Vorm-afhankelijke opname van goudnanostructuren in glioblastomacellen: van synthese tot cellulaire interactie

Samenvatting

Goudnanostructuren (Au NSs) met gecontroleerde grootte en vorm komen op als veelzijdige hulpmiddelen voor nanomedicine. Echter, het cellulaire lot van verschillende geometrien blijft slecht begrepen, met name in agressieve kankers zoals glioblastoma. Hier synthetiseerden we vijf verschillende Au NSs – nanorods (NRs), tetrahexaedra (THH), bipyramiden (BPs), spherische deeltjes (SPs) en een nieuwe vorm genaamd nano-makura (NM) – met zaad-gemedieerde groei met binaire surfactantia en een gewijzigde Turkevich route. Alle deeltjes werden oppervlakte-gefuntionaliseerd met PEG-SH en 11-mercaptoundecaanzuur (MUA) om een negatieve lading en sterische stabiliteit te geven. Cytotoxiciteitstesten (LIVE/DEAD) op U-87 MG glioblastomacellen toonden vorm-afhankelijke effecten: NM vertoonde de hoogste celdood (~20% bij 2 mg mL⁻¹) terwijl SPs en BPs grotendeels non-toxisch bleven. Transmissie-elektronenmicroscopie toonde aan dat NM cellen binnenkomt via receptor-gemedieerde endocytose binnen 2 uur en later macro-pinocytose triggert, leidend tot vesiculaire accumulatie en uiteindelijke celdetachment. Deze bevindingen tonen aan dat deeltjesmorfologie, eerder dan grootte alleen, de cellulaire opnamepaden en cytotoxische uitkomsten bepaalt, wat NM positioneert als veelbelovende kandidaat voor gerichte fotothermale therapie en geneesmiddelafgifte in glioblastoma.

Achtergrond

Goudnanostructuren worden gewaardeerd voor hun vorm- en grootte-afhankelijke optische en elektronische eigenschappen, wat toepassingen mogelijk maakt van biosensing tot fotothermale therapie. Gelokaliseerde oppervlakteplasmonresonantie (LSPR) in het zichtbaar–nabij-infrarood (NIR) gebied maakt anisotrope deeltjes, met name hoge-aspectratio nanorods, uitstekende contrastmiddelen voor computed tomography en fotoakoestische imaging. Kleinere nanostructuren vertonen superieure absorptie, wat de fotothermale efficiëntie verhoogt. Bovendien kunnen anisotrope vormen zich zelf-assembleren tot superstructuren die intense elektromagnetische velden genereren, voordelig voor oppervlakte-versterkte Raman-spectroscopie en gerichte geneesmiddelafgifte.

Zaad-gemedieerde groei, vaak aangevuld met zilverionen en surfactantmengsels (bijv. CTAB met oleïnezuur of DDAB), is de bevorzugde methode geworden voor het afstemmen van Au NSs, aangezien het nauwkeurige controle over aspectratio en facetgroei toestaat. Ondanks vooruitgang in synthese, zijn systematische studies over hoe verschillende geometrien interageren met cellen – met name glioblastoma, een hoog-proliferatieve en invasieve hersentumor – beperkt. Het begrijpen van deze interacties is essentieel voor het ontwerpen van nanomedicijnen die selectief kankercellen targeten terwijl off-target effecten geminimaliseerd worden.

Glioblastoma multiforme (GBM) blijft de dodelijkste primaire hersentumor, met een mediane overleving van minder dan 15 maanden ondanks agressieve therapie. U-87 MG glioblastoma-astrocytoma cellen prolifereren snel (verdubbelingstijd ~32 uur) en internaliseren gemakkelijk vreemde deeltjes, wat ze ideaal maakt voor opnamestudies. Hier presenteren we een uitgebreide vergelijking van vijf Au NS vormen, met focus op synthese, oppervlaktefunctionaliserings, cytotoxiciteit en opnamemechanismen in U-87 MG cellen.

Experimenteel

Materialen

Alle reagentia (oleïnezuur, zilvernitraat, CTAB, HAuCl₄·3H₂O, ascorbijnzuur, NaBH₄, PEG-SH, MUA, etc.) werden gekocht van Sigma-Aldrich of Merck en zonder verdere zuivering gebruikt. Oplossingen werden bereid met ultrazuiver water (18,2 MΩ cm).

Synthese van anisotrope Au NSs

Zaaddeeltjes (~5 nm) werden bereid door HAuCl₄ te reduceren met NaBH₄ in CTAB. Voor nanorods, tetrahexaedra en bipyramiden bevatte een groeioplossing CTAB, een co-surfactant (oleïnezuur of DDAB), AgNO₃ en ascorbijnzuur, verwarmd tot 80 °C. Na afkoeling werden zaadoplossing en HAuCl₄ toegevoegd, en het mengsel werd 24 uur bij 35 °C geroerd. Het aanpassen van de oleïnezuur/CTAB verhouding leverde de gewenste morfologie: lage verhoudingen produceerden dog-bone nanorods, hogere verhoudingen gaven uitgezaaide tetrahexaedra, en de CTAB/DDAB combinatie produceerde bipyramiden. Voor de nieuwe nano-makura vorm werd een tweestapsgroei gebruikt: een initiële zaad-gemedieerde reactie werd gevolgd door een tweede groeistap met de intermediaire oplossing, wat een driedimensionaal, irregulier deeltje produceerde dat een kussen lijkt (kussen = makura in het Japans).

Synthese van spherische Au NSs

SPs werden gefabriceerd via een gewijzigde Turkevich methode: een 10 mM natriumcitraat oplossing (10 mL) werd verwarmd tot 70 °C, gevolgd door druppelgewijze toevoeging van 1,5 mM HAuCl₄ (10 mL). Het mengsel werd purper-rood na ~8 min en werd afgekoeld tot kamertemperatuur voor centrifugatie (14 500 rpm, 10 min).

Oppervlaktefunctionaliserings

Deeltjes werden eerst geïncubeerd met PEG-SH (1 mg mL⁻¹) voor 2 uur om CTAB te vervangen en sterische stabilisatie te bieden. Na centrifugatie werden de PEGylerde NSs behandeld met MUA (250 µL 10 mM in EtOH/H₂O) voor 1 uur bij 55 °C, wat volledige CTAB-verwijdering en een negatieve oppervlaktelading bereikte. Grootte en zeta-potentiaal werden gemeten met DLS; XPS bevestigde de verwijdering van broom van het oppervlak.

Celkweek en vitaliteitstoets

U-87 MG cellen werden gekweekt in EMEM aangevuld met 10% FBS, 2 mM L-glutamine, 1% NEAA, 1 mM natriumpyruvaat en 1,25% gentamicine. Voor cytotoxiciteit werden cellen bij 70% confluentie geïncubeerd met Au NSs bij 100, 200, 500 µg mL⁻¹ en 2 mg mL⁻¹ voor 24 uur. Celdood werd gekwantificeerd door een LIVE/DEAD assay (calceïne AM en ethidium homodimer-1) en Hoechst kernkleuring, geïmageerd op een Zeiss Axiovert 200 M microscoop. Drie onafhankelijke putjes per concentratie werden geanalyseerd.

Tijdsafhankelijke opnamestudie (NM)

Cellen werden blootgesteld aan 2 mg mL⁻¹ NM voor 2, 6, 12 en 24 uur. Na incubatie werden cellen vastgezet met 2% paraformalhyde en 2,5% glutaraldehyde, post-gefixed met osmiumtetroxide (± kaliumferrocyanide), gedeshydrateerd en ingebettet voor ultradunne (70 nm) TEM coupes. TEM-beelden werden gebruikt om localisatie en morfologie van NM binnen cellulaire compartimenten te volgen.

Karakterisatie

Helder-veld STEM en HRTEM (JEOL 2100, 200 kV) beoordeelden morfologie en kristallijnheid. UV-Vis spectras (200–800 nm) werden opgemeten op een Shimadzu UV-2401PC. Dynamische lichtverstrooiing en zeta-potentiaal werden gemeten op een Malvern Zetasizer Nano-ZS. XPS werd uitgevoerd met een Kratos Axis Ultra DLD spectrometer (Al Kα, 1486,6 eV).

Resultaten en Discussie

Synthese en karakterisatie van anisotrope Au NSs

Zaad-gemedieerde groei met binaire surfactantia produceerde hoge-opbrengst nanorods (~20 nm × 50 nm), tetrahexaedra (~50 nm randlengte) en bipyramiden (~200 nm). De nano-makura deeltjes vertoonden een unieke, driedimensionale, irreguliere morfologie, bevestigd door TEM bij meerdere oriëntaties. HRTEM onthulde einkristallijne kernen met gladde facetten voor NRs, terwijl NM getande oppervlakken en een bredere LSPR-band vertoonde, wat hun polydispersiteit reflecteert. UV-Vis spectras vertoonden duidelijke longitudinale en transversale plasmonpieken: NRs (516, 679, 796 nm), THH (≈568 nm), BPs (≈593 nm), NM (≈557 en 760 nm). SPs toonden een enkele piek op 520 nm.

Oppervlaktefunctionaliseringsresultaten

DLS-metingen toonden incrementele grootte toenames na PEG-SH en MUA coating, behalve voor BPs waar een lichte afname werd waargenomen door strakkere pakking. Zeta-potentiaal verschuifde van positief (CTAB-gecoat) naar negatief (MUA-gecoat) waarden, wat succesvolle ligandenuitwisseling bevestigde. XPS-spectra toonden verwaarloosbaar brome, wat nabij-complete CTAB-verwijdering aantoonde. Optische spectras bleven grotendeels ongewijzigd, met alleen lichte piekverbreiding voor anisotrope vormen, toeschrijfbaar aan groottevergroting en oppervlakterauwhoud.

Vorm-afhankelijke cytotoxiciteit

LIVE/DEAD assays onthulden dat NM de hoogste celdood induceerde (~20% bij 2 mg mL⁻¹), terwijl SPs en BPs <5% cytotoxisch bleven over alle concentraties. NRs, ondanks hun hoge aspectratio en positieve oppervlaktelading, verhoogden celdood niet ten opzichte van andere vormen, wat suggereert dat oppervlakteladingmeting via zeta-potentiaal niet accuraat de ware lokale lading op anisotrope deeltjes weerspiegelt. Over het algemeen speelde grootte een kleine rol; zowel 15 nm SPs als 650 nm BPs vertoonden vergelijkbare opname en toxiciteit.

Opnamemechanismen van nano-makura

Tijdsaufgeloste TEM toonde NM associëren met het plasmamembraan na 2 uur, gevolgd door internalisatie via receptor-gemedieerde endocytose. Op 12 uur gaven vesikels met NM een schakeling naar macro-pinocytose aan, waarschijnlijk door aggregatie en proteïneadsorptie. NM lokaliseerde preferentieel aan de periferie van endosomen, uitgelijnd met het vesiculaire membraan, en transporteerde naar de perinucleaire regio. Op 24 uur correleerde uitgebreide vesiculaire accumulatie met morfologische veranderingen: cellen verloren filopodia, werden rond en losten zich van het substraat, wat cytoskeletale disruptie en apoptose aangeeft.

Discussie