Resveratrol-geladen humaan serumalbumine nanopartikelen met PEG–RGD-targeting: verlengde circulatie, verbeterde biologische compatibiliteit en krachtige onderdrukking van pancreastumor

Samenvatting

Humaan serumalbumine (HSA) is een natuurlijke, niet-immunogene drager die lipofiele geneesmiddelen kan encapsuleren en hun farmacokinetiek verbeteren. We hebben resveratrol (RV)-bevattende HSA-nanopartikelen geconjugeerd met arginine-glycine-aspartaat (RGD) via een polyethyleenglycol (PEG)-linker (HRP–RGD NPs) om gerichte afgifte aan pancreastumoren te bereiken. De nanopartikelen vertonen een uniforme diameter van 120 ± 2,6 nm, een RV-encapsulatie-efficiëntie van 62,5 ± 4,21% en een pH-gevoelige afgifte van 58,4 ± 2,8% bij pH 5,0 en 37 °C. PEG- en HSA-coatings verbeteren de biologische compatibiliteit van RV aanzienlijk. Confocale imaging toont een opname van 47,3 ± 4,6% van HRP–RGD NPs in PANC-1 cellen, wat beter is dan niet-gerichte controles. In vivo verlengen HRP–RGD NPs de halfwaardetijd van RV 5,43-voudig, met een 3,01- en 8,1-voudig hogere tumoraccumulatorie dan respectievelijk HRP NPs en vrij RV. Behandeling van tumordragende muizen met HRP–RGD NPs onderdrukte tumorgroei gedurende 35 dagen volledig, zonder systemische toxiciteit. Deze gegevens tonen aan dat HRP–RGD NPs een robuust, biologisch compatibel platform bieden voor gerichte pancreaskankertherapie.

Achtergrond

Pancreaskanker blijft een van de meest dodelijke maligniteiten, met een mediane overleving van minder dan zes maanden en een 5-jaars overlevingscijfer onder 6%. Conventionele behandelingen – chirurgie, radiotherapie en conventionele chemotherapie – worden belemmerd door ernstige bijwerkingen en beperkte effectiviteit. Resveratrol (RV), een natuurlijke polyfenol uit druiven en sojabonen, toont antikankeractiviteit bij verschillende tumortypes, maar lijdt onder slechte oplosbaarheid, snelle clearance en niet-specifieke distributie. Encapsulatiestrategieën, met name gebruikmakend van endogene dragers zoals HSA, kunnen de oplosbaarheid van geneesmiddelen verbeteren, de circulatie verlengen en functionaliseren voor actieve targeting. HSA is niet-toxisch, niet-immunogen en bezit reactieve carboxyl- en aminogroepen voor conjugatie. PEGylatie verlengt de verblijftijd in het bloed verder.

Methoden

Materialen

Alle reagentia werden bezorgd van Sigma Aldrich, Seebio Biotech en Pierce Biotech. Humaan serumalbumine (≥96% zuiverheid), resveratrol (≥99%) en RGD-peptide (≥97%) werden zonder verdere zuivering gebruikt.

Synthese van HSA–RV-nanopartikelen

Resveratrol (6 mg in 1 mg mL⁻¹ DMSO) werd gemengd met HSA (10 mg mL⁻¹) en 6 uur gerold bij kamertemperatuur om coacervaten te vormen. Vercruising met 0,5% glutaraldehyde (100 µL) gevolgd door dialyse produceerde HSA–RV NPs. Blanco NPs werden identiek bereid zonder RV.

Conjugatie van PEG–RGD en vorming van HRP–RGD NPs

PEG-2000-COOH werd geactiveerd met SATA en gekoppeld aan RGD in de aanwezigheid van EDC, wat SATA-PEG-RGD vormde. Na reductie met hydroxylamine werd het product gezuiverd en gereageerd met SPDP-geactiveerde HSA–RV NPs om HRP–RGD NPs te geven. Overmaat reagentia werden verwijderd door dialyse en filtraties.

Karakterisatie

• Grootte en polydispersiteit: Dynamische lichtverstrooiing (DLS) en SEM.
• Geneesmiddellading: UV-Vis spectrofotometrie bij 306 nm.
• Afgiftesnelheid: Dialysezak (8–12 kDa MWCO) in PBS bij pH 5,0, 6,5, 7,4, 9,0, 37 °C.

Biologische compatibiliteit en hemolyse

Rode bloedcellen werden geïncubeerd met HRP–RGD NPs (10–200 µg mL⁻¹) gedurende 3 uur bij 37 °C. Hemolyseratio's werden berekend tegenover PBS (negatief) en gedemineraliseerd water (positief) controles.

Cellulaire studies

PANC-1 cellen werden gekweekt in DMEM met 10% FBS. FITC-gelabelde HRP–RGD NPs werden 5 uur geïncubeerd, gevolgd door confocale imaging en flow cytometrie om opname te beoordelen. Cytotoxiciteit werd geëvalueerd met CCK-8 assay over 0–200 µg mL⁻¹ concentraties. Apoptotische morfologie werd bevestigd met Hoechst 33258 kleuring.

Dierproeven

Balb/c naakte muizen werden subcutane geïnjecteerd met 1 × 10⁶ PANC-1 cellen. Toen tumoren ~80 mm³ bereikten, werden muizen gerandomiseerd (n = 5) in zoutoplossing, RV, HRP NPs of HRP–RGD NPs groepen (10 mg kg⁻¹ RV equivalent). Tumorvolume en lichaamsgewicht werden elke 3 dagen gemonitord gedurende 35 dagen. Biodistributie werd beoordeeld na 24 uur via UV-Vis analyse van tumorweefsel. Histopathologie van belangrijke organen werd post-mortem uitgevoerd.

Resultaten en discussie

Nanopartikelfabricatie en fysicochemische eigenschappen

HRP–RGD NPs vertoonden een smalle, unimodale grootteverdeling (120 ± 2,6 nm) met een homogene bolvormige morfologie. UV-Vis spectras bevestigden RV-encapsulatie, terwijl fluorescerende emissie bij 325 nm RV-retentie binnen de deeltjes bevestigde.

Geneesmiddellading en pH-responsieve afgifte

De encapsulatie-efficiëntie bereikte een piek van 62,5 ± 4,21%. Afgifte-studies toonden een cumulatieve afgifte van 58,4 ± 2,8% na 60 uur bij pH 5,0, vergeleken met aanzienlijk lagere snelheden bij fysiologische pH, wat tumor-specifieke afgifte benadrukt.

Verbeterde stabiliteit en biologische compatibiliteit

In tegenstelling tot kristallijn vrij RV, bleven HRP–RGD NPs colloïdaal stabiel in PBS, DMEM en FBS gedurende 4 weken. Fluorescentie-intensiteit bleef >96% na 4 weken, terwijl vrij RV daalde tot 12%. Hemolyse-assays toonden <5% hemolyse tot 200 µg mL⁻¹, vergelijkbaar met PBS-controles.

Gerichte cellulaire opname

Flow cytometrie kwantificeerde een opname van 58,5 ± 3,5% van HRP–RGD NPs door PANC-1 cellen, aanzienlijk hoger dan niet-gerichte HRP NPs (16,2 ± 4,9%) en RGD-geblokkeerde controles (7,1 ± 5,1%). Confocale imaging bevestigde efficiënte intracellulaire levering.

Krachtige antitumore activiteit in vitro

HRP–RGD NPs vertoonden dosis-afhankelijke cytotoxiciteit, reducerende PANC-1 levensvatbaarheid tot <30% bij 50 µg mL⁻¹, wat vrij RV en HRP NPs overtrof. Hoechst-kleuring onthulde karakteristieke apoptotische kerncondensatie.

Verlengde circulatie en tumoraccumulatorie

HRP–RGD NPs verlengden de plasma-halfwaardetijd van RV tot 6,57 ± 0,9 u (vs. 1,21 ± 0,09 u voor vrij RV). Na 24 uur was de tumor RV-inhoud in de HRP–RGD groep 3,01- en 8,1-voudig hoger dan HRP NPs en vrij RV, respectievelijk, wat effectieve EPR- en RGD-gemediëerde targeting aangeeft.

In vivo tumoronderdrukking en veiligheid

HRP–RGD NP-behandeling stopte tumorgroei gedurende 35 dagen volledig, zonder recidief. Lichaamsgewichten bleven stabiel in alle groepen. Histologie van hart, lever, milt, long en nier toonde geen pathologische veranderingen, wat systemische veiligheid bevestigt.

Conclusies

HRP–RGD NPs vertegenwoordigen een klinisch relevant platform dat de oplosbaarheid, farmacokinetiek en targeting-beperkingen van vrij resveratrol overkomt. Door combinatie van HSA-encapsulatie, PEGylatie en RGD-targeting bereiken deze nanopartikelen een langdurige circulatie, tumor-specifieke accumulatie en robuuste antitumor-effectiviteit met minimale toxiciteit. Deze studie ondersteunt hun verdere ontwikkeling als een krachtige therapeutische modaliteit voor pancreaskanker.

Afkortingen

• CCK-8: Cell Counting Kit-8
• FBS: Fetal Bovine Serum
• FITC: Fluoresceine Isothiocyanate
• HSA: Humaan Serum Albumine
• PEG: Polyethyleenglycol
• RGD: Arginine-Glycine-Aspartaat
• RV: Resveratrol
• PBS: Fosfaat-gebufferde Zoutoplossing