/kg) en TA-Fe/ART@ZIF (100 mg/kg). Elke muis werd elke drie dagen door intraperitoneale injectie behandeld. Na 14 dagen werden alle muizen gedood. De tumorweefsels en belangrijke organen werden verzameld voor hematoxyline- en eosinekleuring.

Statistische analyse

Alle experimenten werden ten minste driemaal herhaald. Alle gegevens werden statistisch geanalyseerd met behulp van de SPSS versie 22.0-software (IBM Corp., Armonk, VS). De resultaten werden uitgedrukt als de gemiddelde ± standaarddeviatie. P waarden < 0,05 duidt statistische significantie aan.

Resultaten en discussie

Kenmerken van TA-Fe/ART@ZIF nanodeeltjes

Eerst werden de ART@ZIF-nanodeeltjes bij kamertemperatuur gesynthetiseerd uit methanol, zinkacetaat, 2-methylimidazol en ART volgens de literatuurprocedures [30]. Stabiele supramoleculaire metaal-polyfenolfilms werden vervolgens snel gevormd rond de ART@ZIF-templates door TA en ferro-ionen te vortexen. Vergeleken met de gerapporteerde magnetische nanodeeltjes [31,32,33], werd de TA-Fe/ART@ZIF geprepareerd via de zelfassemblagemethode die het TA-Fe-membraan op het oppervlak van MOF formatteerde zonder agressieve chemische of hydrothermische reactie. Wat nog belangrijker is, is dat de TA-Fe/ART@ZIF-nanodrager kan worden geactiveerd door een lage pH, om ART en Fe(II) vrij te maken, dat verder wordt gekatalyseerd door het endoperoxide van ART om C-gecentreerde vrije radicalen te genereren, aanzienlijk verbeterde ferroptosis . De inkapselingsefficiëntie, die werd gemeten met HPLC met behulp van het supernatant van de eerste centrifugatie, was 66,7%. Het supernatant werd verkregen door de TA-Fe/ART@ZIF-nanodeeltjes en de berekende geneesmiddelbelasting van ART was 11,4%. Volgens FTIR-spectroscopie (Fig. 2a), karakteristieke absorptiepieken van ART, namelijk de carbonylbinding op 1,738 cm⁻¹ en de peroxybrug op 724 cm⁻¹ [34], werden waargenomen in TA-Fe/ART@ZIF nanodeeltjes, wat aangeeft dat ART met succes was ingekapseld in de nanodeeltjes. Vervolgens onthulden de resultaten van de thermogravimetrische analyse dat ART volledig verdween wanneer de temperatuur werd verhoogd tot ongeveer 400 ° C (figuur 2b). Vergeleken met de TA-Fe/ZIF-nanodeeltjes bleek dat ART 7,1% van het totale gewicht van de TA-Fe/ART@ZIF-nanodeeltjes uitmaakt, wat in principe consistent is met de resultaten van de HPLC-analyse.

een FTIR van ART, ZIF-8 en TA-Fe/ART@ZIF; b Thermogravimetrische analyse (TGA) van ART, TA-Fe/ZIF en TA-Fe/ART@ZIF

De resultaten van TEM toonden aan dat ZIF-8 en ART@ZIF een vergelijkbare uniforme zeshoekconfiguratie vertoonden, en de deeltjesgrootteverdeling werd bepaald bij ongeveer 100 nm (Fig. 3a, b). TA-Fe/ART@ZIF-nanodeeltjes vertoonden een bolvormige configuratie en de deeltjesgrootteverdeling was 150 nm. Vergeleken met volledige ART@ZIF, vertoonde TA-Fe/ART@ZIF gecoat met Fe(II) en TA een voor de hand liggende conventionele kern-schaalstructuur, en de grootte van het TA-Fe-membraan was ongeveer 30 nm (figuur 3a). Bovendien hebben we gebieds-elementaire mapping-analyse van de gevormde nanodeeltjes uitgevoerd. De gebied-elementaire mapping bevestigde dat de periferie van TA-Fe / ART @ ZIF-nanodeeltjes werd omringd door het Fe-element, wat aangeeft dat Fe (II) en TA met succes waren verhuld (figuur 3b). XPS-metingen werden uitgevoerd om de samenstelling en interactie van oppervlakte-elementen in TA-Fe/ART@ZIF-composiet te onderzoeken. Het wide-scan XPS-spectrum van TA-Fe/ART@ZIF wordt weergegeven in aanvullend bestand 1:Fig. 1s. De belangrijkste pieken die opkwamen rond 285, 408, 531, 737 en 1036 eV waren gerelateerd aan respectievelijk C 1s, N 1s, O 1s, Fe 2p en Zn 2p, wat de vorming van TA-Fe/ART@ZIF nanocomposiet aantoont . Bovendien worden EDS-afbeeldingsafbeeldingen van de TA-Fe/ART@ZIF weergegeven in aanvullend bestand 1:Fig. 2s. Het blijkt duidelijk dat de pieken die overeenkomen met elementen zoals koolstof (C), stikstof (N), zuurstof (O), ijzer (Fe) en zink (Zn), goed overeenkomen met het XPS-spectrum. Door de hoeveelheid Fe (II) te vergroten, ontdekten we dat de hydrodynamische diameter van TA-Fe / ART@ZIF-nanodeeltjes was toegenomen (aanvullend bestand 1:Fig. 3s). Om de coating verder te bevestigen, hebben we het zeta-potentieel van verschillende nanodeeltjes gemeten. De formatie TA-Fe(II)-laag op ART@ZIF-deeltjes verschoof de oppervlakte-zeta van + 21 mV-potentiaal naar − 19,5 mV vanwege de zure aard van TA (aanvullend bestand 1:Fig. 4s). Zoals eerdere literatuur meldde [30], zorgen de overvloedige polyfenolgroepen in de TA-structuur niet alleen voor het vermogen van het substraat om te coaten, maar zijn ze ook in staat om te coördineren met overgangsmetaalionen (Fe, Zn) om een metaalfenolcomplex te vormen. Wanneer Zn²⁺ en Hmim worden gemengd om een oplossing te vormen, een massa van Zn²⁺ ionen zouden coördineren aan het oppervlak van ART@ZIF-deeltjes; dus de zeta-potentiaal van ART@ZIF is + 21 mV. De fenolische groepen van TA (pKa 8.5) waren negatief gedeprotoneerd en konden daarom interageren met het positief geladen Zn²⁺ , het bevorderen van de TA-Fe-filmgroei op het ART@ZIF-oppervlak. Aangezien medicijnafgifte gunstig is voor dragers, is de stabiliteit een belangrijke factor voor hun medicinale toepassing. De stabiliteit van de nanodeeltjes werd aangetoond door een week te dispergeren in PBS. Zoals te zien is in Aanvullend bestand 1:Fig. 5s, toonde de deeltjesgrootte de gewenste grootte en stabiliteit uit het tijdsverloop van het onderzoek.

een TEM-afbeeldingen en grootteverdeling van ZIF-8, ART@ZIF en TA-Fe/ART@ZIF nanodeeltjes. Schaalbalk:100 nm; b verdeling van koolstof- en ijzerelementen in TA-Fe/ART@ZIF nanodeeltjes. Schaalbalk:100 nm

een In vitro afgifte van ART uit TA-Fe/ART@ZIF nanodeeltjes in pH 7,4 en 5,0. b De cytotoxiciteit van ART-, TA-Fe/ZIF- en TA-Fe/ART@ZIF-nanodeeltjes in MDA-MB-231-cellen bij 0, 12,5, 25, 50 en 100 μg/ml. c Levensvatbaarheid van L929-cellen behandeld met TA-Fe/ART@ZIF in verschillende concentraties. d Calceïne-AM-kleuring van MDA-MB-231-cellen behandeld met TA-Fe/ART@ZIF-nanodeeltjes in concentraties van 0, 25, 50 en 100 μg/ml

ROS-productie gedetecteerd door fluorescentie van DCFH-DA in MDA-MB-231-cellen die zijn behandeld met ART-, TA-Fe/ZIF- en TA-Fe/ART@ZIF-nanodeeltjes

Vrijgave en cytotoxiciteit van TA-Fe/ART@ZIF in vitro

Om vervolgens te onderzoeken of TA-Fe/ART@ZIF pH-responsief ontledingsgedrag had, onderzochten we de afgifte van ART uit nanodeeltjes onder neutrale en zure omstandigheden. Zoals weergegeven in figuur 4a, kunnen de nanodeeltjes in de zure omstandigheden binnen 1 uur snel ongeveer 58% van de ART afgeven. Onder neutrale omstandigheden kunnen de nanodeeltjes echter slechts langzaam een minieme hoeveelheid ART afgeven. Bovendien werd tijdens de behandeling van de externe oplossing van het dialysemembraan met natriumhydroxide de oplossing van de pH = 5.0-groep omgezet met natriumhydroxide om een aanzienlijk wit precipitaat te produceren. Dit fenomeen werd echter niet waargenomen in de pH = 7.4-groep.

Volgens onze hypothese is het witte neerslag een zinkhydroxide-precipitaat dat wordt gevormd door de dissociatie van zinkionen en alkali uit de nanodeeltjes onder zure omstandigheden. Gezamenlijk toont dit bewijs met succes aan dat onze nanodeeltjes het vermogen hebben om te dissociëren onder zure omstandigheden.

Bij het ontwerp van het TA-Fe/ART@ZIF-nanosysteem worden de TA-Fe(II)- en ZIF-structuren geablateerd om de omhulde ART en Fe(II) vrij te maken onder de zure omstandigheden van de micro-omgeving van de tumor. De opregulatie van Fe (II) -niveaus in cellen zou ART in radicalen ontleden door splitsing van de ijzer-gemedieerde endoperoxidebrug, waardoor de effecten van ferroptosis aanzienlijk worden versterkt. Dienovereenkomstig werden MTT-assays uitgevoerd om de cytotoxiciteit van nanosystemen voor MDA-MB-231-cellen en L929-cellen te bestuderen. Vergeleken met ART vertoonden TA-Fe / ART@ZIF-nanodeeltjes een grotere cytotoxiciteit voor MDA-MB-231-cellen (figuur 4b) en lage cytotoxiciteit voor normale cellen (figuur 4c). TA-Fe/ART@ZIF-nanodeeltjes remden de activiteit van MDA-MB-231-cellen met 53,9%, terwijl ART bij dezelfde concentratie slechts 24,1% van de hele cellen remde. De experimentele resultaten van calceïne-AM-kleuring bevestigden dat de hoeveelheid levensvatbare MDA-MB-231-cellen geleidelijk afnam met de toenemende concentratie van TA-Fe/ART@ZIF-nanodeeltjes (Fig. 4d).

TA-Fe/ART@ZIF Verbeterde ROS-generatie in MDA-MB-231-cellen

Van ART is bekend dat het zijn antikankeractiviteit uitoefent via het genereren van ROS geproduceerd door ijzer-gemedieerde splitsing van de endoperoxidebrug [35, 36]. Daarom hebben we de efficiëntie van TA-Fe/ART@ZIF onderzocht om ROS-generatie te induceren door de 2′,7′-dichloordihydrofluoresceïnediacetaat (DCHF-DA) sonde [37]. Zoals getoond in Fig. 5, werd het iets sterkere fluorescentiesignaal waargenomen in cellen behandeld met ART en TA-Fe/ZIF vergeleken met onbehandelde groepen, wat aangeeft dat de ART- en Fe(II)-ionen ROS-generatie zouden kunnen induceren. Daarentegen wordt sterke blootstelling aan fluorescentiesignalen aan TA-Fe/ART@ZIF nano-drug gevonden in cellen als een bewijs van de gewenste ROS-opbrengst, die wordt gegenereerd door splitsing van Fe(II)-gemedieerd endoperoxide van ART. Het zoals voorbereide nanosysteem in cellen zou worden afgebroken en accumulatie van Fe (II) veroorzaken, een opmerkelijk verbeterde ROS-generatie. Het antikankereffect van ART en zijn derivaten is toegeschreven aan hun vermogen om apoptose te induceren door verschillende cellulaire processen, variërend van DNA-schaderespons, het lysosoom-gemedieerde katabole proces macroautofagie en oxidatieve stress [13, 35, 38]. En er werd ook gemeld dat de ijzer-gemedieerde splitsing van de endoperoxidebrug in ART de intracellulaire oxidatieve balans tot ferroptose in veel soorten kankercellen zou kunnen beïnvloeden [11]. Deze inductie van ferroptose op basis van oxidatieve onbalans kan verder worden versterkt door de toevoeging van Fe(II). Hoewel Fe(II) ART activeert, kan het ook reageren met intracellulair waterstofperoxide om vrije hydroxylradicalen te genereren via de Fenton-reactie, die het apoptose-inducerende effect van ART in tumorcellen versterkt.

TA-Fe/ART@ZIF-geïnduceerde apoptose en ferroptose in MDA-MB-231-cellen

Ondertussen hebben we, om celdood en de rol van Fe (II) te onderzoeken, ijzerchelator deferoxamine, apoptose-remmer Z-VAD-FMK en ferroptose-remmer ferrostatine-1 gebruikt om deze cellen te redden. Zoals voorspeld, zou deferoxamine, een aaseter van Fe(II), duidelijk celdood kunnen blokkeren, wat de belangrijke rol van Fe(II) suggereert. Bovendien was het overlevingspercentage van MDA-MB-231-cellen significant verbeterd door apoptose en ferroptose-remmer van respectievelijk 31,4% tot 56,3% en 76,0% (Fig. 6a), wat het belang van apoptose en ferroptose in TA-Fe/ART benadrukt. @ZIF nanodeeltjes bemiddelden de celdood. Bovendien hebben we een op Annexin V-FITC gebaseerde test door middel van flowcytometrie gebruikt om de mate van apoptose kwantitatief te bepalen. De resultaten stellen dat TA-Fe/ART@ZIF-nanodeeltjes apoptose kunnen induceren in 21,8% van de MDA-MB-231-cellen (aanvullend bestand 1:Fig. 6s). Dit percentage was hoger dan dat geregistreerd voor ART, wat impliceert dat apoptose betrokken is bij de gemedieerde TA-Fe/ART@ZIF nanodeeltjes, maar het is niet de hoofdoorzaak.

een Remmers DFO (deferoxamine), Fer-1 (Ferrostatin-1) en Z-VAD-FMK hebben de levensvatbaarheid van MDA-MB-231-cellen gered die werden behandeld met respectievelijk 100 μg/ml TA-Fe/ART@ZIF-nanodeeltjes. b ART-, TA-Fe/ZIF- en TA-Fe/ART@ZIF-nanodeeltjes droegen bij aan overmatige MDA in MDA-MB-231-cellen. c ART, TA-Fe/ZIF en TA-Fe/ART@ZIF nanodeeltjes verbruikten intracellulair GSH. d De expressieniveaus van GPX4-eiwitten in MDA‐MB‐231-cellen die zijn behandeld met ART-, TA-Fe/ZIF- en TA-Fe/ART@ZIF-nanodeeltjes

Een veel voorkomend kenmerk van ferroptosis is endogene lipideperoxidatie [39]. MDA, een product van lipideperoxidatie [40], werd onderzocht om de mate van ferroptosis te bepalen. De resultaten toonden aan dat TA-Fe/ART@ZIF-nanodeeltjes ongeveer 2, 5 keer hogere MDA-niveaus hadden dan de controlegroep (Fig. 6b). Dit werd verondersteld vanwege de aanwezigheid van met nanocarrier verrijkt Fe (II) en de overeenkomstige verhoging van de niveaus van lipideradicalen. Als een van de belangrijkste antioxidantcomponenten in de cellen, wordt intracellulair GSH verminderd, vergezeld van ferroptose [41]. Gezien de belangrijke rol van GSH bij ferroptose, hebben we het intracellulaire GSH-niveau geëvalueerd na behandeling met TA-Fe/ART@ZIF-nanodeeltjes. GSH was significant verlaagd in vergelijking met met vehikel behandelde cellen (figuur 6c). Dit leverde sterk bewijs voor de uitputting van GSH en oxidatie-onbalans, die was gericht op de Fe(II)-gemedieerde activering van ART door TA-Fe/ART@ZIF-nanodeeltjes. Vervolgens werd western blotting uitgevoerd om de impact van TA-Fe/ART@ZIF-nanodeeltjes op GPX4-activiteit [42] te begrijpen. We hebben waargenomen dat TA-Fe / ART@ZIF-nanodeeltjes een significantere remming van GPX4-activiteit veroorzaakten dan ART (figuur 6d). Deze gegevens kwamen ook goed overeen met de hoogste mate van GSH-uitputting.

In vivo antitumor-experiment

We evalueerden de antitumorwerking van onze nanodeeltjes op MDA-MB-231-cellen in vivo door de remming van subcutane xenotransplantaattumoren in tumordragende naakte muizen. Tijdens de 14-daagse behandeling kunnen TA-Fe/ART@ZIF-nanodeeltjes, in vergelijking met andere groepen, de groei van MDA-MB-231 xenograft-tumoren aanzienlijk remmen als gevolg van overvloedige ROS-generatie door Fe(II)-ART-reactie (Fig. . 7a). Bovendien was er geen significante diversiteit in lichaamsgewicht in alle experimentele groepen (Fig. 7b), wat aantoont dat de TA-Fe/ART@ZIF verwaarloosbare bijwerkingen had. Om het therapeutische effect verder te bestuderen, werden de tumor en andere normale weefsels onderzocht met H&E-kleuring na 14 dagen behandeling. As shown in Fig. 8, TA-Fe/ART@ZIF caused the largest region of cell death in the tumor tissue, while there was no obvious damage and apoptosis in the normal tissues. Overall, these results demonstrated that the TA-Fe/ART@ZIF-mediated therapy not only led to anticancer efficacy, but also have a low level of acute systematic toxicity in the SFT-MB-mediated therapy.

een Relative tumor volume after treated with treated with PBS, ART, TA-Fe/ZIF, and TA-Fe/ART@ZIF nanoparticles. b Relative mice body weight of various groups

H&E stains of organs and tumors from various mice groups. Scale bar:50 μm

Conclusion

In summary, ferroptosis provides a potential remedy for TNBC treatments, since it has exclusive advantages to overcome inevitable barriers of the currently prevalent therapy. Here, we designed a ferrous-supply nanocarrier for ART based on TA–Fe(II) coated on the ZIF nanoparticles with ART encapsulated via coordination-driven self-assembly for enhanced ferroptosis. The nano-carrier could be dissolved in the weak acidic microenvironment to release ART and Fe(II), which is further caused a high level of intracellular ROS and MDA, accompanied with decreasing of GSH and GPX4, leading to potent tumor growth inhibition and anticancer efficacy in vitro and in vivo. This work provides a novel approach to enhance the potency of ferroptotic nano-medicine and new directions for TBNC therapy. Biocompatibility and comprehensive mechanisms of TA-Fe/ART@ZIF-induced ferroptosis should be ensured for further investigation.

Beschikbaarheid van gegevens en materialen

Alle gegevens zijn onbeperkt beschikbaar.

Afkortingen

MOF:: Metal–organic frameworks
TNBC:: Triple-negative breast cancer
ART:: Artemisinin
TA:: Tannic acid
ZIF:: Zeolitic imidazolate framework-8
TA-Fe/ART@ZIF:: Tannic acid and ferrous ion coated on the zeolitic imidazolate framework-8 with artemisinin encapsulated
ROS:: Reactieve zuurstofsoorten
LPO:: Lipid hydroperoxides
GSH:: Glutathion
TEM:: Transmissie-elektronenmicroscopie
FTIR:: Fourier-transformatie infraroodspectroscopie
HPLC:: Krachtige vloeistofchromatografie
PBS:: Phosphate-buffered saline
MTT:: 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide
DFO:: Deferoxamine
Fer-1:: Ferrostatin-1
Z-VAD-FMK:: N-Benzyloxycarbonyl-Val-Ala-Asp(O-Me) fluoromethyl ketone
Calcein-AM:: Calcein-acetoxymethyl
DCFH-DA:: Dichloro-dihydro-fluorescein diacetate
MDA:: Malondialdehyde
BSA:: Bovine serum albumine
TBST:: Tris-buffered saline Tween
SDS-PAGE:: Polyacrylamide gel electrophoresis
GPX4:: Glutathione peroxidase 4

Een dubbele vierkwadranten fotodetector op basis van nabij-infrarood verbeterd nanometer zwart silicium In situ synthese van zilveren nanodeeltjes op amino-geënte polyacrylonitrilvezels en de antibacteriële activiteit ervan

Nanomaterialen

Metaal

Hars

vezel

Samengesteld materiaal