Nanotechnieken inactiveren kankerstamcellen

Abstract

Een van de taken van de huidige oncologie is het identificeren van kankerstamcellen en het zoeken naar therapeutische middelen die in staat zijn tot hun specifieke remming. Het artikel presenteert de gegevens over fenotypekenmerken van Ehrlich-carcinoomcellen als een handig en gemakkelijk te volgen model van tumorgroei. Het bewijs van kankerstamcellen als onderdeel van het Ehrlich-carcinoom en de betekenis van CD44⁺ en CD44^– subpopulaties bij het in stand houden van de groei van dit type tumor werden aangetoond. Een hoge (tienvoudige) tumorverwekkende activiteit van het Ehrlich-carcinoom CD44⁺ cellen in vergelijking met CD44^– cellen is bewezen. In dit vergelijkingspaar is de CD44⁺ cellen hadden een hoger potentieel om CD44 in de buikholte te genereren^high , CD44⁺ CD24^– , CD44⁺ CD24⁺ celsubpopulaties, met de nadruk op de aanwezigheid van kankerstamcellen in een pool van CD44⁺ cellen.

In deze studie werd het vermogen van gesynthetiseerde hybride nanocomplexen, bestaande uit de nanodeeltjes van zeldzame aarde-orthovanadaten GdYVO₄ :Eu³⁺ en cholesterol om de tumorgroei te remmen en om de overleving van de dieren met tumoren te verhogen, werd vastgesteld. Elk van zijn componenten levert een speciale bijdrage aan het tumorremmende effect. Behandeling van Ehrlich-carcinoomcellen met tweecomponentenhybridecomplex resulteerde in maximale verlaging van de concentratie van de meest tumorverwekkende CD44^high cellen met gelijktijdige stijging van het aantal CD117⁺ cellen die de intensiteit van tumorgroei met 74,70 ± 4,38% verminderden in vergelijking met de controle.

Achtergrond

Het probleem van kwaadaardige groei blijft een van de meest urgente in de geneeskunde. In de afgelopen decennia is er enige vooruitgang geboekt bij het ontwikkelen van nieuwe behandelingen voor kanker. Dit komt door de herziening van het klassieke concept van kanker en de ontdekking van kankerstamcellen (CSC's), die in staat zijn tot onbeperkte zelfvernieuwing en kunnen worden geïdentificeerd door een aantal fenotypische markers. De meeste van deze cellen zijn resistent tegen radio- en chemotherapie, waardoor de kwaadaardige groei en metastase terugvalt. Er zijn nieuwe methoden van antikankertherapie onder de knie, namelijk het selectief inactiveren van tumorcellen met minimale schade aan normaal weefsel [1].

De CSC's werden voor het eerst geïdentificeerd en beschreven in 1997 door het M. Dick-team [2]. De auteurs onderzochten een acute myeloïde leukemie waarbij de subpopulatie, die 0,01-1% van de totale populatie cellen uitmaakt, leukemie zou kunnen veroorzaken bij transplantatie naar de immunodeficiënte NOD/SCID-muizen (niet-obese diabetische-ernstige gecombineerde immunodeficiëntie). Deze tumor-inducerende cellen werden fenotypisch gekarakteriseerd als de CD34⁺ CD38^– . In 2003 hebben M. Al-Hajj en M.S. Wicha slaagde erin de CSC's te identificeren in een vaste vorm van humane borstkanker (BC) [3]. Er is gevonden dat de niet-gescheiden populatie van primaire borstkanker in 100% van de gevallen (10/10) een tumorverwekkend potentieel vertoonde bij toediening aan NOD/SCID-muizen in een concentratie van 5 × 10⁴ cellen/muis. Vermindering van de concentratie van toegediende cellen tot 1 × 10⁴ cellen/muis verminderden hun tumorverwekkende activiteit 4 keer (3/12) [3]. CD24⁺ CD44⁺ fractie bij toediening in verschillende doses (2 × 10⁴ tot 100 cellen/muis) liet de tumorgroei niet toe. Hierbij, CD44⁺ CD24^– /lage subpopulatie bezat een significant hogere tumorverwekkende activiteit, wat de vorming van tumoren aantoont in 100% van de gevallen bij toediening van 10³ cellen / muis. Het meest uitgesproken vermogen om tumoren te vormen was inherent aan de subpopulatie van CD44⁺ CD24^– /^lo ESA⁺ fenotype. Toediening aan muizen van slechts 200 van deze cellen resulteerde in de vorming van solide tumoren in 100% (4/4) 5 maanden later hun injectie [3]. Deze studies werden voortgezet door Ponti D. et al., die het vermogen van bepaalde populaties van borstkankerbiopsiemonsters aantoonden om de mammosferen in vitro te vormen in serumvrije kweek [4]. De meeste cellen van de verkregen mammosferen waren van CD44⁺ /CD24^–/laag fenotype evenals een verhoogd tumorigene potentieel in vivo bij toediening aan SCID-muizen (ernstige gecombineerde immunodeficiëntie). Het vermogen om tumor te vormen in deze subpopulatie was 1000 keer hoger dan dat van de traditioneel getransplanteerde lijn van mammacarcinoom MCF7 [4]. De auteurs hebben echter aangetoond dat slechts 20% van CD44⁺ CD24^–/laag cellen hadden het vermogen tot zelfvernieuwing. Dit kan te wijten zijn aan heterogeniteit van deze subpopulatie, namelijk de aanwezigheid van extra markers (ESA, ALDH), die de functie van cellen bepalen en kan ook verband houden met de CD44-expressiesnelheid. De artikelen die de afgelopen jaren zijn gepubliceerd, laten zien dat de CSC's met een hoge expressie van de marker (CD44^high ) hebben de hoogste tumorverwekkende activiteit [5, 6]. Bij orthotope implantatie van 5 × 10⁵ CD44^hoog -RAS-getransformeerd en CD44^laag cellen naar NOD/SCID-muizen, is gebleken dat een subpopulatie CD44^low had een lage tumorigeniciteit (tumor werd in 30% van de gevallen gevormd), terwijl de CD44^hoge cellen waren in 100% van de gevallen in staat om tumoren te vormen [6].

Als we de gepubliceerde gegevens samenvatten, kan de differentiatierij van subpopulaties van borstkankercellen als volgt worden weergegeven:

$$ \mathrm{C}\mathrm{D}{44}^{\mathrm{high}}\to \mathrm{C}\mathrm{D}{44}^{+}\mathrm{C}\mathrm{ D}{24}^{\hbox{--}}\to \kern0.5em \mathrm{C}\mathrm{D}{44}^{+}\mathrm{C}\mathrm{D}{24} ^{+}\naar \mathrm{C}\mathrm{D}{44}^{\hbox{--}}\mathrm{C}\mathrm{D}{24}^{+} $$

Een aantal cellen met andere markers, met name Sca-1⁺ claimt de CSCs-fase. De gegevens over een vermindering van tumorgroei bij de Sca-1 knock-out muizen wijzen in het voordeel van de hypothese van de tumor-initiërende rol van Sca-1⁺ cellen in een vroeg stadium van tumorigenese [7]. Onlangs is veel meer aandacht van de onderzoekers getrokken, niet alleen door CSC's, maar ook door de cellen die hun accessoire-regulerende micro-omgeving maken. De CD117⁺ cellen, die traditioneel worden gedetecteerd in een pool van bloedstamcellen, verdienen speciale aandacht onder hen [8]. De totale populatie menselijke borstcarcinoomcellen omvat de zogenaamde carcinoom-geassocieerde fibroblasten van stroma met CD117⁺ fenotype. Ze ondersteunen tumorgroei en bevorderen de angiogenese ervan [9, 10]. Een aanname van de aanwezigheid in Ehrlich carcinoom (EC) populatie van stamcel, studie van tumorverwekkend potentieel van CD44⁺ fractie en rol van CD117⁺ cellen bij het in stand houden van de tumorontwikkeling vereist extra bewijs.

De meeste experimenten om CSC's in vivo door te laten, werden uitgevoerd in SCID- of NOD/SCID-muizen. Deze muizen reageren niet met een immuunreactie op xenotransplantatie van menselijke cellen. Er wordt gezocht naar adequate en relevante experimentele modellen om de antitumoractiviteit van verschillende therapeutische middelen te bestuderen en te beoordelen. Een daarvan is de in vivo getransplanteerde tumorcellijn van EC, die werd verkregen uit een spontane borstkanker van muizen [11]. Er zijn echter vrijwel geen publicaties over subpopulatiesamenstelling van EC-cellen en hun fenotypische kenmerken, aanwezigheid van CSC's en hun belang bij het in stand houden van de groei van dit type tumor. Rekening houdend met de histogenetische overeenkomst van EC en BC, kan worden aangenomen dat bij de initiatie en ontwikkeling van de gesimuleerde tumor dezelfde genen die de proliferatie van kankercellen regelen, kunnen worden betrokken, evenals vergelijkbare biochemische routes die leiden tot de expressie van tumormarkereiwitten. De veronderstelling over de aanwezigheid van CSC's in de EG-populatie en studie van hun tumorigene potentieel heeft echter aanvullend bewijs nodig, wat een van de doelstellingen van de huidige studie was.

Een even urgent probleem van de huidige oncologie is het vinden van de medicijnen, niet alleen het specifiek herkennen maar ook het inactiveren van de CSC's. Het concept van begrip van het probleem was de basis die werd gevormd in de richting van het moment "theranostiek" (therapie + diagnose) [12]. Binnen de kaders van theranostica zijn er technologische benaderingen ontwikkeld voor het gebruik van medicijnen en hulpmiddelen voor gelijktijdige diagnose en therapie van kanker. Een van de richtingen van theranostica is het richten van gouden nanodeeltjes op de tumorplaats en het volgen van fotothermische therapie [13]. Een andere benadering voor de identificatie van tumorcellen is het gebruik van quantum dots, krachtige optische contrastmiddelen die het mogelijk maken de tumor in vivo te volgen [14]. Het vermogen van de kwantumstippen om de menselijke embryonale stamcellen in vivo op een niet-invasieve manier te visualiseren, getuigt van hun mogelijke biomedische toepassing [15].

De laatste tijd wordt er meer aandacht besteed aan nanoluminoforen op basis van diëlektrische materialen en wide zone halfgeleiders, geactiveerd met zeldzame aardelementen, namelijk nanodeeltjes (NP's) van zeldzame aardmetalen (in het bijzonder vanadium en zijn verbindingen) [16]. Deze materialen hebben een hoge fotostabiliteit, een grote Stokes-verschuiving van luminescentie, afwezigheid van het scintillatie-effect en stabiliteit van karakteristieke smalle luminescentiebanden. Hiermee zijn anti-tumor effecten van vanadiumverbindingen bekend. Er is dus aangetoond dat een vanadiumdichloride celproliferatie aanzienlijk kan remmen als gevolg van accumulatie in nucleair heterochromatine met daaropvolgende inductie van mitotische aberratie tijdelijke onderdrukking van mitosen, wat leidt tot accumulatie van cellen in de late S en G ₂ fasen [17]. Veelbelovend voor de behandeling van kwaadaardige tumoren kan het gebruik zijn van hybride nanocomplexen op basis van op zeldzame aarde gebaseerde NP's van orthovanadaten GdYVO₄ :Eu³⁺ en cholesterol, ontwikkeld aan het Instituut voor Scintillatiematerialen van de Nationale Academie van Wetenschappen van Oekraïne [18].

Het doel van hun creatie was om een therapeutisch effect van antikankermiddelen te versterken vanwege de aanwezigheid in de samenstelling van nanocomplexen met een affiniteit voor de doelcelmembranen. Een daarvan is cholesterol dat actief aan de bloedbaan wordt "onttrokken" door kankercellen te prolifereren om de biomembranen te bouwen. Dit wordt mogelijk gemaakt door de aanwezigheid op het oppervlak van een groot aantal tumorcellen SR-B1 (scavenger receptor, klasse B type I) en caveolin-1 (Cav-1) receptoren, die kunnen binden met het vrije cholesterol in de bloedbaan [19] .

Het doel van dit werk was dus om de subpopulatiesamenstelling van EC-cellen te identificeren, inclusief die met de tekenen van CSC's, evenals hun tumorverwekkende activiteit na voorbehandeling met hybride nanocomplexen.

Methoden

De experimenten werden uitgevoerd in 8 maanden oude vrouwelijke Balb/C-muizen. De muizen werden in standaardomstandigheden van het vivarium gehouden (kamertemperatuur van 20 ± -2 ° C, relatieve vochtigheid 50-70%, licht-donkercyclus 12:12 uur). Alle experimentele protocollen zijn goedgekeurd door de Animal Ethics Committee van het Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine van de National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkiv, Oekraïne, (rec. nr. 1 van 23.01.2017) en waren in overeenstemming met de Europese Conventie over het gebruik van proefdieren (Straatsburg, 1986), goedgekeurd door het eerste nationale congres van Oekraïne in bio-ethiek (Kiev 2004).

Kweek van EC-cellen in vivo

Ehrlich-carcinoomcellen (EC) werden in de peritoneale holte (PC) van Balb/C-muizen gepasseerd. De gecryopreserveerde in ascitesvloeistof EC-cellen werden gebruikt als primaire kweek [20]. Na ontdooien werden de EC-cellen driemaal in vivo opnieuw getransplanteerd, om de invloed van de factoren van vries-ontdooien te verminderen en door hen morfologische en functionele kenmerken van inheemse cellen te verkrijgen [21]. "Gestabiliseerd" waarbij EC-cellen intraperitoneaal werden geïnjecteerd in een dosis van 3 × 10⁶ cellen/muis in 0,3 ml zoutoplossing en 7 dagen in vivo gekweekt. Na 7 dagen werden de proefdieren onder lichte etheranesthesie uit het experiment verwijderd. Ascitesvloeistof van PC werd met een injectiespuit door een naald met een binnendiameter van 2,69 mm genomen en in een meetbuisje van 10 ml geplaatst. Het absolute aantal cellen werd bepaald door het volume van de opgehoopte ascitesvloeistof in de buikholte (ml) te vergroten met het aantal EC-cellen geteld in de Goryaev-kamer. Een toename van het totale aantal tot 35,00 × 10⁷ EC-cellen in pc van muizen tot dag 7 was een criterium voor de ontwikkeling van carcinoom [21]. In de toekomst dienden de cellen zelf als studieobject.

Fenotypische beoordeling van EC-subpopulaties

Het werd uitgevoerd met een flowcytometer "FACS Calibur" ("Becton Dickinson", VS) met behulp van monoklonale antilichamen (VS "BD Biosciences") tegen CD44 (FITC) (nr. 553133, kloon IM7), CD117 (FITC) (nr. 553354, kloon 2B8) en Sca-1 (FITC) nr. 553333, kloon E13-161.7), en CD24 (PE) nr. 553262, kloon M1/69) volgens de instructies van de fabrikant. Als controle werden de monsters met toevoeging van niet-immune FITC- en PE-gelabelde monoklonale antilichamen van dezelfde isotypen ("BD Biosciences"), nr. 553988, kloon A95-1 en nr. 553989, kloon A95-1), als antilichamen tegen de geteste marker werden gebruikt. Een immunofenotypische dubbele kleuring werd uitgevoerd met behulp van CD44 (FITC) en CD24 (PE) monoklonale antilichamen. De cellen met een gemiddelde fluorescentie van CD44-marker hoger dan 10³ (volgens een logaritmische schaal) werden verwezen naar CD44^high subpopulaties. Registratie en analyse van de resultaten werden uitgevoerd met "WinMDi 2.9"-software (Joseph Trotter, La Jolla, VS).

Scheiding van CD44⁺ Fractie van EC-cellen met behulp van immunomagnetische sortering

Houd er rekening mee dat de CSC's met een hoog expressieniveau van de CD44-marker (CD44^high ), bestaande uit een heterogene populatie van CD44⁺ cellen de hoogste tumorverwekkende activiteit bezitten, werden ze geïsoleerd uit een totale EC-populatie met een magnetische sorteerder (BDTM Imagnet). CD44 isoleren⁺ factie werden primaire ongelabelde monoklonale antilichamen gebruikt voor marker CD44 (BD, 558739) en secundaire muis IgG1 Magnetic Particles-DM (BD, 557983) volgens het protocol van de fabrikant. Scheidingszuiverheid voor CD44⁺ cellen van de totale EC-populatie was 90%.

Bepaling van de tumorogene activiteit van cellen van de totale populatie en die van geïsoleerde CD44⁺ en CD44^– - EC fracties

Tumorverwekkend vermogen van de totale populatie en geïsoleerde CD44⁺ en CD44^– EC-fracties werden vergelijkend geanalyseerd met de hierboven beschreven methode van in vivo kweken. De experimentele opstelling wordt getoond in Fig. 1.

Experimenteel ontwerp bij het vergelijken van het tumorverwekkende vermogen van de totale populatie en geïsoleerde CD44⁺ en CD44^– EC fracties

In de eerste reeks experimenten evalueerden we het tumorverwekkende vermogen van de totale populatie en geïsoleerde CD44⁺ en CD44^– EC-fracties bij toediening aan dieren in een standaarddosis die wordt gebruikt voor EC-initiatie (3 × 10⁶ cellen in 0,3 ml zoutoplossing).

Dieren werden verdeeld in de volgende groepen (n = 10):

Groep 1.1–toediening van de totale populatie EC-cellen (3 × 10⁶ cellen/dier)
Groep 2.1–toediening van CD44⁺ fractie EC-cellen (3 × 10⁶ cellen/dier)
Groep 3.1–toediening van CD44^– fractie EC-cellen (3 × 10⁶ cellen/dier)

Binnen 7 dagen na de inoculatie in elk van de experimentele groepen werd een totaal aantal cellen in PC van dieren geteld, werden fenotypische kenmerken van cellen beoordeeld (zoals hierboven beschreven) en CD44^hoog /CD117⁺ verhouding van EC-cellen bepaald als de verhouding van CD44^hoog percentage naar CD117⁺ cellen [22]. Proliferatief potentieel van cellen van de totale EC-populatie en geïsoleerde CD44⁺ en CD44^– fracties werd als volgt geschat op basis van de gegevens:multipliciteitsfactor (MF) van celpopulatiesurplus tijdens kweektijd, M = N/N₀; en tijdverdubbeling (TD), TD = (log₂ 2)* t /[log₂ (N /N ₀ )], waar t is de tijd van celkweek (h), N is het aantal cellen op t tijd; N ₀ is het initiële celnummer [23].

In de tweede reeks experimenten was er een geschatte minimale dosis van de toegediende cellen van de totale populatie en geïsoleerde CD44⁺ en CD44^– EC-fracties, die tumorgroei induceren. Totale celsuspensie en geïsoleerde CD44⁺ en CD44^– EC-fracties werden intraperitoneaal toegediend aan muizen in doses van 3 × 10⁶ , 3 × 10⁵ , 3 × 10⁴ , en 3 × 10³ cellen per muis in 0,3 ml zoutoplossing en 7 dagen gekweekt op de pc.

Dieren die in deze reeks experimenten zijn gebruikt, zijn verdeeld in de volgende groepen (n = 10):

Groep 1.1–toediening van de totale populatie EC-cellen (3 × 10⁶ cellendier)
Groep 1.2–toediening van de totale populatie EC-cellen (3 × 10⁵ cellen/dier)
Groep 1.3–toediening van de totale populatie EC-cellen (3 × 10⁴ cellen/dier)
Groep 1.4–toediening van de totale populatie EC-cellen (3 × 10³ cellen/dier)
Groep 2.1–toediening van CD44⁺ fractie EC-cellen (3 × 10⁶ cellen/dier)
Groep 2.2–toediening van CD44⁺ fractie EC-cellen (3 × 10⁵ cellen/dier)
Groep 2.3–toediening van CD44⁺ fractie EC-cellen (3 × 10⁴ cellen/dier)
Groep 2.4–toedienen van CD44⁺ fractie EC-cellen (3 × 10³ cellen/dier)
Groep 3.1–toediening van CD44^– fractie EC-cellen (3 × 10⁶ cellen/dier)
Groep 3.2–toediening van CD44^– fractie EC-cellen (3 × 10⁵ cellen/dier)
Groep 3.3–toediening van CD44^– fractie EC-cellen (3 × 10⁴ cellen/dier)
Groep 3.4–toedienen van CD44^– fractie EC-cellen (3 × 10³ cellen/dier)

In elke experimentele groep werd 7 dagen later na de EC-inoculatie een totaal aantal cellen in PC en dat van dieren met ascitesontwikkeling bepaald.

Synthese van nanocomplexen

Hybride nanocomplexen met sferische nanodeeltjes (NP's) (met een diameter van 2-3 nm) in een concentratie van 1,30 g/l en schapencholesterol in een concentratie van 0,55 g/l ("Acros organics", België) werden gesynthetiseerd in het Instituut voor Scintillatiematerialen van de Nationale Academie van Wetenschappen van Oekraïne (Kharkiv) zoals gerapporteerd [18]. NP's gebaseerd op orthovanadaten van zeldzame aardelementen GdYVO₄ :Eu³⁺ bolvorm in een concentratie van 1,30 g/l werden bereid zoals beschreven [24]. Waterige colloïdale oplossingen op basis van orthovanadaten zijn gezuiverd van onzuiverheden door dialyse met behulp van de membranen "Cellu Sep H1" 3,5 KDa.

In hybride nanocomplexen zijn de negatief geladen NP's gelokaliseerd langs de periferie van cholesteroldeeltjes als gevolg van van der Waals en hydrofobe interacties. De NP's stabiliseren de nanocomplexen via elektrostatische interacties. De afmetingen van de gesynthetiseerde nanocomplexen zijn niet groter dan 100 nm. Bovendien vertonen de NP's antioxiderende eigenschappen en zijn ze niet onderhevig aan oxidatie. Dit feit draagt bij aan de toename van de weerstand van de waterige dispersie van cholesterol met betrekking tot de reactieve zuurstofverbindingen. Schematische structuur van hybride nanocomplex wordt getoond in Fig. 2.

Hybride nanocomplex:a schematische weergave en b transmissie-elektronenmicroscopie fotomicrografie van hybride nanocomplexen, verkregen uit een waterige cholesteroloplossing die op een koolstofnetwerk is geplaatst

Om een accumulatie van hybride nanocomplexen in cellen tijdens de in vitro-onderzoeken vast te stellen, zou hydrofobe fluorescerende kleurstof 1,1′-dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanineperchloraat (DiI) bovendien kunnen worden geïntroduceerd in de waterige cholesteroldispersie, waardoor lokale luminescentiespectroscopie de dynamiek van integratie van het complex in een celmembraan kan evalueren door de verhouding van de monomeer--"J-aggregaat" luminescentiebanden [25]. Onze eerdere studies hebben aangetoond dat hybride nanocomplexen niet meer dan in 10% van de cellen van de totale EC-populatie kunnen worden geïntegreerd en in vrijwel alle cellen van geïsoleerd CD44⁺ fractie met het hoogste kankerverwekkende potentieel. Dit maakt het gebruik van hybride nanocomplexen in deze modificatie (NP's + cholesterol + DiI) mogelijk als een methode om lokale accumulatie van nanocomplexen in kankercellen te identificeren [26, 27].

Voorbehandeling van EC-cellen met nanomaterialen

Totale suspensie van EC-cellen met hybride nanocomplexen of NP's werd gedurende 3 uur bij kamertemperatuur geïncubeerd in een oplossing van 5% glucose ("Infusion" CJSC, Kiev). Een dergelijke incubatietijd werd eerder gevonden als optimaal voor het binden van nanocomplexen aan cellen [26].

De volgende varianten van voorbehandeling van EC-cellen met nanomaterialen zijn getest:

Optie 1-900 μl EC-cellen (1 × 10⁷ ) 100 μl bolvormige NP's (1,3 g/l) werden toegevoegd.
Optie 2-900 μl EC-cellen (1 × 10⁷ ) 100 μl hybride complex (sferische NP's (1,3 g/l) + cholesterol (0,55 g/l)) werd toegevoegd.

De controle bestond uit de cellen van de totale EC-populatie, die werden geïncubeerd in 5% glucose-oplossing zonder behandeling met nanocomposieten. Het aantal dieren in elke experimentele groep was niet minder dan 20.

Na incubatie werden de EC-cellen van alle geteste groepen driemaal gewassen met zoutoplossing (1:1) door middel van centrifugatie (10 min bij 300 g).

Intensiteit van EC-ontwikkeling na voorbehandeling met nanomaterialen werd geëvalueerd door intraperitoneale injectie in een dosis van 3 × 10⁶ cellen in 0,3 ml zoutoplossing. In 7 dagen na EC-celinoculatie in alle bestudeerde groepen, werd bepaald:

Een totaal aantal (TN) EC-cellen in de buikholte.
Remmingssnelheid (Ri) van EC-groei volgens de formule Ri = (TN (c) – TN(e)):TN (c) × 100%, waarbij TN (c)––totaal aantal EAC-cellen in PC van de controlegroep, TN (e) - totaal aantal EAC-cellen in de pc van de experimentele groep.
Groeisnelheid (Rg) van EC werd berekend met behulp van de formule Rg (e) = Rg (c) – Ri, waarbij Rg (e)-groeisnelheid van tumoren van een experimentele groep dieren; Rg (c) - groeisnelheid van tumor van de controlegroep, Ri - remmingssnelheid van EC-groei in experimentele groep dieren; remming van de EC-groei in de controle werd genomen als 100%, terwijl er geen remming van de EC-groei was.
CD44^hoog /CD117⁺ verhouding (verhouding van CD44^hoog percentage naar CD117⁺ cellen).
De overleving van dieren werd beoordeeld tot dag 20 na intraperitoneale injectie van onbehandelde en behandelde EC-cellen van alle soorten nanocomposieten.

Statistische verwerking werd uitgevoerd met behulp van niet-parametrische Mann-Whitney U test in Statistica 6.0-software. Verschillen werden als statistisch significant beschouwd bij P < 0.05.

Resultaten

De verkregen resultaten wijzen op de aanwezigheid van een heterogene populatie van EC-cellen die op hun oppervlak de CD44-, CD24-, Sca-1-markers dragen en die welke kunnen worden toegeschreven aan accessoire-regulerende elementen van de micro-omgeving (CD117). De concentraties van cellen met deze kenmerken in de totale EC-pool (groep 1.1) worden weergegeven in tabel 1 en zijn volledig consistent met de eerdere bevindingen over de samenstelling van de EC-subpopulatie [28]. Identificatie van de Sca-1-structuur in vrijwel alle EC-cellen maakt het mogelijk om het te beschouwen als een veelzijdige marker van dit tumortype.

De meest informatieve in termen van fenotypische identificatie van CSC's is de expressie van CD44-moleculen, die ofwel zelf ofwel in combinatie met andere oppervlaktemarkers worden gebruikt om deze celpopulatie te isoleren van verschillende tumoren, waaronder EC. Volgens klassieke opvattingen gaat de differentiatie van tumorcellen tijdens de ontwikkeling van borstkanker gepaard met de verminderde expressie van de CD-44-receptor met zijn geleidelijke verdwijning en verschijnen van de cellen die de CD24-marker tot expressie brengen [3].

De kandidaten voor de rol van CSC's tijdens EC kunnen de cellen zijn met CD44^high fenotype is het onderdeel van CD44⁺ CD24^– - bevolking. Deze veronderstelling over de afhankelijkheid van EC van functionele activiteit van een subpopulatie van CD44⁺ cellen werden getest bij het evalueren van de intensiteit van tumorgroei geïnduceerd door CD44⁺ en CD44^– facties en de totale bevolking van de EG. Tabel 1 laat zien dat de hoogste tumor-inducerende activiteit inherent was aan de cellen van CD44⁺ fractie. Eigenlijk, na het toedienen van 3x10⁶ CD44⁺ cellen (groep 2.1), een absoluut aantal cellen in PC was 23 keer hoger dan na dat van de totale populatie van EC-cellen (groep 1.1), en 105 keer meer dan wanneer CD44^– fractie werd toegediend (groep 3.1).

Hierbij werden veranderingen gevonden van niet alleen kwantitatieve maar ook kwalitatieve samenstellingen van een zich ontwikkelende tumor. De fractie van CD44⁺ vormden de ascites met een overwegend gehalte aan CD44⁺ cellen, d.w.z. CD44^hoog , CD44⁺ CD24^– , en CD44⁺ CD24⁺ cellen. Bovendien is de concentratie van CD44^hoog cellen was 2 keer hoger in vergelijking met groep 1.1 en 16 keer hoger in groep 3.1. De fractie van CD44^– vormde daarentegen een tumor die meer volwassen cellen bevatte, namelijk die met CD44^– CD24⁺ fenotype. De herverdeling van de subpopulatiesamenstelling van cellen in groep 3.1 bepaalde blijkbaar het minimale absolute gehalte aan cellen in de pc.

Belangrijk is het vaststaande feit van de aanwezigheid onder de EC-cellen van een subpopulatie met een CD117⁺ markeerstift. Het molecuul van CD117 is een transmembraan-tyrosinekinasereceptor. Onder normale omstandigheden wordt het geactiveerd door het overeenkomstige ligand, d.w.z. stamcelgroeifactor (SCGF) [29]. Bij oncologische pathologie treedt de ligandonafhankelijke activering van de c-KIT-receptor op, wat meestal (tot 92% van de gevallen) een gevolg is van de c-kit-oncogenmutatie of wordt veroorzaakt door een verstoord regulatiemechanisme van deze receptorfunctie [30].

Overweeg CD117⁺ cellen als de cellen van de micro-omgeving van de tumor het bewezen feit van de afhankelijkheid van de intensiteit van de tumorgroei van de aan- of afwezigheid van CD117⁺ cellen en hun concentratierelaties met CD44^hoog cellen is logisch. Zoals tabel 1 laat zien, werden er bij het starten van de EC door het introduceren van de totale celpopulatie (groep 1.1.) in de pc 34.80 ± 1.27 × 10⁷ gevormd cellen op de CD44^high /CD117⁺ verhouding, die gelijk was aan 0,02 relatieve eenheden.

Tumorigene potentie van CD44^– fractie was 4 keer lager (groep 3.1), wat zich uitte in een verlaagde CD44^high /CD117⁺ verhouding in dezelfde mate (4 keer) in vergelijking met groep 1.1. Deze verandering in CD44^hoog /CD117⁺ index was voornamelijk te wijten aan een daling van CD44^high concentratie (in 8,5 keer) op de achtergrond van het verminderde gehalte aan CD117⁺ cellen (in 2 keer) ook.

Bij het evalueren van de intensiteit van ascitesgroei, gegenereerd door CD44⁺ fractie werd een significante toename van het totale aantal cellen in PC (bijna 24-voudig vergeleken met groep 1.1) opgemerkt. Ook belangrijk is het eigen risico in twee keer van CD44^high concentratie en gebrek aan CD117⁺ cellen. In eerste materiaal van CD44⁺ fractie (vóór het kweken) volgens flowcytometrische analyse van de gegevens, het gehalte aan CD44^hoog cellen was 15 keer hoger dan in de totale populatie van EC-cellen (gegevens niet weergegeven).

Om het hierboven genoemde samen te vatten, kunnen we stellen dat CSC's met een hoge expressiesnelheid van de CD44-marker (CD44^hoog ), terwijl een van de belangrijkste functies van CD117⁺ subpopulatie is een regulatie (“beperking”) van tumorverwekkende activiteit van CD44^high cellen. De afwezigheid van CD117⁺ cellen (groep 2.1) lijken het proliferatieve en differentiatiepotentieel van de gehele verzameling CD44⁺ te vermenigvuldigen cellen, waardoor het totale aantal cellen in de pc aanzienlijk stijgt.

De analyse van het proliferatieve potentieel van een totale pool van EC-cellen en CD44⁺ fractie is voorstander van deze interpretatie. Het is aangetoond dat de vermenigvuldigingsfactor (MF) in de totale populatie gekweekt in de PC in groep 2.1. gedurende 7 dagen nam bijna 24 keer toe in vergelijking met groep 1.1. Dit ging gepaard met een verdubbeling van de celtijd van 24,47 ±-2,75 uur in groep 1,1-14,70 ±-1,35 in groep 2,1 die een populatie van ascitescellen kan kenmerken die zijn gegroeid uit CD44⁺ fractie, als een actiever prolifererende fractie (tabel 1).

Om de speciale rol van CD44⁺ . te bewijzen cellen bij aanvang en instandhouding van tumor bij toediening van EC, zelfs in minimale doses, was het van belang om de tumorverwekkende capaciteit van geïsoleerd CD44⁺ vergelijkend te beoordelen. en CD44^– fracties bij toediening in verschillende concentraties. It has been found that after the introduction of 3 × 10⁶ cells of total EC population, tumor growth was observed in 100% of animals (10/10) (Table 2). Reducing 10 times the dose of cells administered (3 × 10⁵ ) resulted in a proportional decrease in absolute number of cells in the PC, tumor developed only in 50% of animals (Table 2). Reducing the administered dose of total EC population of cells down to 3 × 10⁴ did not lead to tumor formation in the PC.

Initiations of EC by introducing of CD44⁺ cells at concentrations of 3 × 10⁶ and 3 × 10⁵ cells per animal resulted in almost 100% tumor development for both cases. Herewith, tumorigenic potential of CD44⁺ fraction exceeded that of total population of EC cells administered in the same doses (in 23 and 21 times, respectively). Moreover, introduction of 3 × 10⁴ cells of CD44⁺ fraction caused a tumor formation in 33% of animals, while total population of EC cells used in the same dose, did not cause the formation of ascites. With the introduction of 3 × 10³ cells of CD44⁺ fraction, no animals with the developed EC have been identified.

Fraction of CD44^– cells just in a dose of 3 × 10⁶ was capable of forming tumors in 50% of animals, the number of cells in the PC in this case was 4.5 times less than when introducing the total population and in 105.9 times less than when inducing by CD44⁺ fraction. Thus, the results of this part of research suggest that CSCs are mainly present in the pool of cells with CD44⁺ phenotype. This emphasizes the importance of this subpopulation of cells in initiation and development of EC.

As noted above, identification and inactivation of CSCs is a major theoretical and practical issue of oncology. On this basis, the next task of our study was to investigate the impact of hybrid nanocomplexes designed at the Institute for Scintillation Materials of National Academy of Sciences of Ukraine on the tumorigenic activity of EC cells.

As Table 3 demonstrates an incubation of EC cells with only NPs as a component of hybrid nanocomplexes (option 1) decreased the concentration of CD44^high virtually twice if compared to the control and 5 times the content CD44⁺ CD24^– cells in ascites formed in vivo. The number in it of more differentiated CD44⁺ CD24⁺ , CD44^– CD24⁺ cells remained practically unchanged if compared to the control. In this group, there was established reduction of CD117⁺ cells (35%) at a slightly changed content of Sca-1⁺ subpopulation. Based on the data, the inhibition rate of EC growth (59.41 ± 3.45%) in variant 1 was accompanied by a twofold decrease in the concentrations of CD44^high cells in comparison with the control that was also reflected in the reduction of CD44^high /CD117⁺ ratio (Table. 3).

Pretreatment of EC cells with hybrid nanocomplexes (option 2) reduced almost 10 times the concentration of CD44^high and CD44⁺ CD24^– cells in the developed ascites if compared to the control (Table 3). It should be noted that the concentration of more differentiated CD44⁺ CD24⁺ and CD44^– CD24⁺ cells after this treatment increased slightly if compared to the control. The redistribution pattern of EC subpopulation composition in this option was accompanied with a pronounced enhancement of tumor growth inhibition compared to option 1 (74.70 ± 4.38 and 59.41 ± 3.45%, respectively, P < 0.05) that underlined the importance of cholesterol as a targeted compound of antitumor therapy. Pretreatment with hybrid nanocomplexes (option 2) led to maximal reduction there was found a maximum reduction of CD44^high /CD117⁺ ratio (10 times) as compared with option 1, that again confirmed a specific role of ratio of these cell subpopulations in the EC growth.

For all the types of EC pretreatment, the reduction of CD44^high /CD117⁺ ratio was accompanied by a decrease in tumor growth rate and increased survival of animals to day 20 of EC development (Fig. 3).

Tumor growth rate of EC, survival of animals and CD44^high /CD117⁺ ratio after incubation with nanocomplexes. Note:differences are statistically significant as compared with administration of the control (*), option 1 (**) (P < 0.05)

Discussion

One of the tasks of current oncology is elucidation of the mechanisms of initiation and development of malignant neoplasms. Mandatory participants in these events are the CSCs and so-called accessory-regulatory cells of tumor microenvironment. The variety of functional and structural characteristics of the CSCs in the development of different types of tumors determines the need for their further study. This is facilitated by the expansion of experimental model systems. One of them is the transplantable line of tumor cells of EC.

The elucidation of the peculiarities of this experimental model development, the subpopulation composition of tumor and tumorigenic potential of individual cell populations within the general pool of the EC cells will facilitate the development of new approaches to cancer therapy.

Using the method of phenotypic evaluation of progenitor cells of various levels of differentiation in the tumor focus makes it possible the identifying the stages, dynamics of development and invasiveness of the process. The established fact of heterogeneity of the EC subpopulation composition is important and there has been emphasized the value of CD44⁺ subpopulation in maintaining the growth of this type of tumor.

The most important role in implementing a tumorigenesis is played by an expression rate of the molecule. Indeed, in contrast to leukocytes for adhesion of those normally a low expression rate of CD44 receptor is required, triggering and self-maintenance in CSCs are implemented its much greater density on a cell surface [31].

It is known that CD44-glycoprotein is a hyaluronic acid (HA) receptor, a main component of extracellular matrix. The emerging set of HA-CD44 activates many receptor tyrosine kinases, resulting in activation of PI3K/Akt/ mTOR way [32, 33], which plays the role of a single universal signal transmission mechanism to the translation apparatus and is responsible for the integration of proliferative stimuli.

Among two known CD44-isoforms in normal hematopoietic cells its standard isoform (CD44s) is predominantly expressed [34]. In most malignant tissues there were detected both CD44s and variable isoforms of CD44- molecule (CD44v), resulting from alternative splicing of exons 6-15. Namely alternative splicing leads to a lengthening of CD44-extracellular domain, promoting its greater interaction with HA and tumor metastasis [35]. Due to that the role of CD44^high cells in triggering and maintaining the tumorogenesis is clear. It was previously found that a minor subpopulation of CD44^high cells had a high proliferative potential and played a critical role in EC developing [20].

In this paper, a special role of CD44⁺ -cells of the EC in initiation and maintenance of the tumor process in the EC under administration even in minimal doses has been shown. CD44⁺ cells were able to form a tumor even at a cell concentration of 100 times lower (10⁴ cells/ mouse) if compared with the introduction of a total EC population (10⁶ cells / mouse). The belonging of tumor cells to the CD44⁺ fraction was also confirmed by the fact that the EC initiation by the fraction of CD44-cells even at a dose of 10⁶ cells / mouse caused the formation of a tumor only in 50% of cases, with an absolute number of cells in the PC 5 times less than in under introduction of a similar amount of the total population of EC and more than 100 times less than after the introduced CD44⁺ -fraction.

This is in accordance with the data of Shipitsin M et al. has shown that CD44⁺ and CD24⁺ cells in breast cancer development there are cell populations with different genetic profiles [36]. The research performed by Shipitsin M CD24⁺ cells have been noted to be more differentiated, while more progenitor-like functions are inherent to CD44⁺ cellen. The research performed by Shipitsin M CD24⁺ cells have been noted to be more differentiated, while more progenitor-like functions are inherent to CD44⁺ cellen. The authors suggest that CD24⁺ cells can be derived from CD44⁺ cells [36]. Fillmore C. and Kuperwasser C. supposed that CD24⁺ population was mainly characterized by less differentiated basal type of breast cancer, and CD44⁺ cells caused the development of luminal form of breast cancer, being more differentiated type of tumor [37].

Analyzing the patterns of tumor development, the classic hypothesis of «seed and soil» looks very actual [38], which postulated that an appropriate microenvironment (soil) is required for optimal growth of tumor cells (CSCs).

Most often the carcinoma-associated fibroblasts (CAFs) act as a tumor stroma in breast cancer and pancreatic cancer [39]. It has been shown that the CAFs, derived from invasive forms of human breast carcinomas, activated much stronger the growth of human breast cancer cell line MCF-7-Ras when administered to immunodeficient mice if compared with normal fibroblasts [9]. This function is implemented by the microenvironment cells due to the secretion by them of cytokines, chemokines and growth factors [10, 40].

Although so far the phenotypic identification of the microenvironment cells for various types of tumor has remained a subject of debate, most often used for this purpose the surface markers of primitive hematopoietic and endothelial cells, including c-kit (CD 117), CD133, VE-cadherin, VEGFR-2 and endoglin are used [41]. In this experimental model the most probable candidate to the role of tumor microenvironment cells is CD 117⁺ .

It is known that the c-KIT receptor (CD117⁺ ) is highly expressed in normal epithelium of the breast and progressively decreases with the development of breast carcinoma in situ and is almost completely lost in invasive breast cancer [42, 43]. Some authors proposed this kind of change in the expression rate of this marker as a possible test to assess the effectiveness of antitumor therapy [44].

Previously, after analysis of the significance of the content ratios for different subpopulations of EC cells when maintaining tumor growth, we proposed to use the CD44^high /CD117⁺ ratio as a prognostic criterion of tumor development [22].

Adequacy of using this index is confirmed in this study using the applied nanocomposites as therapeutic agents when treating the EC. The inhibition rate of EC growth (59.41 ± 3.45%) when treated with spherical NPs (option 1) was accompanied by a 2-fold decrease if compared to the control in the CD44^high -cell concentration, which was reflected in the reduced CD44^high / CD117⁺ index. The maximum decrease in the CD44^high /CD117⁺ index (10 times if compared to option 1) was established using the hybrid nanocomplexes for a pre-treatment of EC cells. Thus, many cells of a total pool of EC, but primarily those with the phenotype CD44^high and CD117⁺ , can be the target of the effect of the studied nanocomplexes (both direct and indirect). A significant decrease in their concentrations in the growing pool of EC after pretreatment with hybrid nanocomplexes clearly coincides with a reduced intensity of tumor growth.

Judging by the decrease in the amount of CD44^high as the most potent CSCs forming the entire subsequent series of advanced tumor cells, the main component in manifestation of antitumor effect of the synthesized hybrid nanocomplexes is spherical NPs. Introduction of cholesterol having affinity to tumor cell membranes into composition of hybrid nanocomplexes enhanced an inhibitory activity of NPs. Similar data were obtained by Betker J.L. et al. after analysis of the structure and functioning principles of the membranes of tumor cells. The authors concluded that the incorporation of cholesterol into membranes of tumor cells could be a prerequisite for a targeted delivery of liposomes with therapeutic agents directly into a cell.

Thus, the importance of cooperative interactions of cells with different phenotypic signs in maintaining the EC growth has been proven. The cells with the CD44^high phenotype being the part of the population of CD44⁺ CD24^– can be considered as CSCs in this model system. The use of new forms of nanocomposites that are capable to bind to CSCs and induce tumor destruction as the EC is a promising direction the treatment of oncopathology.

Conclusions

1.
On the base of the findings of phenotypic assessment and functional potential studies, the Ehrlich carcinoma is a heterogeneous population of tumor cells of varying differentiation extent referred to high and less potent tumor-inducing precursors, as well as the cells composing their microenvironment.
2.
A high (tenfold) tumorigenic activity of the EC CD44⁺ cells if compared to CD44^– cells was proven. In this pair of comparison, the CD44⁺ cells had a higher potential of generating in PC of CD44^high , CD44⁺ CD24^– , CD44⁺ CD24⁺ cell subpopulations, highlighting the presence of CSCs in a pool of CD44⁺ cells.
3.
There was found an ability of the synthesized nanocomplexes based on rare earth orthovanadates and cholesterol to inhibit the growth of CD44⁺ cell pool (CD44^high , CD44⁺ CD24^– , CD44⁺ CD24⁺ ) that was accompanied by a reduced intensity of EC growth (by 75%) and increased survival of the animal with tumors (in 3.5 times) in comparison with the control.
4.
It has been shown that the reduction in tumor growth rate after pretreatment with hybrid nanocomplexes was accompanied with a change in the composition of EC subpopulation that was reflected in a decrease in the CD44^high /CD117⁺ ratio. This ratio can be offered as one of diagnostic and prognostic tests of the severity and extent of oncology inactivation.