Optimalisatie van Fe₃O₄-Au kern-schelp nanopartikel opname voor gerichte endocytose in darmkankercellen

Samenvatting

Magnetiet (Fe₃O₄)-goud (Au) kern-schelp nanopartikelen (NPs) hebben unieke magnetische en optische eigenschappen. Wanneer gecombineerd met biologische groepen, kunnen deze NPs nieuwe strategieën bieden voor biomedische toepassingen, zoals geneesmiddelafgifte en kanker targeting. Hier presenteren we een effectieve methode voor de controleerbare cellulaire opname van magnetische kern-schelp NP systemen gecombineerd met biologische groepen. Vimentine, het structurele eiwit, is biochemisch bevestigd om fagocytose krachtig te beïnvloeden. Bovendien beïnvloedt vimentine de internalisatie van exogene materialen in cellen zelfs onder meervoudige inhibities van biologische groepen. In deze studie demonstreren we de cellulaire internalisatieprestaties van Fe₃O₄-Au kern-schelp NPs met oppervlaktemodificatie gebruikmakend van een combinatie van biologische groepen. De fotoluminescentie van vimentine-getagde NPs bleef onveranderd onder meervoudige inhibitietesten, wat aangeeft dat de NPs minimaal beïnvloed werden door nystatine, dynasore, cytochalasine D, en zelfs het Muc1 antilichaam (Ab). Dit resultaat geeft aan dat het Muc1 Ab specifieke moleculen kan targeten en specifieke endocytose kan controleren. Bovendien tonen we de mogelijkheid van het controleren van specifieke endocytose in darmkankercellen.

Inleiding

Nanomaterialen hebben nieuwe wegen geopend voor klinische diagnostiek en therapeutica. Vooral nanopartikelen (NPs) zijn een van de belangrijkste tools en zijn gebruikt in toepassingen zoals biosensoren, diagnostiek, en gerichte geneesmiddelafgifte systemen. Voor biomedische toepassingen zijn NPs doorgaans samengesteld uit organische materialen die het oppervlak van kernmaterialen omringen. De kernmaterialen, bestaande uit magnetische materialen, halfgeleider materialen, of andere typen materialen, hebben nuttige fysico-chemische eigenschappen, en het buitenste organische oppervlak biedt chemische stabiliteit en functionaliteit aan de NPs. Voor toepassingen in biologische targeting systemen, zijn niet alleen de fysico-chemische eigenschappen maar ook het buitenste organische oppervlak, dat biofunctionaliseerd is voor targeting, kritische parameters. Voorbeelden van targeting groepen voor functionalisatie zijn antilichamen of liganden die specifiek zijn voor een target. Afhankelijk van de biofunctionaliseerde materialen op het buitenste oppervlak, worden de endocytose mechanismen van NPs bepaald. Het mechanisme dat NPs in cellen toelaat, is het onderwerp van veel recent onderzoek geweest vanwege hun belangrijkheid in nanomedische toepassingen.

In het bijzonder zijn magnetische NPs breed gebruikt in veel specifieke site targeting toepassingen, waaronder celsortering, MRI, DNA isolatie, geneesmiddelafgifte, hyperthermie behandeling, en kanker targeting. Onder verschillende magnetische NPs, zijn magnetiet nanokristallen het meest gebruikt in biomedische toepassingen vanwege hun biocompatibiliteit en chemische stabiliteit. Hoewel veel inspanningen gewijd zijn aan biomedische toepassingen met magnetische NPs, zijn er nog steeds enkele kritieke kwesties zoals goede disperseerbaarheid in waterige oplossing, functionaliteit, en biocompatibiliteit. Om deze problemen te overwinnen, hebben veel studies zich gericht op de oppervlaktemodificatie van NPs met behulp van diverse functionele groepen (bijv. carboxyl en amine groepen). Echter, de hechting van functionele groepen aan het oppervlak van magnetiet NPs is een tijdrovend en arbeidsintensief proces. Gegeven dit feit, zijn kern-schelp type Au-gecoate magnetische NPs aantrekkelijk omdat het Au oppervlak gemakkelijk kan koppelen aan biomoleculen en organische materialen.

Vooral de magnetische eigenschappen van de magnetische kern-Au schelp NPs maken magnetische scheiding mogelijk, verhogen de resolutie in MRI imaging, en kunnen toegepast worden op hyperthermie therapie. Bovendien zijn de superieure chemische bindingseigenschappen van goud voordelig voor het bouwen van receptor-gemedieerde afgifte systemen voor specifieke kanker-targeting.

De afgelopen decennia hebben veel onderzoekers receptor-gemedieerde afgifte systemen voor kanker targeting gerapporteerd. Receptor-gemedieerde targeting van kankercellen is een vorm van actieve targeting. De keuze van target is de sleutel voor effectieve actieve targeting, en de targets moeten overexprimeerd zijn op de extracellulaire membraan. Meeste onderzoekers hebben monoklonale antilichamen gebruikt voor kankerbehandeling, en het therapeutische effect kan aanzienlijk toenemen wanneer monoklonale antilichaam therapieën gecombineerd worden met conventionele chemotherapie. Ondanks het succes van monoklonale antilichaam therapie, vertonen monoklonale antilichamen verschillende beperkingen in kanker targeting. Hun grote grootte (ongeveer 150 kDa) is een grote obstakel voor tumorpenetratie, en hun lage stabiliteit en lage oplosbaarheid hinderen hun wijdverspreide gebruik. De inhomogene richting van hun hechting op de targeting drager wordt ook beschouwd als obstakel voor aspecifieke binding. Om antilichamen met verbeterde tumorpenetratie te produceren, is een breed scala aan antilichaam formaten geëxperimenteerd en getest. Naast klassieke antilichamen, is een uniek antilichaam formaat aanwezig in soorten uit de familie Camelidae. De zgn. zware-keten antilichamen (HCAbs) komen van nature voor in het perifeer bloed en melk van deze soorten. De antigenaanbindende fragmenten van zulke HCAbs zijn samengesteld uit één enkele domein, de zware-keten variabele domein (VH) van het kamelachtige HCAb (VHH). De VHH, rekombinant verkregen na klonering en expressie in bacteriën of schimmels, wordt een nanobody genoemd. Het heeft een molecuulgewicht van 11–15 kDa en is de kleinste antilichaam onder alle mAbs. Niet alleen hun kleine grootte maakt ze potentiëel geschikt als targeting probes tegen antigenen in geïsoleerde locaties, maar ook hun gemakkelijk wijzigbare terminale einde is aantrekkelijk voor toepassing in kanker targeting.

De efficiënte aflevering van NPs met geschikte targeting en internalisatie van cellen zijn ook belangrijke factoren in het afgifte systeem. Het is gerapporteerd dat vimentine een belangrijke rol speelt als component van pathogeen heching en intracellulaire instap pathways. Dempen van vimentine genexpressie remt fagocytose, terwijl gespleten vimentine een signaal is dat fagocytose significant verhoogt. Daarom is het neutraliseren van cel fagocytose weerstand veroorzaakt door vimentine op het celoppervlak belangrijk voor efficiënte nanopartikel aflevering.

In deze studie onderzoeken we de endocytose pathways van nanobody-getagde Fe₃O₄-Au kern-schelp NPs gemodificeerd met PEG (polyethyleenglycol) spacers met verschillende lengtes. Vimentine, bekend om een sterk effect te hebben op fagocytose door biochemische experimenten, werd vergeleken als controle, en bevestigd dat het effectief werkt op celinternalisatie van NPs. Bovendien wordt Muc1, een celoppervlakte glycoproteïne en overexprimeerd in diverse kankers, zoals pancreas, borst, long, en maagkanker, gebruikt als kanker-targeting biomarker. We bevestigden de efficiënte internalisatie van Fe₃O₄Au kern-schelp NPs en de methoden van controleerbare targeting naar kankercellen via de Muc1 receptor-gemedieerde endocytose pathway in darmcellen.

Materialen en Methoden

Materialen

Goud (III) acetaat (Au(OOCCH₃)₃, 99,9%) verkregen van Alfa Aesar. Overige chemicaliën inclusief ijzer (III) acetylacetonaat (Fe(acac)₃, 99,9%), 1,2-hexadecanediol (C₁₄H₂₉CH(OH)CH₂(OH), 90%), poly(ethyleenglycol)-block-poly(propyyleenglycol)-block-poly(ethyleenglycol) (PEG-PPG-PEG), en octylether (C₈H₁₇OC₈H₁₇, 99%) gekocht van Sigma-Aldrich en gebruikt zoals ontvangen. Alpha-pyridyl-2-disulfid-omega-carboxy succinimidyl ester poly(ethyleenglycol) (OPSS-PEG-NHS) (2K, 5K, en 10K) gekocht van Nanocs. Natriumbicarbonaat, WST-1, chlorpromazine, nystatine, cytochalasine D, dynasore, brefeldine A (BFA), monensine, en tryphaanblauw gekocht van Sigma-Aldrich. Cy3 en Cy7.5 gekocht van Lumiprobe. Anti-Muc1 Ab gekocht van Abcam Inc. (Cambridge, MA). Fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS), Dulbecco's modified Eagle's medium, en foetaal runderserum gekocht van Invitrogen Corp.

Synthese van Fe₃O₄-Au Kern-Schelp NPs

De Fe₃O₄-Au kern-schelp NPs werden gesynthetiseerd via een nano-emulsie methode. Het synthetische proces voor kern-schelp NPs bestaat uit twee stappen: (1) vorming van de Fe₃O₄ kern NPs en (2) coating van de Au schelp op de magnetische NPs. In de eerste stap, werden de Fe₃O₄ NPs bereid uit een gemengde oplossing van Fe(acac)₃ (0,1766 g of 0,5 mmol), 1,2-hexadecandiol (0,6468 g of 2,5 mmol), en blokcopolymeer (poly(ethyleenoxide)-poly(propyleenoxide)-poly(ethyleenoxide); PEO-PPO-PEO) (0,4 ~ 1,2 g) in octylether. De gemengde oplossing werd verwarmd bij 300 °C om de Fe precursor te reduceren. De vorming van Fe₃O₄ kern NPs werd voltooid door de verwarmde oplossing af te koelen. Het tweede proces werd continu uitgevoerd zonder zuiveringsproces na de vorming van de magnetische kern. Au precursors (0,2338 g of 0,62 mmol) en 1,2-hexadecandiol (0,88 g, 3,4 mmol) werden toegevoegd aan de emulsie bestaande uit Fe₃O₄ NPs, en de gemengde oplossing werd verwarmd bij 230 °C. Na afkoelen tot kamertemperatuur, werd de emulsie gecentrifugeerd en de kern-schelp NPs gescheiden.

Constructie van Recombinant Anti-Muc1-VHH 5-24 K10 Expressie Vector

Polymerase ketting reactie (PCR) werd uitgevoerd met de forward primer 5'-CCGAATTCGCCGATGTGCAGCTGACCGAG-3' en de reverse primer 5'-CGG CTCGAGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTGCCTGAGGAGACGGTGACCTG-3'. Het PCR product werd verteerd met EcoRI en XhoI en gel-gezuiverd met behulp van de QIA quick Gel Extractie Kit (QIAGEN, Valencia, CA, USA). Het gezuiverde PCR product werd gekloond in EcoRI/XhoI-verteerd pET-23a (Novagen, Darmstadt, Duitsland). Escherichia coli (E. coli) DH5α (RBC Bioscience, Xindian, Taiwan) werd getransformeerd met de resulterende constructie door heteshok en geselecteerd op LB agar platen bevattende 100 μg/mL ampicilline (Duchefa Biochemie, Haarlem, Nederland).

Expressie en Zuivering van Recombinant Eiwit

Om recombinant anti-Muc1-VHH 5-24 K10 eiwit te expresseren en te zuiveren, werden E. coli BL21 stammen (RBC Bioscience, Xindian, Taiwan) getransformeerd met pET-23a-anti-Muc1-VHH 5-24 K10. Bacteriën werden vervolgens gekweekt in LB bouillon bevattende ampicilline (100 μg/mL). Eiwitexpressie geïnduceerd door isopropyl β-d-thiogalactoside (IPTG) (Duchefa Biochemie, Haarlem, Nederland) bij een finale concentratie van 0,4 mM gedurende 5 uur bij 37 °C. Bacteriële pellets werden heropgelost in lyse buffer (50 mM NaH₂PO₄, pH 8,0; 300 mM NaCl) gevolgd door sonicatie op ijs gedurende 10 min. Gesonicteerde lysaten werden gecentrifugeerd bij 20.000×g gedurende 20 min bij 4 °C en onderworpen aan Ni-NTA His·Bind Resin (Peptron, Daejeon, Korea). His-getagde eiwritten die gebonden waren aan de resin, werden geelueerd met eluatiesbuffer (50 mM NaH₂PO₄, pH 8,0; 300 mM NaCl; 150 mM imidazol). Gezuiverd eiwit werd gescheiden op 15% SDS-PAGE gel.

Modificatie van Kern-Schelp Fe₃O₄-Au NPs

OPSS-PEG-NHS bij verschillende lengtes (2, 5, en 10 K) werd opgelost in 0,1 M natriumbicarbonaat voor activatie van de thiol groepen. Geactiveerde OPSS-PEG-NHS werd toegevoegd aan de oplossing van gesynthetiseerde kern-schelp Fe₃O₄-Au NPs en geschud gedurende 12 uur bij 4 °C. De thiol groepen van geactiveerde OPSS-PEG-NHS waren covalente gebonden aan het Au oppervlak van de kern-schelp NPs. Vervolgens werd een nanobody oplossing (0,25 mg/mL) toegevoegd aan de PEGyleerde Fe₃O₄-Au kern-schelp NPs gedurende 12 uur bij 4 °C. De amine groepen van de tien lysine (K) staarten aan het terminale einde waren covalente gebonden aan de NHS groepen van OPSS-PEG-NHS bij pH 8,3. Cy3 en Cy7.5 werden getagd aan de residuele amine groepen van de nanobody.

Internalisatie Curve

CT26 cellen werden gezaaid bij 5 × 10³ cellen per put in een heldere-bodem 96-put plaat en geïncludeerd in 250 μL cultuurmedium gedurende 24 uur bij 37 °C in 5% CO₂ in het donker. Het medium werd verwijderd, en 250 μL vers cultuurmedium bevattende 50 μg/mL Cy3-gelabelde Fe₃O₄-Au NPs en PEG-Cy3 of PEG-nanobody-Cy3-gelabelde NPs werden aan elke put toegevoegd. De cellen werden verder geïncludeerd voor verschillende perioden (0, 10, 20, 30, 60, 120, en 360 min). De cellen werden vervolgens drie keer gewassen met PBS om vrije NPs te verwijderen, en de fluorescentie van elke put werd gemeten met tryphaanblauw als een membraan-ondoorlaatbare fluorescentie kweller door SpectraMAX GEMINI (Molecular Devices, CA, USA). Elk experiment werd uitgevoerd met gelijke hoeveelheden NPs (50 μg/mL) en driemaal herhaald.

Inhibitie Test

CT26 cellen werden gezaaid bij 5 × 10³ cellen per put in een heldere-bodem 96-put plaat en geïncludeerd in 250 μL medium gedurende 24 uur bij 37 °C in 5% CO₂ in het donker. Het medium werd verwijderd en 250 μL vers cultuurmedium bevattende ofwel 20 μg/mL chlorpromazine (CPZ), 50 μg/mL nystatine, 20 μg/mL cytochalasine D, 25 μg/mL dynasore, 20 μg/mL BFA, 140 μg/mL monensine, of 5 μM anti-Muc1 Ab werden toegevoegd, en de cellen werden geïncludeerd gedurende 1 uur.

Het medium werd opnieuw verwijderd, en 250 μL cultuurmedium bevattende 50 μg/mL Cy3-gelabelde Fe₃O₄-Au NPs, PEG-Cy3-gelabelde NPs, PEG-nanobody-Cy3-gelabelde NPs, of vimentine-Cy3-gelabelde NPs werd toegevoegd.

Na 1 uur bij 37 °C en 5% CO₂, werden de cellen drie keer gewassen met PBS om vrije NPs te verwijderen, en de fluorescentie gemeten met tryphaanblauw als een membraan-ondoorlaatbare fluorescentie kweller door SpectraMAX GEMINI (Molecular Devices, CA, USA). Elk experiment werd uitgevoerd met gelijke hoeveelheden NPs (50 μg/mL) en viermaal herhaald.

Resultaten en Discussie

De kern-schelp NPs werden gesynthetiseerd door een gepubliceerde methode. Transmissie elektronenmicroscopie (TEM) waarnemingen in Fig. 1a, b tonen aan dat de Fe₃O₄-Au kern-schelp NPs bolvormig waren met een gemiddelde diameter van 13,5 nm en smalle grootteverdeling.

De toename van ~ 8,5 nm van de kern NP (Fe₃O₄) stamt van de coating van ~ 2,5-nm-dikke Au schelp op het kernoppervlak, resulterend in een kern-schelp NP. Een hoge-resolutie TEM afbeelding met snelle Fourier transformatie (FFT) analyse van de Fe₃O₄-Au kern-schelp NP is opgenomen in Supplementary Information Fig. S1.

Het in organisch oplosmiddel geproduceerde product werd gezuiverd met magnetische scheiding en overgebracht in water.

De kern-schelp NPs waren goed gedispergeerd en stabiel in water zonder enige oppervlaktemodificatie, dankzij residuele blokco-polymeren die op de NPs aanwezig waren.

Figuur 1c en d tonen de NPs in waterige oplossing voor en na toepassing van een extern magneetveld. Onder een extern magneetveld veranderden de kern-schelp NPs snel van een homogene dispersie (Fig. 1c) tot een heldere en transparante oplossing (Fig. 1d).

De absorptieband van de kern-schelp NPs werd onderzocht met UV-Vis spectrofotometrie. Zoals getoond in Fig. 1e, verscheen een absorptiepiek op ~ 530 nm, wat de aanwezigheid van Au op het oppervlak van de NPs aangeeft (Supplementary Information Fig. S2 bevat het resultaat van EDX data voor Fe₃O₄-Au kern-schelp NPs). Aangezien het monster gezuiverd was, toonden de optische resultaten de vorming van de kern-schelp structuur.

Magnetische hysteresis lussen werden verkregen door vibrerende sample metingen om de magnetische eigenschappen van de Fe₃O₄ kern en de kern-schelp NPs te onderzoeken. Beide NPs toonden superparamagnetisch gedrag met een coerciviteit van bijna 0 Oe bij kamertemperatuur (Fig. 1f).

Zoals gerapporteerd in eerdere werken, was de gevoeligheid van kern-schelp NPs hoger dan die van magnetiet NPs, wat deels te wijten kan zijn aan nabijheidseffecten en unieke ruimtelijke configuraties. Bovendien zijn de verzadigingsmagnetisaties van de kern NPs en de kern-schelp NPs ~ 37 emu/g en ~ 21 emu/g bij 10 kOe, respectievelijk. Het verschil in Ms stamt van het bestaan van een niet-magnetisch component (Au) in de kern-schelp NPs.

Het VHH 5-24 K10 gen was in-frame gekloond om pET-23a-anti-Muc1-VHH 5-24 K10 te produceren na PCR amplificatie (Fig. 2a). Het recombinante eiwit werd geëxprimeerd in E. coli BL21 dat getransformeerd was met pET-23a-anti-Muc1-VHH 5-24 K10 na inductie met IPTG en gezuiverd door Ni-NTA His·Bind Resin. Recombinant anti-Muc1-VHH 5-24 K10 werd gemakkelijk geëxprimeerd in E. coli als een oplosbaar 18-kDa eiwit. Uit een 1-L cultuur, verkregen we 1 ± 0,5 mg gezuiverd recombinant anti-Muc1-VHH 5-24 K10.

Het gezuiverde eiwit werd geverifieerd door 15% SDS-PAGE gel. Coomassie blauwe kleuring van het gezuiverde eiwit onthulde dat het > 95% zuiver was (Fig. 2b). De gesynthetiseerde Fe₃O₄-Au NPs werden in drie stappen gemodificeerd, namelijk PEGylatie, antilichaam tagging, en kleurstof labeling (Fig. 2c). Na elke modificatiestap werd de zeta potentieel gemeten om de succesvolle modificatie te bevestigen. Tabel 1 toont het effect van modificatie op de corresponderende zeta potentiealen. De zeta potentiaal van kaale kern-schelp NPs was -19,8 ± 6,68 mV. PEGylatie van NPs werd uitgevoerd met OPSS-PEG-NHS. Om een reeks nanokomplexen met verschillende groottes te produceren, werd OPSS-PEG-NHS met verschillende lengtes (2K, 5K, en 10K) gebruikt.

Na PEGylatie, werden de zeta potentiealen verlaagd (-44,9 ± 8,19 mV, -40,7 ± 7,88 mV, en -39,6 ± 8,74 mV voor 2K, 5K, en 10K, respectievelijk).

Interessant, na nanobody tagging, stegen de zeta potentiealen duidelijk (-38,5 ± 5,61 mV, -23,3 ± 8,61 mV, en -31,8 ± 7,37 mV voor 2K, 5K, en 10K, respectievelijk).

Na kleurstof tagging, stegen de zeta potentiealen ook (-12,5 ± 7,25 mV, -17,7 ± 3,94 mV, en -10,6 ± 4,72 mV voor 2, 5, en 10K, respectievelijk).

De zeta potentiaal van kaale Fe₃O₄-Au kern-schelp NPs was -19,8 ± 6,68 mV. Na PEGylatie, werd de zeta potentiaal verlaagd tot ongeveer -40 mV. Deze resultaten geven aan dat de PEG moleculen goed covalente gebonden waren aan de Au schelp van de kern-schelp NPs omdat PEG moleculen negatief geladen N-hydroxysuccinimide functionele groepen hebben. Tegenovergesteld, de zeta potentiaal steeg na kleurstof tagging aan de nanobody (-38,5 ± 5,61 mV voor NP-PEG2K-nanobody en -12,5 ± 7,25 mV voor NP-PEG2K-nanobody-kleurstof). Dit resultaat is redelijk omdat de recombinante nanobody tien lysine staarten aan het terminale einde heeft. Elk type nanobody werd gecategoriseerd door zeta potentiaal meting, en om antilichaam binding op de nanobody te bepalen, maten we de fluorescentie voor elk nanobody type.

Zoals getoond in Fig. 3, bevestigden we dat alle typen nanopartikelen en nanobodies goede cellulaire opname en internalisatie hebben in afwezigheid van inhibitor restricties. Een cellulaire internalisatie curve werd verkregen uit cellen geïncludeerd in aanwezigheid van 50 μg/mL Cy3-gelabelde Fe₃O₄-Au NPs, PEG-Cy3-gelabelde NPs, en PEG-nanobody-Cy3-gelabelde NPs voor verschillende perioden (tussen 0 en 360 min) na verwijderen media, wassen vrije NPs, en ten slotte meten van de totale fluorescentie van de cellen met tryphaanblauw (Fig. 3).

Volgens het resultaat van fluorescentie intensiteit meting, kunnen we bepalen dat de NPs geïternaliseerd werden in de cellen binnen 1 uur (Fig. 3a). De fluorescentie intensiteit van NP bereikte een maximum binnen 1 uur, en de fluorescentie intensiteit daalde geleidelijk na bereiken van een steady state. Hoewel er een lichte tijdverschil is afhankelijk van de aanwezigheid van Ab, was de fluorescentie intensiteit per kweektijd niet significant verschillend van het resultaat van kaale NPs (Fig. 3b). Zoals getoond in Fig. 3c, werd bevestigd dat het effect van Ab, door gebruik te maken van heterogeen Ab van de Muc1 en vimentine, verwaarloosbaar was in de cellulaire opname en internalisatie van NP.

Met WST-1 assay, werd de levensvatbaarheid (%) van CT26 mucine cellen afhankelijk van de concentratie en oppervlaktemodificatie van Fe₃O₄-Au kern-schelp NPs geschat na verschillende bloottijdstijden (Fig. 4a, b). De levensvatbaarheid van CT26 cellen toonde geen significante verschillen na 24 uur en 48 uur blootstelling, noch met varierende doses noch na oppervlaktemodificatie van de NPs. Cel levensvatbaarheid was groter dan 90% op zowel de kaale Fe₃O₄-Au NPs (Fig. 4a) als de oppervlakte-gemodificeerde NPs (Fig. 4b).

Figuur 5 geeft aan dat NPs de CT26 mucine cellen binnenkwamen via diverse endocytose pathways (clathrine-gemedieerde, caveolae-gemedieerde, en fagocytose/macropinocytose pathways). Interessant, Fig. 5b toont dat anti-Muc1 Ab ook voornamelijk de endocytose van PEG-nanobody-Cy3-gelabelde NPs beïnvloedde. Om het pathway van NP internalisatie te begrijpen, probeerden we endocytose pathways te inhiberen met specifieke chemische inhibitoren (Fig. 5). De pathways van endocytose waren bekend om in drie typen verdeeld te zijn: clathrine-gemedieerde, caveolae-gemedieerde, en macropinocytose/fagocytose.

In deze studie werden inhibitoren gebruikt als eerste benadering om de internalisatie van nanobody-getagde NPs te onderzoeken. CPZ (clathrine-gemedieerde endocytose inhibitor), nystatine (caveolae-gemedieerde endocytose inhibitor), dynasore (dynamine inhibitor), cytochalasine D (fagocytose/macropinocytose inhibitor), BFA (Golgi apparaat vernietiger), monensine (lysosom inhibitor), of anti-Muc1 Ab (receptor-/transporter-specifieke concurrent) werden geïncludeerd met cellen gedurende 1 uur. CPZ, nystatine, dynasore, en cytochalasine D beïnvloedden de endocytose van NPs (Fig. 5a).

De targeting groep is de sleutel tot het succes van kanker-targeting, wat uitzonderlijk belangrijk is in kankertherapie. Voor targeting, is effectieve oppervlaktemodificatie heel belangrijk om therapeutische efficiëntie te verhogen en bijwerkingen te beperken. Nanobody-getagde Fe₃O₄-Au kern-schelp NPs werden succesvol gemaakt van de gesynthetiseerde NPs en recombinante nanobody. Tabel 1 toont duidelijk dat elke modificatiestap succesvol uitgevoerd werd.

Cel levensvatbaarheid is een van de essentiële elementen voor de biologische toepassing van nanomaterialen. De cel levensvatbaarheden waren groter dan 90% op de kaale kern-schelp NPs en gemodificeerde NPs (Fig. 4a, b). Deze resultaten impliceren dat kaale Fe₃O₄-Au NPs en gemodificeerde NPs geen significante concentratie- en modificatie-afhankelijke cytotoxiciteit veroorzaakten en dat de gemodificeerde NPs geschikt waren voor biologische toepassing.

De studies van internalisatie efficiëntie en inhibitor effect van NPs bieden belangrijke informatie om de mechanismen te begrijpen waarmee NPs cellen binnenkomen. PEGyleerde NPs werden relatief langzaam geïternaliseerd in cellen vergeleken met kaale NPs, maar nanobody-getagde NPs werden iets sneller geïternaliseerd in cellen dan kaale NPs (Fig. 3a, b). Omdat PEGylatie een bekende oppervlaktemodificatie methode is om internalisatie van NPs te voorkomen, is de internalisatieneiging van PEGyleerde NPs gemakkelijk te verklaren. Bovendien induceerde de nanobody de endocytose van NPs. Om de specificiteit van de nanobody te controleren, bevestigden we de internalisatiesnelheid van vimentine Ab-getagde NPs. Interessant, vimentine Ab-getagde NPs bevorderden geen cellulaire internalisatie (Fig. 3c).

Deze resultaten geven aan dat de nanobody effectief de internalisatie van nanomaterialen in CT26 mucine cellen kan induceren en impliceert dat de internalisatieneiging gecontroleerd kan worden met specifieke modificatie van het buitenste membraan van NPs. Bovendien werden de mechanismen van de endocytose van nanobody-getagde NPs duidelijk getoond via inhibitietesten en confocal microscopie imaging. De fotoluminescentie van zowel de nanobody-getagde NPs als de niet-getagde NPs toonden vergelijkbare dalende waarden wanneer gekweekt met CPZ, nystatine, of dynasore (Fig. 5a, b). CPZ, nystatine, en dynasore spelen een rol in het inhiberen, respectievelijk, clathrine-gemedieerde endocytose, caveolae-gemedieerde endocytose, en dynamine, wat een groot GTPase is geïmpliceerd in het uitknippen en afsnijden van nascente vesikels van oudermembranen. Daarom daalden de fotoluminescentie waarden in beide gevallen snel omdat dynamine nauw verbonden is met de productie van vesikels voor clathrine-gemedieerde en caveolae-gemedieerde endocytose. Zoals getoond in Fig. 5a, toonden zowel niet-getagde (Fig. 5a) als nanobody-getagde NPs (Fig. 5b) snelle dalingen in fotoluminescentie.

In het bijzonder, toonden de nanobody-getagde NPs significant lagere fotoluminescentie waarden in CPZ, nystatine, en dynasore. Bovendien bevestigden we dat de niet-getagde NPs sterker beïnvloed waren dan nanobody-getagde NPs toen cytochalasine D toegepast werd, wat een cel-doorlaatbare toxine is die polymerisatie van actine filamenten blokkeert voor fagocytose. Deze resultaten impliceren dat niet-getagde NPs geïternaliseerd werden via meerdere mechanismen zoals clathrine-gemedieerde endocytose, caveolae-gemedieerde endocytose, en fagocytose. Gevolglijk hangt de cellulaire internalisatie van nanobody-getagde NPs af van clathrine-gemedieerde en caveolae-gemedieerde endocytose. Bovendien werd de hoeveelheid cellulaire opname van nanobody-getagde NPs aanzienlijk verminderd toen cellen gekweekt werden met het Muc1 antilichaam (Fig. 5b). Dit resultaat geeft aan dat het vrije Muc1 antilichaam een rol speelt als concurrent van de nanobody op de gemodificeerde NPs in hechten aan het CT26 celmembraan en dat het Muc1 antilichaam een belangrijk deel speelt in de celinternalisatie van de gemodificeerde NPs. Eigenaardig, toonden vimentine Ab-getagde NPs duidelijke verschillen vergeleken met nanobody-getagde NPs in termen van inhibitievermogen. De fotoluminescentie van vimentine-getagde NPs bleef onveranderd onder meervoudige inhibitietesten, wat aangeeft dat de NPs minimaal beïnvloed werden door nystatine, dynasore, cytochalasine D, en zelfs het Muc1 Ab. Dit fenomeen kan bewijs zijn van de effectiviteit van vimentine, wat biochemisch bevestigd is om fagocytose krachtig te beïnvloeden. Gevolgelijk geeft dit resultaat aan dat het Muc1 Ab specifieke moleculen kan targeten en specifieke endocytose kan controleren.

Zoals getoond in Fig. 6, werden analoge resultaten verkregen toen de cellen behandeld werden met Cy7,5-gelabelde kaale kern-schelp NPs en PEG-nanobody-getagde NPs, wat vergelijkbare cellulaire opname in beide gevallen in afwezigheid van dynasore inhibitie aangeeft. Dynasore inhibitie induceerde duidelijk lagere cellulaire internalisatie van de PEG-nanobody-getagde NPs vergeleken met kaale NPs (Fig. 6b, onderste rij). Deze resultaten impliceren dat er twee endocytose mechanismen zijn, namelijk niet-specifieke endocytose van kaale NPs en beperkte endocytose van nanobody-getagde NPs via het dynamine molecuul. Eenmaal de nanobody hecht aan het externe celmembraan, konden de nanobody-getagde NPs gemakkelijk door het celmembraan passeren vanwege de gelijktijdige activatie van de clathrine- en caveolae-gemedieerde mechanismen. Gevolgelijk kunnen we aannemen dat de hoofmechanismen zowel clathrine- als caveolae-gemedieerde endocytose zijn voor de internalisatie van nanobody-getagde NPs in CT26 mucine cellen.

Conclusies

Nanomaterialen voor kanker targeting en controleerbare insertie van exogene materialen zoals geneesmiddelen, genen, en peptiden zijn cruciale vooruitgang in biomedische toepassingen. Deze bekende maar creatieve concepten kunnen strategieën bieden voor nieuwe therapeutische methoden. In dit papier demonstreren we verbeterde cellulaire opname van Fe₃O₄-Au kern-schelp NPs na PEGylatie met het Muc1 antilichaam. De hoofpendocytose mechanismen van nanobody-getagde NPs werden gedemonstreerd, wat de mogelijkheid van controleerbare specifieke endocytose in darmkankercellen toont. Deze bevindingen bieden inzicht in de targeting tussen nanobody-getagde NPs en darmkankercellen om het ontwerp van hoge-efficiënte targeting dragers te ondersteunen.