Optimaliseren van NIR-Getriggerde Hyperthermie met Cs_0.33WO₃ Nanopartikels voor HepG2 Leverkankerbehandeling

Samenvatting

Hyperthermie is een van de meest patiëntvriendelijke methoden om kanker te behandelen vanwege de non-invasiviteit, minimaal geïnduceerde bijwerkingen en toxiciteit, en gemakkelijke implementatie, wat de ontwikkeling van nieuwe therapeutische methoden zoals fotothermisch getriggerde doseringssystemen aanmoedigt. Dit onderzoek bestudeert de variabelen van fotothermische effecten van Cs_0.33WO₃ nanopartikels (NP's), de bestralingsduur, optische vermogensdichtheid en NP-concentratie, op de HepG2 leverkankercellijnen in vitro, wat leidt tot de formulering van een nabij-infrarood (NIR)-bestraalde thermische dosis. Uitdrukkelijk, de NP's met deeltjeskenmerkgrootte van 120 nm werden gesynthetiseerd door een reeks oxidatie-reductie (REDOX) reacties, thermische aanlaas en nat-malingsprocessen, en de daaropvolgende karakterisering van fysieke, compositionele, optische, fotothermische eigenschappen werden onderzocht met dynamische lichtverstrooiing (DLS), energiedispersieve röntgenspectroscopie (EDS), scanning en tunnel elektronenmicroscopie (SEM en TEM), röntgendiffractie (XRD) en zichtbaar-nabij-infrarood (VIS–NIR) fotospectroscopie. De cytotoxiciteit van de NP's en de bestralingsparameters werden verkregen voor de HepG2 cellen. Door de cellen te incuberen met de NP's, werd de toestand van endocytose geverifieerd, en de afhankelijkheid van de cellulaire overlevingssnelheid van de variabele parameters van fotothermische dosis werd bepaald terwijl de mediumtemperatuur van de celbevattende cultuurschaal bij de menselijke lichaamstemperatuur van ongeveer 36,5 °C werd gehouden.

Inleiding

Wereldwijd, in het jaar 2018 alleen, eisten wrede kankerziektes ongeveer 10 miljoen levens en voegden een geschatte 18 miljoen nieuwe gevallen toe [1]. Tot nu toe, hoewel chemotherapie, bestraling, chirurgische verwijdering of een op maat gemaakte combinatie van deze drie verantwoordelijk zijn voor een verbetering van de 5-jaars overlevingscijfer van iets meer dan 40% van behandelde kankerpatiënten [2, 3], veroorzaken de giftige en schadelijke aard van chemicalen en ionenbombardement onvermijdelijk talloze bijwerkingen zoals haaruitval, cardiotoxiciteit, onvruchtbaarheid, chromosoomafwijkingen en nog veel meer [4, 5]. Dergelijke levensbedreigende gevolgen hebben de ontwikkeling van patiëntvriendelijke therapeutische geneesmiddelen inclusief NP-geïntegreerde componenten sterk aangejaagd.

Nanotechnologie op basis van eigenaardige materiaalsystemen, structuren, vorm en atomaire stoechiometrie op grootteschaal onder 100 nm levert ongekende chemische, fysieke en biochemische eigenschappen op versterkt door de verschijnselen van kwantisering en heeft al pre-klinische en in vitro toepassingen gevonden in veel takken van de biomedische wetenschap [6, 7]. Ondanks de nadelen van chemotherapie, verbeteren NP's die als leveringsdragers dienen de selectiviteit van medicijnafgifte in ziekte tumoren, vergemakkelijken medicijnopname door tumorcellen en reduceren de cumulatieve toxiciteit in gezond weefsel aanzienlijk [8, 9]. Ook wordt de beeldkwaliteit geproduceerd door een reeks NP-gebaseerde beeldgevingsmodaliteiten aanzienlijk verbeterd met hogere gevoeligheid, fijner ruimtelijke resolutie en betere dieptedoorpenetratie om bio-distributie te onthullen, medicijnopname te monitoren, tumoren te lokaliseren en de effectiviteit van de behandeling te evalueren [10]. Naast de diagnostische functie, kunnen de NP's, wanneer geharneerd met inherente fysieke eigenschappen, zoals radiofrequentie (RF)-ablatie of fotothermisch gegenereerde hyperthermie, verdere schade op de gewenste locatie induceren met verhoogde efficiëntie [11,12,13], waarvan de tweede algemeen bevorzugd wordt vanwege de locatiespecifieke dosering, lagere pijngraad, lage bijwerkingen en veel gereduceerd risico op weefselverbranding.

Tot nu toe omvatten de NP-materiaalsystemen die in staat zijn hyperthermie te induceren bij foto-bestraaling goud (Au), cesiumtungstate (CsWO₃), ijzeroxide, koper sulfide, grafeen en koolstofbuis en hebben de toepasbaarheid aangetoond van het opleggen van dodelijke schade aan kankercellen door de extracellulaire of intracellulaire temperatuur in situ te verhogen [14,15,16,17,18]. Net als NP-verbeterde RF-ablatie, is het niveau van de invalsvermogensdichtheid van fotonische bronnen een kritisch kwestie voor klinische veiligheid en patiëntcomfort [11], en het is ge manifesteerd dat de maximale blootstellingslimiet voor menselijke huid in het bereik van VIS en NIR golfengte tussen 400 tot 980 nm is van 0,2 tot 0,726 W/cm² volgens de Internationale Commissie voor Non-Ioniserende Stralingsbescherming (ICNIRP) gepubliceerd in 2013 [19]. Niettemin waren de meeste van de optische vermogensdichtheden gerapporteerd uit eerdere in vitro kankercelstudies ver boven de veiligheidslimiet voor huidweefsel, wat een zwaargewicht kan zijn wanneer het aankomt op het behandelen van interne biologische weefsels met een lage drempel voor foto-bestraaling voor kwetsbaarheid. Bijvoorbeeld, de NIR optische vermogensdichtheid van goud (Au) NP's die effectieve destructie van kankercellen demonstreerden varieerde van 2 tot 80 W/cm² bij bestraling van niet meer dan 10 min [13, 14, 20,21,22]. Op dezelfde manier vereiste een assortiment van andere materiaalsystemen zoals grafeenoxiden [18], ijzerplatinum (FePt) [23] en NaYF₄:Yb,Er nanokristallen [24] niet minder dan 150 mW/cm² voor een instrumentale implementatie.

Als een relatief minder onderzocht materiaal voor in vitro experimenten, rapporteerden enkele studies uitwissing van halskankercellen (Hela) door NIR-bestraalde CsWO₃ NP's met ten minste 0,72 W/cm² [15, 25, 26] wat in de buurt ligt van de blootstellingslimiet van huidweefsel voor NIR golfengte ingesteld door ICNRP en schadelijke effecten kan veroorzaken voor gezonde weefsels onder een verlengde blootstellingsduur [19]. Bovendien was de temperatuur van de cultuurmedia gegenereerd door de combinatie van behandelingsdosis van NP-concentratie, duur van foto-blootstelling en optische intensiteit, in eerdere studies, wel boven 40 °C wat onhoudbaar is voor gezonde menselijke cellen, en de sterftecijfers van kankercellen werden niet in grote detail beschreven.

CsWO₃ NP is uitzonderlijk absorberend in het bereik van NIR golfengte van 800 nm tot 2400 nm [27] en is functioneel geschikt voor biomedische toepassing. Ondanks de gedemonstreerde uitstekende effectiviteit in het elimineren van kankercellen, is de cytotoxiciteit nog grotendeels onbekend en ontbreekt de voorziening van een doseringsformule van NP-concentratie met lage cytotoxiciteit, korte bestralingsduur en optische vermogensdichtheid binnen de veiligheidslimiet van foto-blootstelling voor huidweefsel.

Onderzoeksstudie hierin probeert de haalbaarheid in vitro te beoordelen van het uitroeien van HepG2 leverkankercellen gekweekt in een petrischaal met een diameter van 5,2 cm met behulp van non-cytotoxische NP-concentratie en optische vermogensdichtheid wel binnen de foto-blootstellingslimiet voor huidweefsel terwijl de temperatuur van de celcultuurmedia op de normale menselijke lichaamstemperatuur van 36,5 °C wordt gehandhaafd. In detail, Cs_0.33WO₃ NP's met een gemiddelde kenmerkgrootte gecentreerd rond 120 nm werden gesynthetiseerd met een reeks redox, thermische aanlaas en nat-malingsprocessen, en gekarakteriseerd met zijn oppervlaktemorfologie, kristallijnheid, en optische en tijdelijke fotothermische eigenschappen. Daarnaast werden de fotothermische effecten van variabele dosisparameters, bestralingsduur, concentratie van de NP's en optische vermogensdichtheid van NIR bestraling opererend bij de centrale golfengte van 980 nm, op de overlevingssnelheid van de HepG2 kankercellen onderzocht en beoordeeld om een combinatie van veilige behandelingsdosis te ontwerpen.

Methoden

In dit onderzoek werd de 102e generatie van HepG2 leverkankercellijnen afkomstig van humane primaire tumor gekweekt als experimenteel model om de cytotoxiciteit opgelegd door de NIR-bestraalde zelfgemaakte Cs_0.33WO₃ NP's te evalueren en de therapeutische effectiviteit van diverse thermische dosis wel binnen de veiligheidslimiet voor huidweefsel blootstelling en bij een non-toxische NP-concentratie te beoordelen.

Synthese van Cs_0.33WO₃ NP's

Linkerkant van Fig. 1 illustreert het diagrammatische flowchart van de syntheseprocedure voor cesiumtungstenoxide (Cs_0.33WO₃) NP-materiaal. Kort gezegd, de precursorchemicaliën, ((NH₄)₂WO₄) (Alfa Aesar, 99,9% zuiverheid) en CsCl (Alfa Aesar, 99,9% zuiverheid) werden apart opgelost in 100 ml DI water en daarna gemengd bij 25 °C onder constant roeren met 250 omwentelingen per minuut (rpm) met een magnetisch aangestuurde roerstab voor één uur (hr). Na het roeren was klaar, werd de temperatuur van de mengseloplossing-bevattende bekerglas aangepast tot 180 °C en gebakken tot de waterinhoud van de oplossing volledig was verdampt. Het resulterende gedroogde witte poeder was de finale precursor van Cs_0.33WO3 materiaal. Met de koeler aangezet, werd de precursorpoeder-bevattende kwartsboot in het centrum van een hoge-temperatuur ovenbuis geladen, en de druk binnen de ovenbuis werd gebracht tot 0,08 torr. Daarna werd de precursor verhit bij 500 °C temperatuur naast de invoer van een combinatie van gassen, H₂ en N₂, in een verhouding van 90 tot 10 standaard kubieke centimeter per minuut (SCCM) om redox reactie te faciliteren. Na 1 uur werd de inlaat van H₂ gas uitgezet, de stroom van N₂ gas aangepast tot 100 SCCM, en de temperatuur van de oven verhoogd tot 800 °C voor thermische aanlaas voor één uur. Na voltooiing van de processen werden de koeler en temperatuurgecontroleerde oven uitgezet, en de kwartsboot gekoeld tot het omgevingstemperatuur bereikte en uit de ovenbuis verwijderd. Het resulterende donkerblauwe poeder verkregen uit de kwartsboot is het micron (µ)-grootte Cs_0.33WO₃ poeder. Om de kenmerkgrootte van de poederkorrels verder te verkleinen, werd 150 g van een mengseloplossing samengesteld uit 15 g van het µ-poeder, 3,8 g van een copolymeer-gebaseerd dispersiemiddel ter preventie van deeltjesagglomeratie, 10 μl anti-schuimmiddel en D.I. water bereid, in een monsterkom gegoten die 600 g zirconia kralen bevatte en gemonteerd in de kamer van een nanomalingsapparatuur (Justnanotech Co., Taiwan). Met de snelheid en temperatuur ingesteld op respectievelijk 2400 omwentelingen per minuut (RPM) en 15 °C, worden de NP's geproduceerd door het µ-poeder te malen met 0,1 mm ZrO₂ kralen gedurende 4 uur, en met 0,05 mm ZrO₂ kralen voor nog eens 4 uur. De totale duur van elk malingsproces overschrijdt niet 4 uur om excessieve vloeistofviskositeit en eventuele erratische veranderingen van de fysieke maten van het materiaal te vermijden. De finale oplossing na het malingsproces werd gezeefd door een 0,22-μm poriënfilter voor alle daaropvolgende karakterisering en experimenten. De fluorescente versie van Cs_0.33WO₃ NP's (fNP's) werd gemaakt met het volgende protocol. Een oplossing gemaakt van 2 ml fluoresceïne in een concentratie van 28 mg/ml en 2 ml Cs_0.33WO₃ NP-oplossing bij 1,5 mg/ml werd in een bekerglas bereid en in de kom van een ultrasoon schudder geplaatst voor 15 min. Vervolgens werden de NP-oplossing en het dispersiemiddel in een verhouding van 1:1,25 gemengd en ondergingen een ultrasoon schudding voor 15 min. De resulterende oplossing werd vervolgens gewassen met D.I. water en gecentrifugeerd bij 10.000 rpm voor 15 min. en tweemaal herhaald voordat het in gebruik genomen werd.

Materiaal karakterisering

Daarna werd de karakterisering van Cs_0.33WO₃ NP's inclusief NP's statistische kenmerkgroottes, kristallijne structuur, structurele morfologie, contourvorm, VIS–NIR foto-absorptie uitgevoerd met zeta potentiaal analyse (ZS90, Malvern, UK), XRD (D2 Phaser, Bruker AXS GmbH, Duitsland), SEM (SU-5000, Hitachi, Japan) in combinatie met ingebouwde energiedispersieve spectrometrie (EDS), TEM (JEM-2100F, JEOL, Japan), dynamische lichtverstrooiing (DLS) (Delsa Nano C, Beckman Coulter, VS), UV–VIS–NIR spectrometer (V-750, Jasco, Japan), respectievelijk. De XRD-spectra werden verkregen door de röntgenstraling op de monsters te scannen binnen een hoekspanne van 20° tot 80° met een scansnelheid van 4° per min. Het signaal van de scanningshoek-afhankelijke diffractie van het monster werd bepaald en vergeleken met het standaard XRD-spectrum van Cs_0.32WO₃ van het Joint Committee on Powder Diffraction Standards (JCPDS) kaart Nr. 83-1334. Om de temporele afhankelijkheid van de NP's fotothermische eigenschap te bevestigen, werd een simpeel experimenteel apparaat samengesteld bestaande uit NIR laser van 980 nm golfengte en een temperatuurmeetvoorziening om de toestand van temperatuur gegenereerd door de NIR-bestraalde oplossing te ondervragen. De te onderzoeken oplossingen omvatten de D.I. water-verdunde NP's oplossing en het mengsel van NP's oplossing in celkweekmedia. De diameter van de optische bundel voor monsters in de petrischalen werd uitgebreid om het hele oppervlak van de petrischaal te bedekken, producerend 0,05 W/cm² in geschatte optische vermogensdichtheid, anders ongewijzigd bij 2 W/cm². Een optische opstelling getoond op rechterpaneel van Fig. 1 wordt gebruikt om NIR bestraling uit te voeren. In het hart van het optische systeem zit een NIR laserbundel gericht naar een bi-concave lens die de bundeldiameter uitbreidt van 4 mm tot 5,2 cm, equivalent aan de oppervlaktediameter van een petrischaal geplaatst op een warmteplaat ingesteld op 36,8 °C, wat een fysiologische temperatuur is voor celdeling; ook wordt de petrischaal omringd door een kunststof cilinderbehuizing om de temperatuur van de omgevingsomgeving en het medium te helpen equaliseren. Bijlage 1: Fig. S1 illustreert de mapping van optische intensiteit van de NIR laserbundel gemeten bij de uitgang van de bundelopening wat aangegeven wordt door een rode pijl naast de laserbundel in Fig. 1. Het bundelprofiel presenteert 3D verdeling van optische intensiteit en verifieert de uniformiteit van het lichtveld over de gehele opening van de petrischaal.

Cytotoxiciteit en fotothermische assays

Om de cycli van celkweek te beginnen, werd 500 ml mediumoplossing samengesteld uit 440 ml van Ham's voedingsmengsel F-12 en Dulbecco's gemodificeerde Eagle's essentiële medium (HDMEM), 50 ml foetale runderserum (FBS), 5 ml L-glutamine en 5 ml P/S (Penicilline–Streptomycine), wat gesteriliseerd werd door een meshfilter met poriënmaat van 0,22 μm, bereid. De cellen-bevattende petrischalen, 10 cm of 5,2 cm in diameter, corresponderend gevuld met 8 ml en 2 ml van het medium, werden gebruikt voor primaire en subkweek en geïncubeerd in een incubator geconditioneerd met 5% CO₂ en bij een temperatuur van 37 ̊°C. De observatie van de celdeling en een vernieuwing van het kweekmedium werden eens in de twee dagen gedaan.

Om de overlevingssnelheden te verkrijgen voor de gevallen van celassays die omvatten (1) controle zonder externe input, (2) enkel NIR bestraling, (3) incubatie met NP's, en (4) incubatie met NP's samen met een daaropvolgende NIR bestraling, werd het kweekmedium in de cultuurschaal afgezogen, en 0,4 ml trypsine toegevoegd aan de cultuurschaal en in de incubator geplaatst voor ongeveer 10 min. Eenmaal losmaking van cellen van schaalwanden bevestigd, werd 10 μl van het celbevattende medium getrokken uit de cultuurschaal en toegevoegd aan 10 μl trypsine blauw oplossing in een microcentrifugetje, en een verwijdering van de overblijvende drijvende NP's werd gedaan door meerdere keren te wassen met fosfaatbufferoplossing (PBS). Daarna werd celtelling uitgevoerd door een tellingsplaat te vullen met 10 μl van het gekleurde celoplossing door een injectiegat, en de cellen kunnen worden waargenomen op het brandvlak van een stereomicroscoop en geteld met een handmatige teller; elk datapunt gepresenteerd in alle figuren betreffende celoverlevingssnelheid was een gemiddelde van drie experimentele proeven (N = 3) plus de marge van standaarddeviatie.

Om de beoordeling van de NP's cytotoxiciteit en de fotothermische effecten op de cellulaire overlevingssnelheid voor te bereiden, werd het medium in de 5,2 cm schaal verwijderd, opnieuw gevuld met het juiste hoeveelheid NP-oplossing in het nieuwe medium om een reeks testconcentraties te maken, 2 mg/ml, 1,5 mg/ml, 1 mg/ml en 0,5 mg/ml, en vervolgens geïncubeerd voor één dag vóór het experiment.

Vóór de fotothermische assay, werd de beoordeling van cytotoxiciteit uitgevoerd om de reactie van de cellen op een reeks NP-concentratie te onderzoeken en werd als volgt gedaan. Het medium bevattende de cellen en NP's werd uit de incubator gehaald en geaspireerd. Eén milliliter voorverwarmde PBS werd gebruikt om de kankercellen te wassen en overblijvende drijvende CsWO₃ NP's die geen endocytose ondergingen, af te zuigen, de procedure waarvan meerdere keren herhaald werd om ervoor te zorgen dat eventuele potentiële cellulaire sterfte niet wordt veroorzaakt door de NP-geïnduceerde temperatuurstijging in het nieuwe medium. Na de fotothermische behandeling, werd de telprocedure dan geïmplementeerd voor de cytotoxiciteit en fotothermische assay op de cellen.

Resultaten

De optische absorptie en fotothermische eigenschappen van Cs_0.33WO₃ nanomaterialen zijn sterk afhankelijk van kristallijne structuur, post-aanlaastemperatuur, atomaire stoechiometrie en deeltjeskenmerkgrootte [28, 29].

Om de oppervlaktemorfologie van het Cs_0.33WO₃ µ-poeder te karakteriseren, werden SEM-beelden met 10.000X vergroting verkrezen voor visuele bevestiging van de iconische structuur van kolomnair hexagoon aangegeven door een rode pijl in Fig. 2a. Daarnaast tonen de TEM-beelden de contourvorm en kenmerkgrootte van het µ-poederkorrel in Fig. 2b waar de kenmerkgrootte rond 1 μm of minder is. De NP's staartachtige geometrie en de DLS-verdelingshistogram van nanoschaal kenmerkgrootte gecentreerd rond 120 nm werden ook geverifieerd en gepresenteerd in Fig. 2c en de bijbehorende inset TEM-afbeelding. Ook wordt de kristallijke karakterisering van het µ-poeder en NP's met XRD gepresenteerd in Fig. 2d. Zoals kan worden waargenomen uit het XRD-spectrum van het µ-poeder op het bovenste paneel, de iconische kristallisatievlakken langs (002), (102), (200), (112), (202), (212), (004), (220), (222), (204), (400) en (224) komen goed overeen met het standaardspectrum van Cs_0.32WO₃ van het Joint Committee on Powder Diffraction Standards (JCPDS) kaart Nr. 83-1334. Wanneer de kenmerkgrootte van het µ-poeder reduceert tot 120 nm, worden de intensiteiten van alle diffractiepieken monotoon gereduceerd, en sommige karakteristieke pieken die sterke NIR-absorptie aangeven, zoals vlakken (102) en (220), zijn onzichtbaar in het spectrum. Evenzo bevestigt de identificatie van de atomaire bestanddelen, cesium (Cs), wolfraam (W) en zuurstof (O), getoond in Fig. 2e, niet alleen hun atomaire aanwezigheid, maar authenticeert ook de verhouding van atomaire percentages van Cs tot W, 0,315, nauw gelijkend de initieel ontworpen stoechiometrie.

Bovenop materiaalkarakterisering, werden de NP's optische absorptiespectra en de tijdsverloop fotothermische modulatie in temperatuur gemeten en gepresenteerd in Fig. 3. In (a, b), wordt de afhankelijkheid van NIR-absorptie en de profielen van temperatuurstijging geïnduceerd door NIR-bestraalde NP-oplossing als functie van NP-concentratie afgebeeld, waar het tijdsverloop temperatuurplot van 1 mg/ml, bijvoorbeeld, 40 °C bereikt, en minstens 1 uur stabiel blijft, wat de fotothermische stabiliteit en duurzaamheid van het materiaal bevestigt. Evenzo illustreert het tijdsverloop temperatuurprofiel in Fig. 3c 5 herhalende cycli binnen 190 min, wat de fotothermische responsiviteit van het NP-materiaal verifieert. In Fig. 3d, de temporele temperatuurprofielen van het kweekmedium en NP-geïncorporeerd kweekmedium, uitgehaald uit de incubator, geplaatst op de warmteplaat en onderworpen aan NIR-bestraaling, stabiliseren rond 37 °C gedurende 10 min., en de temperatuur van de NIR-bestraalde zuivere NP-oplossing stijgt van 24,6 °C tot 33,6 °C na 10 min. Daarmee, in overweging van de NP's fotothermische functionaliteit, werd de NIR-bestraaling voor het volgende experiment uitgevoerd gedurende 10 min, 30 min en 60 min, met behoud van robuustheid van de NP's tijdens de experimentele sessie en potentieel toepasbaar op pre-klinische studies.

Vervolgens werd de non-toxische dosis van experimentele parameters inclusief de duur van NIR-bestraaling en NP-concentratie bepaald door de cellen te bestralen gedurende 1 uur en 2 uur bij 50 mW/cm² en door directe interactie met de NP's van 0,5 mg/ml, 1 mg/ml, 1,5 mg/ml en 2 mg/ml in concentratie, wat afgebeeld is in Fig. 4a, b, respectievelijk. De celoverlevingssnelheid blijft goed boven 95% gedurende 2 uur NIR-bestraaling, wat de non-toxiciteit van de cellen voor langdurige blootstelling aan de 980 nm foton bevestigt, en ook werd de non-toxische NP-concentratie onder 1,5 mg/ml bepaald.

Het doel van doseren van de kankercellen bij 1,5 mg/ml of lager, wat nauwelijks schadelijk effect heeft op HepG2 cellen, is om de effecten van fotothermische dosis op de kankercellen te onderzoeken zonder de implicatie van de inherente toxiciteit van de NP's. Om te onderzoeken of de NIR-bestraalde NP's een haalbare oplossing kunnen zijn voor het elimineren van kankercellen, werden de cellen geïncubeerd met NP's bij 1,5 mg/ml voor een dag, en vervolgens blootgesteld aan de NIR-straling gedurende 1 uur. Zoals te zien is in de helder-veld (BF) optische afbeeldingen van Fig. 5d–f is het aantal cellen duidelijk verminderd wanneer de blootstellingstijd 1 uur (e) of 2 uur (f) duurt. Kwantitatief daalt de overlevingssnelheid monotoon van 84,2% tot 58,4% naarmate de bestralingsduur toeneemt van 10 min. tot 1 uur, en een lineaire trendlijn past goed onder de verspreide datapunten, wat 20% overlevingssnelheid voorspelt wanneer de bestraling 2 uur duurt. Bovendien geeft Fig. 5h aan dat voor 1 uur bestraling, de overlevingssnelheid daalt van 73 tot 58% naarmate de optische vermogensdichtheid toeneemt van 12,5 tot 50 mW/cm², wat de functionaliteit van de NIR-bestraalde NP's als fotothermische trigger in de destructie van kankercellen bevestigt.

Verder werd de onzekerheid over of dergelijke fotothermische actie plaatsvond op een intra-cellulaire of extra-cellulaire manier aangepakt door de fNP's te bereiden, dezelfde was- en incubatieprocedure uit te voeren, en eventuele intracellulaire aanwezigheid van de fNP's te observeren. Figuur 6 illustreert confocal BF (b, e) en fluorescente (a, d) afbeeldingen en hun gesuperponeerde composieten (c, f) van de cellen geïncubeerd met en zonder de fNP's. Kennelijk vertonen de cellen zonder incubatie van fNP's als controle verwaarloosbare groene fluorescentie, wat voornamelijk toegeschreven wordt aan de cellulaire autofluorescentie, in scherpe contrast met de experimentele groep waar de verdeling van groene fluorescentie alomtegenwoordig is in alle cytoplasma gevonden in de afbeelding. De gemiddelde fluorescentie-intensiteiten in de afbeeldingen van controle en experimentele monsters werden ook gekwantificeerd en gepresenteerd in het histogram van Fig. 6g waar de fluorescente van fNP's die endocytose ondergingen ten minste negenvoudig zo sterk is als de controle.

Discussie

Het concept van therapeutische hyperthermie met behulp van elektromagnetische golven bij het genezen van kankerziektes dateert terug tot de vroege 1900s en slag erin sommige vormen van maligniteiten te laten teruggaan, maar echter, vervaagde het door de bruikbaarheid van koortsverwekende antibacteriële middelen en het gebrek aan nauwkeurige toegankelijkheid aan lokale tumoren van belang in situ [30]. Pas in de jaren 1980 werd het belang hersteld met diverse in vitro studies die veel aspecten van metabolische veranderingen, verandering van tumormicrocirculatie en zuering na hyperthermiebehandeling ontdekten die dodelijke effecten op de kankercellen produceerden [31]. Mechanistisch, naast directe cytotoxiciteit waarbij kankercellen necrose ondergaan met een afnemende apoptose wanneer de toegepaste temperatuur > 42 °C is, maken de verminderde bloedstroomsnelheid in associatie met lagere koelingscapaciteit en lage pH (< 6,8) de kankercellen vatbaarder voor verhit en gevolglik een hogere cel-dodende snelheid [32, 33]. Echter, klinisch, vanwege het eeuwenoude nadeel van onnauwkeurige niet-specifieke lokalisatie, vond hyperthermie alleen verhoogde therapeutische effectiviteit wanneer toegepast tegelijkertijd met chemo- of radiotherapieën [34, 35].

De NP-gebaseerde materialen die nauwkeurige targeting en monitoring toelaten, en een breed scala aan fysieke eigenschappen hebben zoals oppervlaktelading, fluorescentie, fotothermische conversie, passen perfect in de niche van zo'n onnauwkeurigheid in hyperthermie toepassing. Echter, ondanks de bewezen bruikbaarheid van veel NIR-bestraalde NP-materialen in kankercelstudies, wordt de veiligheidslimiet van foto-blootstelling vaak niet goed onderzocht zoals in het geval van CsWO₃ NP's. CsWO₃ NP's, hoewel, zoals getoond in Fig. 4b, relatief lage cytotoxiciteit heeft bij 1,5 mg/ml vergeleken met een handvol populaire NP-materialen, zoals Ag, Au, grafeen, waarvan de drempels liggen op de schaal van 1 μg/ml [18, 36, 37], vereist nog steeds 0,7 W/cm² voor een effectieve destructie van Hela cellen ondanks de sterke NIR-absorptie in het golfengtebereik van 800 nm tot 2400 nm [15, 25, 26].

Deze onderzoeksstudie heeft de bedoeling om een effectieve NIR-bestraaling-getriggerde, Cs_0.33WO₃ NP-gebaseerde thermische doseringsformule te ontwerpen voor in vitro HepG2 kankercel als functie van NP-concentratie, duur van bestraling en optische vermogensdichtheid wel binnen de NIR blootstellingslimiet voor huidweefsel.

Het experiment begint met de synthese van de NP's, waar een stap-voor-stap synthetische procedure inclusief redox reactie, aanlaasproces en nat-malingsmethode is uiteengezet in Fig. 1. De redox reactie incorporeert grote ternaire elementen, Cs in dit geval, in ringen van octahedrale structuur van WO₆ in een passende fysieke omgeving, wat de vorming van eigenaardige kristallijne structuur en incorporatie van vrije elektronen in het metallische moleculaire samengestelde toelaat, wat de intrinsieke reden is voor sterke fotothermische conversie bij NIR-absorptie [26, 27]. Ook hielpen de daaropvolgende aanlaas- en nat-malingsprocessen de kristallijne vorming te verfijnen en de deeltjeskenmerkgrootte te reduceren wat de NIR fotothermische conversie verder verbetert. Daarna ging de gesynthetiseerde NP-oplossing door een reeks fysieke en materiële karakterisering die een gemiddelde kenmerkgrootte van 120 nm verifieert, een cruciale optimalisatie van NIR-absorptie, en de atomaire samenstelling authenticeert (Fig. 2). Daarnaast werd de overeenkomstige meting van zeta-potentiaal voor 0,5 mg/ml, 1 mg/ml en 1,5 mg/ml respectievelijk − 53,2 mV, − 54,3 mV, − 60,1 mV. Over het algemeen is het proces van endocytose de belangrijkste toegangspad voor de meeste NP-typen, en de opnamesnelheid van zowel kationische als ionische NP's voor niet-fagocytische cellen is hoger dan neutrale entiteiten, hoewel de eerste beter presteren dan de laatste [38]. Ook vonden veel eerdere rapporten negatief geladen NP's minder toxisch voor niet-fagocytische cellen [39, 40], wat een gunstige meerwaarde is wanneer een excessieve intracellulaire NP-accumulatie voor fotothermische dosis vergezeld van een lage toxiciteit wordt overwogen.

Om een toon te zetten voor de fotothermische assay op de HepG2 cellen, werd de beoordeling van de NP's robuustheid als fotothermische verwarmingsbron, de langetermijnstabiliteit bij verzadigde temperatuur in evenwicht met de omgevingsomgeving gedurende een uur en de herhaalbaarheid voor 5 opeenvolgende cycli binnen 3 uur gedemonstreerd (Fig. 3b, c). Ook, om de effectiviteit van de NP's hyperthermie per se in doseren van de kankercellen te kwantificeren door de invloed van de omgevingstemperatuur (nominaal 25 °C) uit te sluiten, werd een calibratie van het experimentele apparaat geïmplementeerd door een warmteplaat in te stellen op 37 °C, waarop alle celassays werden uitgevoerd, en de temporele fotothermische kenmerken van het zuivere kweekmedium en NP-geïncorporeerd kweekmedium bleven op 37,1 °C (Fig. 3d). Daarna werd de afhankelijkheid van cytotoxiciteit van de duur van bestraling en NP-concentratie apart onderzocht en gepresenteerd in Fig. 4 wat minder dan 5% celdoding aangeeft voor meer dan 2 uur NIR-bestraaling en 1,5 mg/ml als het cruciale punt naar dodelijke concentratie. Door de NP-concentratie te fixeren op 1,5 mg/ml, wat gebruikt werd doorheen de rest van de fotothermische assay, werd de thermische dosis voor medische hyperthermie gedefinieerd als functies van variabele doseringsduur en optische vermogensdichtheid. Figuur 5 illustreert de actie van celdoding met lage (a–c) en hoge (d–f) vergroting wanneer NIR-bestraaling voor 0 uur, 1 uur en 2 uur werd geïmplementeerd, de schijnbaar verminderde hoeveelheid in de cellen reflecteert goed de kwantitatieve analyse van celoverlevingssnelheid zoals getoond in (g), en de lineaire trendlijn voorspelt 80% celdood voor 2 uur bestraling. Evenzo wordt de afname in celoverlevingssnelheid bij incrementele optische vermogensdichtheid gedemonstreerd in (h). Ten slotte, zoals duidelijk afgebeeld door de BF, fluorescente en gesuperponeerde composiet afbeeldingen in Fig. 6, waarin een histogram van fluorescente analyse werd gepresenteerd, werd de endocytose van de fNP's geverifieerd.

Conclusie

Samenvattend, presenteert deze studie materiaalsynthese en karakterisering van Cs_0.33WO₃ NP's, onderzoekt in vitro cytotoxiciteitsassays van de directe NP-interactie, en apart, met NIR-bestraaling, en bewijst de endocytose van de NP's alsook de effectiviteit van de NIR-bestraalde NP's op het destructeren van de HepG2 kankercellen. Bovendien suggereert deze studie een combinatieve dosis van de NIR-bestraalde Cs_0.33WO₃ NP-oplossing voor de HepG2 kankercellen, 1,5 mg/ml NP-concentratie, de duur van bestraling tussen 30 min. tot 1 uur, en optische vermogensdichtheden van NIR-bestraaling onder 50 mW/cm² wat goed onder de veilige NIR blootstellingslimiet voor huidweefsel ligt terwijl kankercelsterftecijfer dicht bij 40% toelaat en potentieel toepasbaar kan zijn voor de ontwikkeling van patiëntvriendelijke en gepersonaliseerde geneeskunde. Dergelijke studies in een klinische setting zullen aanvullende maatregelen vereisen zoals oppervlaktemodificatie met moleculen die oppervlaktereceptoren van specifieke kankerceltypen herkennen.