GAL-GNR-siBRAF-nanosysteem: Gerichte BRAF-gen-uitdoving + fotothermische therapie om hepatoma-groei te stoppen

Samenvatting

Leverkanker is een van de meest voorkomende maligniteiten wereldwijd. RAF-kinaseremmers zijn effectief in de behandeling van hepatocellulair carcinoom (HCC); daarom is remming van de BRAF/MEK/ERK-route een nieuwe therapeutische strategie voor nieuwe HCC-therapie. Echter, gerichte specifieke leveringssystemen voor tumoren blij een belangrijk obstakel voor klinische toepassingen. Galactose (GAL) kan de asialoglycoproteïne-receptor (ASGPR) targeten die hoog tot expressie komt op leverkankercellen. In deze studie ontwierpen we een nieuw multifunctioneel nanomateriaal GAL-GNR-siBRAF dat uit drie delen bestaat: GAL als de leverkanker-targeterende moiety, gouden nanorods (GNR) die fotothermische capaciteit bieden onder nabij-infrarood licht, en siRNA die specifiek BRAF uitschakelt (siBRAF). De nanodrager GAL-GNR-siBRAF vertoonde een hoge siRNA-ladingscapaciteit en remde de afbraak van siRNA in serum. In vergelijking met ongemodificeerde gouden nanorods, bezat GAL-GNR-siBRAF lagere biotoxiciteit en hogere gen-uitdovingsefficiëntie. Behandeling met GAL-GNR-siBRAF verlaagde de expressie van BRAF significant en belemmerde proliferatie, migratie en invasie van leverkankercellen. Bovendien zorgden gecombineerde fotothermische effecten en BRAF-uitdoving door GAL-GNR-siBRAF effectief voor tumorceldood. Onze studie ontwikkelde dus een nieuw type gericht multifunctioneel nanomateriaal GAL-GNR-siBRAF voor de behandeling van leverkanker, wat ideeën biedt voor de ontwikkeling van nieuwe klinische behandelmethoden.

Inleiding

Hepatocellulair carcinoom (HCC) is een groot wereldwijd gezondheidsprobleem [1]. Het is de zesde meest voorkomende kanker ter wereld en de derde leidende oorzaak van kankergerelateerde sterfte [2, 3]. De meeste HCC-gevallen komen voor in Oost-Azië en subsaharaans Afrika. De incidentie stijgt echter in sommige ontwikkelde landen, waaronder Frankrijk, Groot-Brittannië, Japan en de VS [4]. De standaardbehandeling voor vroege HCC is chirurgische resectie van de tumor. Na operatie kan de 5-jaars-overlevingspercentage variëren van 89 tot 93% [5]. Helaas worden slechts een klein percentage HCC-patiënten (ongeveer 20–30%) in een vroeg stadium gediagnosticeerd; de meeste HCC-patiënten (> 70%) worden in een gevorderd stadium ontdekt en kunnen niet ondergaan chirurgische resectie. Andere behandelopties omvatten levertransplantatie, transcatheter arteriële chemo-embolisatie (TACE) en systemische chemotherapie [6]. Levertransplantatie wordt echter beperkt door de aanbod, onvolledige TACE-embolisatie kan leiden tot behandelfalen, met significante bijwerkingen van systemische chemotherapie en slechte algehele prognose. Daarom is er een hoge klinische vraag naar nieuwe behandelmethoden voor hepatocellulair carcinoom [7].

De RAS/RAF-signaalroute speelt een essentiële rol in de ontwikkeling van leverkanker, en BRAF is een van de essentiële kanker-geassocieerde genen in deze route. Genetische alteraties in deze genen resulteren vaak in twee gecascadeerde stoornissen. Abnormale activatie van de RAS/RAF-signaalroute is geassocieerd met slechte prognose bij kankerpatiënten [8]. BRAF is het meest gemuteerde gen in de RAF-familie, en het targeten van de RAS/RAF-route is een nieuwe therapeutische strategie voor de behandeling van HCC [8-10]. Sinds de RAF-kinaseremmer sorafenib effectief is gebleken in de behandeling van HCC, zijn BRAF-mutaties de voorkeurstarget voor HCC-therapie geworden [8]. Meer specifiek zijn BRAF-mutaties een gewenst target voor de behandeling van gevorderd HCC, aangezien de klinische ontwikkeling van de RAF-kinaseremmer sorafenib in HCC-behandeling in Azië, Europa en de VS is gevonden [11]. In vergelijking met placebo verhoogde sorafenib de algehele overleving door de mediaan algehele overleving van patiënten met gevorderd HCC te verlengen [12-14]. Echter, sorafenib heeft slechte tumor-targeterende capaciteit, wat kan leiden tot bijwerkingen zoals hoge bloeddruk, haaruitval en misselijkheid [15]. Geneesmiddelen die leverkanker met hoge specificiteit targeten en RAF blokkeren, moeten verder worden verkend.

De asialoglycoproteïne-receptor (ASGPR), ook bekend als de lever-galactose-receptor, is een C-type lectine geëxprimeerd op de sinusoidale oppervlakte van hepatocyten [16]. ASGPR wordt beschouwd als een essentieel target voor lever-nanostructuren omdat het een belangrijke rol speelt in binding, internalisatie en eliminatie van stoffen met terminale galactose-restgroepen [17]. Verschillende monosacchariden (galactose, mannose, lactose, N-acetylgalactosamine en zuurzuur) zijn gerapporteerd om in wisselende mate te interacteren met ASGPR, en galactose vertoonde een hogere affiniteit voor ASGPR [18]. Omdat ASGPR sterk blootgesteld is aan het oppervlak van leverparenchymcellen [19], heeft de receptor een sterke affiniteit voor galactose en gegalactoseerde prodrugs of leveringssystemen die de lever targeten. Galactose-nanodeeltjes [20], galactose-micellen [21] en galactose-liposomen [22] zijn geïdentificeerd als lever-targeterende drugsystemen, die specifiek targeten op hepatocellulaire carcinoide cellen.

Gouden nanorods (GNR) zijn staafvormige gouden nanodeeltjes die significante voordelen hebben als nanodragers [23]. Gouden nanorods (GNR) hebben een uitstekende biocompatibiliteit en kunnen gebruikt worden voor stabiele levering van siRNA [24]; ze hebben een groot specifiek oppervlak, wat flexibele modificatie van specifieke tumor-targeterende adapterstoelaat [25]; gelokaliseerde oppervlakte-plasmon-resonantie (LSPR) heeft hoge fotothermische conversie-efficiëntie onder nabij-infrarood bestraling en is een uitstekend fotothermisch anti-tumor materiaal geworden [26]. De maximale fotothermische efficiëntie kan bereikt worden door de aspectratio van de gouden nanorods (GNR) aan te passen. De in vitro en in vivo toxiciteit van gouden nanodeeltjes hangt af van hun grootte, oppervlaktelading en oppervlaktecoating [27]. Echter, cetyltrimethylammoniumbromide (CTAB) is een essentieel actief agens in de synthese van gouden nanorods, dat duidelijke cytotoxiciteit vertoont en biologische toepassingen beperkt [28].

RNA-interferentie (RNAi) is een veelbelovende benadering voor kankerbehandeling omdat het effectief targetgenen uitschakelt of dempt door kleine interfererende RNA (siRNA) [29]. Recentelijk zijn siRNA-moleculen de menselijke proefase binnengegaan en worden beschouwd als veelbelovende manieren om meerdere gemuteerde gen-kankers en tumoren te behandelen [30]. De toepassing van siRNA staat echter nog steeds voor enorme uitdagingen zoals seruminstabiliteit (afbraak door nucleasen in de extracellulaire omgeving) en off-target effecten [31]. Bovendien zijn siRNA's negatief geladen, wat hen verhindert om te binden aan negatief geladen celmembranen [32]. Vanwege deze kenmerken is siRNA zelf onwaarschijnlijk direct aan cellen te leveren. De stabiliteit van siRNA kan verbeterd worden door chemische modificatie van siRNA of door siRNA-laders in beschermende dragermaterialen te plaatsen [33].

In deze studie hebben we een nieuw multifunctioneel nanodrager GAL-GNR-siBRAF geconstrueerd. Het systeem gebruikt gouden nanorods met optische warmte-opwekkende capaciteit als innerkern en extern gemodificeerd GAL (d-galactose) met specifieke targeting van lever-tumorren. Dit systeem verminderde de biologische toxiciteit van CTAB op het oppervlak van gouden nanorods en vertoonde een hoge siRNA-ladingscapaciteit en kan gebruikt worden om het BRAF-gen in leverkanker effectief uit te schakelen. De toepassing van GAL-GNR-siBRAF dempte proliferatie, invasie en migratie van leverkankercellen significant. Bovendien induceerde GAL-GNR-siBRAF gelijktijdig gen-uitdoving van BRAF en fotothermische effecten die synergistische effectiviteit in de dodelijke capaciteit van tumorcellen bereikten, wat een nieuwe manier van denken biedt voor de ontwikkeling van klinische behandeling van leverkanker.

Materiaal en methoden

Cellijn

De muis hepatocellulaire carcinoom cellijn Hepa1-6 werd gekocht van de Stamcelbank, Chinese Academie van Wetenschappen. Cellen werden gekweekt in DMEM-medium (Life Technologies, Carlsbad, CA) bevattend 10% FBS bij 37 °C met 5% CO₂.

Synthese van BRAF siRNA

De sequentie voor siRNA gericht op het BRAF-gen is 5′-GCUUACUGGAGAGGAGUUACA-3′ en werd gesynthetiseerd door Dharmacon, Inc. (Lafayette, CO, VS). Het commercieel beschikbare gerichte luciferase-gen siGL2 werd gebruikt als negatieve controle siRNA.

Synthese van CTAB-GNR

Water-oplosbare gouden nanorods werden gesynthetiseerd met behulp van een zaad-gemedieerde groeiroute [34]. De zaadoplossing werd als volgt vervaardigd: 1 mL cetyltrimethylammoniumbromide (CTAB) (0,2 M) (Sinopharm) werd zacht gemengd met 1 mL HAuCl₄ (0,5 mM) (Sinopharm). De oplossing werd geroerd bij 28 °C, grondig gemengd en 0,12 mL koud NaBH₄ (0,01 M) (Sinopharm) toegevoegd tot de verkregen zaadoplossing bruin werd en in reserve bleef. De groeioplossing werd vervolgens als volgt gesynthetiseerd: 50 mL CTAB (0,2 M) en 50 mL HAuCl₄ (1 mM), 2,5 mL AgNO₃ (4 mM) (Sinopharm) werden licht gemengd bij 28 °C. Na grondige zacht menging werd 670 μL azijnzuur (0,079 M) toegevoegd toen de kleur van de oplossing veranderde van donkergeel naar kleurloos. Honderdtwintig microliter van de zaadoplossing werd onder zachte agitatie bij 28 °C toegevoegd, en de kleur werd geleidelijk transparant van paars naar paars-zwart. Na 24 uur roeren bij constante temperatuur werd de oplossing gecentrifugeerd bij 12.000 toer/min gedurende 10 min om overtollige CTAB te verwijderen en vriesgedroogd tot GNR-poeder voor toekomstig gebruik.

Synthese van MUA-PEI en GAL-PEI-MUA

Mercaptoundecaanzuur (MUA; 654 mg) werd opgelost in 30 mL chloroforme (CHCl₃) en vervolgens geïnculeerd met 100 mmol 1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride (EDC) en 100 mmol N-hydroxysuccinimide (NHS) gedurende 15 min bij kamertemperatuur. Vervolgens werd 100 mmol polyethyleenimine (PEI) aan de bovengenoemde oplossing toegevoegd. Na 24 uur reactie bij kamertemperatuur werd een gelijk volume gedemineraliseerd water gebruikt om de water-oplosbare PEI-MUA te extraheren. Dezelfde methode werd gebruikt om de activatie van d-galactose in waterige oplossing te voltooien. Vervolgens werd een excess geactiveerde d-galactose (500 mmol) aan de bovengenoemde water-oplosbare PEI-MUA-oplossing toegevoegd, en de reactie werd voldoende uitgevoerd bij kamertemperatuur gedurende 24 uur om een water-oplosbaar GAL-PEI-MUA-complex te verkrijgen.

Synthese van GAL-PEI-MUA-GNR (GAL-GNR) en PEI-MUA-GNR (PEI-GNR)

Vriesgedroogd CTAB-GNR-poeder (10 mg) werd opgeschud in 10 mL water-oplosbare PEI-MUA of GAL-PEI-MUA-complexen. CTAB werd vervangen door Au–S-binding toen er 24 uur bij kamertemperatuur gerost werd. De oplossing werd gecentrifugeerd bij 12.000 toer/min gedurende 15 min om overtollige supernataant te verwijderen, en het neerslag werd drie keer gewassen met gedistilleerd water. PEI-GNR of GAL-GNR-poeder werd bereid door vriesdrogen, geweegd en opgelost in ribonuclease-vrij water, en vervolgens werd het plasma-resonantie-effect waargenomen door een multifunctionele enzymanalysator (Spectra Max M5e, MD, VS).

Transmissie-elektronenmicroscopie

De GNR of GAL-GNR werd opgeschud in gedistilleerd water, en de resuspensie werd op een koperen rooster geplaatst. Na de monsters op het koperen gaasje 30 minuten in de lucht volledig waren gedroogd, werd het koperen gaasje geïmageerd met een transmissie-elektronenmicroscoop (LIBRA 120, Carl Zeiss, Duitsland).

Ultraviolet-zichtbare analyse

De GNR, PEI-GNR of GAL-GNR werd opgeschud in gedistilleerd water. Het oppervlakte-plasmon-resonantie-effect van nanomaterialen in het golflengtebereik van 600 tot 900 nm werd onderzocht met een multifunctionele microplaatlezer (SpectraMax M5e, MD, VS).

Zeta-potentiaal en hydrodynamische diameter analyse

De GNR, PEI-GNR of GAL-GNR werd opgeschud in gedistilleerd water, en vervolgens werden het zeta-potentiaal en de hydrodynamische diameter van het nanomateriaal gemeten op een Zetasizer Nano ZS.

Kernmagnetische resonantie analyse

Het GAL-GNR vriesgedroogde poeder werd opgelost in zwaar water (99%, Sigma) om een homogene suspensie te maken, en de suspensie werd vervolgens overgebracht naar een NMR-monstertje. De samenstelling van GAL-GNR werd bepaald door kernmagnetische resonantie (NMR) (Bruker, 600 MHz, Duitsland).

Gel-shift assay

GAL-GNR en siBRAF werden gemengd volgens de massaverhouding (0:1, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1). Na incubatie bij kamertemperatuur gedurende 30 min, werd het DNA-ladingsbuffer aan het mengsel toegevoegd. Alle monsters werden aan 2% agarosegel met 0,01% Goldview (Bioshop, VS) toegevoegd en vervolgens geëlectrofoseerd bij 90 V gedurende 30 min. De graad van siBRAF-inpakking werd gevisualiseerd op het gel-imaging-systeem.

Stabiliteit van siRNA in serum

Het mengsel van GAL-GNR-siBRAF (6:1) werd geïnculeerd in vers muissereüm bij 37 °C gedurende respectievelijk 0 h, 3 h, 6 h, 12 h, 24 h en 48 h. De naakte siBRAF plus vers muissereüm groep werden onder dezelfde condities behandeld. Een gelijk volume 2% natrium dodecylsulfate (SDS) werd aan de GAL-GNR-siBRAF-oplossing toegevoegd. Na incubatie gedurende 30 min bij kamertemperatuur werd DNA-ladingsbuffer toegevoegd, en alle monsters werden op een 2% agarosegel (bevattend 0,02% Goldview (Bioshop, VS)) geladen en geëlectrofoseerd bij 90 V gedurende 30 min. De striphelderheid van de siBRAF werd gevisualiseerd op een gel-imaging-systeem.

Competitie-inhibitie-assay van GAL-GNR-siBRAF

2 × 10⁵ Hepa1-6-cellen werden overnight in 12-put microplaten gekweekt. Vervolgens werden de cellen 12 uur voorbehandeld met lactobionzuur en vervolgens getransfecteerd met GAL-GNR-siBRAF (Cy3-gelabeld) gedurende 30 min. De intracellulaire fluorescente intensiteit werd bepaald door fluoresentiemicroscopie (schaalkwant = 200 μm).

Leverkanker-targeterende leveringscapaciteit van GAL-GNR-siBRAF

Eén microgram cy3-gelabelde siBRAF werd geïnculeerd met PEI-GNR (30 μg/mL), GAL-GNR (30 μg/mL) gedurende 20 min bij kamertemperatuur, en vervolgens aan het medium van Hepa1-6-cellen toegevoegd. Na incubatie gedurende 30 min werden de cellen driemaal gewassen met 50% FBS, en de fluorescente intensiteit in de cellen werd gemeten onder een fluoresentiemicroscoop.

Fotothermische effecten

Twintig, 40, 60, 80 en 100 μg GAL-GNR en 100 μg GNR vriesgedroogd poeder werden grondig opgelost in 1 mL gedistilleerd water. De oplossing werd aan een 24-put plaat toegevoegd en continu bestraald met een 803 nm nabij-infrarood laserbron (2 W/cm²) gedurende 15 min. De temperatuur van elke groep werd vastgelegd met een infrarood thermometer elke 0,5 min gedurende de eerste 5 min, en vervolgens werd de temperatuur elke 1 min gemarkeerd.

MTT-assay

Tweehonderd microliter cellen (3,5 × 10⁴/mL) werd in 96-put microplaten gekweekt gedurende 24 h en vervolgens gekweekt met verschillende concentraties GNR of GAL-GNR (0, 15, 30, 45, 60, 75, 90, 105, 120 μg/mL). Na 24 of 48 uur incubatie werd 20 μL MTT aan het kweekeisysteem toegevoegd en 4 uur geïnculeerd. De paarse kristallen werden opgelost in 150 μL DMSO, gevolgd door spectrophotometrische analyse bij 490 nm met een referentie van 650 nm in een microplaatlezer (SpectraMax M5e, MD, VS).

Calcein-AM en PI-kleuringstest

Hepa1-6-cellen (1,5 × 10⁵) werden overnight in een 12-put plaat gehouden en behandeld met PBS, laser, GAL-GNR-siBRAF (30 μg/mL:1 μg), GAL-GNR-siGL2 (30 μg/mL:1 μg) + laser of GAL-GNR-siBRAF (30 μg/mL:1 μg) + laser gedurende 4 h, en vervolgens bestraald met nabij-infrarood licht (808 nm, 2 W/cm²) gedurende 15 min. De cytotoxiciteit van GAL-GNR werd gedetecteerd door calcein-AM (levende cellen) en PI (dode cellen) kleuringsexperimenten. Groene fluoresentie van calcein-AM en rode fluoresentie van PI werden gefotografeerd onder fluoresentiemicroscopie.

Real-time kwantitatieve PCR

Totaal cellulaire RNA werd geëxtraheerd met Trizol (Trizol reagent, Invitrogen) en als matrix gebruikt voor cDNA-synthese. Q-PCR werd uitgevoerd met gen-specifieke forward en reverse primers (0,5 μL × 10 μM elk) in het Stratagene Mx3000P qRT-PCR-systeem (Agilent Technologies, Lexington, MA, VS). SYBR green PCR MasterMix (Life Technologies) werd gebruikt volgens het schema van de fabrikant. Huishoudgen β-actine werd gebruikt als interne referentie. De primersequenties waren β-actine: 5′AGGGAAATCGTGCGTGACATCAAA-3′ (forward) en 5′ACTCATCGTACTCCTGCTTGCTGA-3′ (reverse); BRAF: 5′-CAATTGGCTGGGACACGGACAT-3′ (forward) en 5′-TTGACAACGGAAACCCTGGAAAAG-3′ (reverse). Het verschil in genexpressie werd berekend en weergegeven door de 2⁻ΔΔCt-methode.

Western blot

Het totale eiwit van Hepa1-6-cellen werd verkregen door RIPA-buffer (Cell signaling, Pickering, Ontario, Canada) en gekwantificeerd door bicinchoninezuur (BCA). Eiwit werd gescheiden in 12% SDS-PAGE en overgebracht naar Polyvinylidene fluoride (PVDF). Het huishoudgen β-actine werd gebruikt als interne referentie om BRAF-eiwitexpressie te detecteren. Het eiwitband en de interne referentie van het doel-eiwit werden gedetecteerd door ECL chemiluminescentie.

Krabbelttest

De getransfecteerde Hepa1-6 (1,7 × 10⁵/mL) cellen werden overnight in 12-put platen gezaaid. Cellen die volledig aan de plaat gehecht waren, werden gekrabbeld met een 10-μL pipettip. De cellen werden tweemaal gewassen met PBS en vervangen door medium met 2% FBS. De gemiddelde wondlijn werd waargenomen onder een microscoop na 0, 24 en 48 h. Elke krabbelttest werd in drieploeg uitgevoerd.

Transwell-assay voor migratie en invasie

Acht-micrometer transwell-kamers (Corning Life Science) werden gebruikt om celmigratie en invasie te beoordelen. Hepa1-6 opgeschud in 200 μL serumvrij medium werden aan de bovenkamers toegevoegd met een dichtheid van 1,7 × 10⁵ mL cellen/put, en vervolgens werd 500 μL medium met 12% FBS aan de onderkamer toegevoegd. Na incubatie gedurende 24–48 h werden de cellen gefixeerd met een 4% paraformaldehyde-oplossing gedurende 30 min, en vervolgens gekleurd met een 1% kristalvioletooplossing gedurende 30 min. Ten slotte werden de cellen gefotografeerd en geteld onder een geïnverteerde microscoop. Voor de celinvasie-assay is ECM-geleicoating vereist, en de overige stappen zijn consistent.

Statistiek

Alle experimenten werden in drieploeg uitgevoerd. Data werden uitgedrukt als gemiddelde ± SD en Student's t-toets (tweezijdig) om het verschil tussen de twee methoden te bepalen. Een eensidige ANOVA-toets werd gebruikt voor vergelijking van meerdere groepen. Data werden als statistisch significant beschouwd bij p < 0,05 (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001).

Resultaten

Synthese en karakterisering van nanodrager GAL-GNR-siBRAF

We ontwierpen een nieuwe nanodrager GAL-GNR die in staat is om kleine interfererende RNA (siRNA) naar levercellen te leveren en tegelijkertijd het fotothermische effect van de gouden nanorods te behouden. De syntheseprocedure van GAL-GNR is weergegeven in Schema 1. Dit lever-getargete systeem bevat drie functionele componenten. Ten eerste is het basisonderdeel van GAL-GNR een GNR-skelet, dat ongeveer 30 nm in lengte en 10 nm in diameter is, zoals getoond in de TEM-afbeelding (Afbeelding 1a) en chemisch geconjugeerde GNR (GAL-GNR) vertoonde geen significante dimensionele verandering en bezat nog steeds goede disperseerbaarheid (Afbeelding 1b). De deeltjesgrootte-data toonden aan dat de gemiddelde grootte van GNR 30,23 nm was, wat consistent was met de resultaten van elektronenmicroscopie, en de grootte van GAL-GNR (50 nm) en PEI-GNR (42,35 nm) was groter dan GNR omdat de conjugatie van GAL en PEI de hydratatie tussen deeltjes verhoogde (Afbeelding 1c). Ten tweede werd het biologisch toxische CTAB op het oppervlak van GNR vervangen door positief geladen MUA-PEI dat geladen kan worden met negatief geladen siRNA. De zeta-potentiaalmeting toonde aan dat de oppervlaktelading van GNR toename van 35,6 tot 42,7 mV of 41,8 mV toen de GNR gemodificeerd werden met PEI of GAL-PEI respectievelijk, wat aangeeft dat GAL-GNR een sterke capaciteit bezat om siRNA te binden (Afbeelding 1d). Ten derde pasten we GAL toe als leidende molecuul om GNR-nanodragers te conjugeren, wat gebruikt kan worden voor specifieke homing van hepatocellulair carcinoom. UV-Vis-absorptiespectroscopie werd gebruikt om de structuur van gemodificeerde GNR voorlopig te detecteren. De initiële absorptiespectrumgolflengte van ongemodificeerde GNR was 763 nm; een verschuiving van 7 nm in golflengte werd initieel waargenomen met de MUA-PEI-modificatie, en nog een verschuiving van 8 nm werd aan het einde van de synthese waargenomen, toen de modificatie van GNR met GAL succesvol was (Afbeelding 1e). Om GAL in het nano-systeem te bevestigen, werd NMR-afbeelding gebruikt om de chemische groepen te analyseren. De resultaten toonden aan dat het H-signaal van galactose alleen in het GAL-GNR-spectrum op het NMR-waterstofspectrum werd gevonden, namelijk δ: 3,60, 3,65, 3,70, 3,78, 3,90, 4,53. NMR-spectra bevestigden de chemische structuur van GAL, waarin GAL succesvol geconjugeerd was aan het GNR-oppervlak (Afbeelding 1f).

siRNA-inkapselingsvermogen en stabiliteit van GAL-GNR

Het GAL-GNR-nanoskelet werd gemodificeerd door positief geladen PEI, wat gecombineerd kan worden met negatief geladen siRNA door elektrostatische interactie. We gebruikten gel-shift assay om het siRNA-bindingsvermogen van GAL-GNR te evalueren. Vrije siRNA kan langs de gang van het gel bewegen terwijl gebonden siRNA vertraagd of volledig gestopt wordt. Bovendien zal gebonden siRNA niet meer effectief binden aan bromide, en dus zal de fluorescente intensiteit dienovereenkomstig afnemen. Het gel-elektroforese-resultaat toonde aan dat de optimale verhouding voor verzadiging van GAL-GNR met siBRAF 6:1 (w/w) is (Afbeelding 2a).

Naakte siRNA is heel afbreekbaar, vooral in vivo. Een belangrijke functie van het leveringssysteem is om siRNA te beschermen tegen afbraak. Dus testten we het beschermende effect van nanodrager GAL-GNR op siRNA in vers serum. In vergelijking met naakte siRNA, werd de gebonden siRNA langer in serum opgeslagen. Zoals getoond in Afbeelding 2b, kon naakte siRNA tot 12 uur in serum bestaan, terwijl de gebonden siRNA nog steeds overvloedig was na 48 uur. Het resultaat toonde aan dat GAL-GNR siRNA effectief kan voorkomen tegen afbraak in serum, wat gerichte levering in vivo garandeert.

Cytotoxiciteit van nanomaterialen

Lage biologische toxiciteit is een andere belangrijke eigenschap van nanomaterialen, die hen in staat stelt om in kankerbehandeling gebruikt te worden. Om de biocompatibiliteit van deze nieuwe GAL-GNR-nanostructuur te evalueren, testten we de cytotoxiciteit. Zoals getoond in Afbeelding 3, werden dode cellen van Hepa1-6 in de ongemodificeerde GNR-behandelde groep initieel waargenomen bij een lage concentratie van 30 μg/mL. Na incubatie met 75 μg/mL GNR gedurende 24 h was de celdoodpercentage tot 56,09%, en de sterfte steeg tot 75,5% na incubatie gedurende 48 h. In tegenstelling verminderde GAL-modificatie de cytotoxiciteit significant. Na 48 uur incubatie met GAL-GNR waren meer dan 80% cellen nog levend zelfs bij hoge concentratie (105 μg/mL). Deze gegevens suggereerden dat de nanodrager GAL-GNR een hoge biocompatibiliteit had in vergelijking met GNR, wat de veiligheid van toepassing garandeert.

Hepatoomcellen-targeterende levering van siRNA en gen-uitdoving van BRAF in vitro

De capaciteit om siRNA in kankercellen te leveren is een van de belangrijkste functies van nanomaterialen. Om het potentieel van GAL-GNR in siRNA-levering te onderzoeken, detecteerden we de efficiëntie van gen-uitdoving met siBRAF geladen door GAL-GNR in Hepa1-6-cellen. In vergelijking met de blanco-groep, had de expressie van BRAF in GAL-GNR-siGL2 (negatieve controle) getransfecteerde cellen geen verandering, terwijl de cellen getransfecteerd met GAL-GNR-siBRAF een significante afname vertoonden (Afbeelding 4a). Bovendien was het dempingseffect dosis-afhankelijk, wat gecorreleerd is met de toename van GAL-GNR-concentratie. De qPCR-resultaten toonden aan dat de ideale transfectieconcentratie van GAL-GNR-siBRAF 30 μg/mL was, en de dempingsefficiëntie kon 90,29% bereiken, wat vergelijkbaar was met de lipofectamine 2000 groep (positieve controle). Het resultaat van western blot was consistent met qPCR, en de eiwitexpressie van BRAF was na 48 uur transfactie gedempt (Afbeelding 4b).

Lactobionzuur is in structuur vergelijkbaar met GAL wat competitief kan binden aan de asialoglycoproteïne-receptor (ASGPR) die tot expressie komt op het oppervlak van hepatocellulaire carcinoom celmembraan [35]. Om de specifieke targeteringsefficiëntie van GAL-GNR te bevestigen, werden Hepa1-6-cellen voorgeïnculeerd met lactobionzuur en vervolgens getransfecteerd met GAL-GNR-siBRAF. Onbehandelde cellen werden gebruikt als blanco-controle, en klassiek transfactiereagens lipofectamine 2000 werd gebruikt als positieve controle. Zoals getoond in Afbeelding 4c, was de rode fluorescente intensiteit van GAL-GNR-getransfecteerde cellen vergelijkbaar met de positieve controlegroep, terwijl de fluorescente intensiteit van PEI-GNR-getransfecteerde cellen significant verminderd was. Aan de andere kant, cellen getransfecteerd met alleen GAL-GNR-siBRAF vertoonden sterkere rode fluoresentie van Cy3 dan Hepa1-6-cellen voorbehandeld met lactobionzuur (Afbeelding 4c), en het qPCR-resultaat was consistent met die van de rode fluoresentieresultaten (Afbeelding 4d). Deze resultaten illustreerden verder dat GAL effectief de endocytose van siRNA door Hepa1-6-cellen bevorderde en kan worden toegepast als targeterende moiety van HCC.

De impact van GAL-GNR-siBRAF op proliferatie, migratie en invasie van Hepa1-6-cellen

BRAF speelt een belangrijke rol in de MAPK-route, die verantwoordelijk is voor de regulatie van celproliferatie, migratie en invasie [36]. Om de impact van GAL-GNR-siBRAF op hepatocellulaire carcinoomcellen te beoordelen, analyseerden we eerst de celproliferatie door MTT-assays. Zoals getoond in Afbeelding 5a, was de proliferatie van GAL-GNR-siBRAF-getransfecteerde Hepa1-6-cellen significant verlaagd in vergelijking met GAL-GNR-siGL2 (negatieve controle) of PBS-behandelde cellen. Vervolgens onderzochten we het effect van GAL-GNR-siBRAF op celmigratie door krabbel- en transwell-assays. In vergelijking met negatieve controlecellen, was de migratiecapaciteit van Hepa1-6-cellen die getransfecteerd waren met GAL-GNR-siBRAF duidelijk verminderd (Afbeelding 5b–d).

Om het potentieel van GAL-GNR-siBRAF op de invasie verder te onderzoeken, werden transwell-assays uitgevoerd. De resultaten toonden aan dat Hepa1-6-cellen getransfecteerd met GAL-GNR-siBRAF de invasie van Hepa1-6 significant verminderden, in vergelijking met GAL-GNR-siGL2 of PBS (Afbeelding 5e en f). De bovenstaande resultaten impliceerden dat uitdoving van het BRAF-gen met behulp van GAL-GNR-siBRAF-complexen effectief migratie en invasie van hepatocellulaire carcinoomcellen kan reduceren.

Combinatiebehandeling met fotothermisch effect en gen-uitdoving van GAL-GNR-siBRAF

Onze eerdere studies hebben aangetoond dat gouden nanomaterialen thermische energie kunnen genereren onder nabij-infrarood straling [37]; dit fenomeen wordt fotothermisch effect genoemd door LSPR-eigenschappen van de GNR. Onze resultaten toonden aan dat, met de toename van GAL-GNR-concentratie, de warmteproductiecapaciteit van GAL-GNR versterkt werd. Wanneer de concentratie van GAL-GNR 100 μg/mL is, stijgt de temperatuur snel van 24 tot boven 60 °C. Bovendien was er geen significant verschil in warmteproductiecapaciteit tussen GNR en GAL-GNR (Afbeelding 6a).

Het nieuwe nano-systeem GAL-GNR-siBRAF bezit drie individuele kenmerken: specifieke targeting van leverkanker, siRNA-gebaseerde gen-uitdoving van BRAF, en GNR-aangeboden fotothermische effecten. Dus bestudeerden we verder het synergistische therapeutische effect van GAL-GNR-siBRAF in anti-tumorbehandeling. Hepa1-6-cellen zonder GAL-GNR bleven hogere levensvatbaarheid behouden zelfs onder nabij-infrarood straling, wat suggereert dat de laser zelf geen significant effect had op tumorcellen. Eenmaal de laserbestraaling uitgevoerd op basis van GAL-GNR-siGL2-behandeling, toonde het fotothermisch effect krachtige dodelijke capaciteit op Hepa1-6-cellen. Hoewel BRAF-gen-uitdoving alleen celdood induceerde, was het effect niet conclusief. De behandeling van cellen met het nanomateriaal GAL-GNR-siGL2 plus laserbestrailing resulteerde in veel sterkere celdodende capaciteit dan BRAF-gen-uitdoving individueel (Afbeelding 6b). Deze gegevens geven aan dat BRAF-gen-uitdoving en fotothermisch effect synergistisch het potentieel van het doden van tumorcellen kunnen verhogen.

Discussie

Moeilijkheden in tumor-getargete levering zijn grote obstakels in de klinische behandeling van tumoren. Deze studie toonde voor het eerst aan dat we een nieuwe multifunctionele nanodrager GAL-GNR-siBRAF hebben ontwikkeld, en deze werd voorzien van veel voordelen. De gemodificeerde GAL-GNR bezat niet alleen goede biocompatibiliteit maar behield ook de LSPR-fenomenen van het GNR-skelet en heeft nog steeds uitstekende fotothermische conversiecapaciteit. GNR gemodificeerd met GAL kan hepatocellulaire carcinoomcellen homing via ASGPR, wat groot potentieel heeft in gerichte moleculaire therapie van hepatocellulair carcinoom. Verdere studies toonden aan dat BRAF-gen-uitdoving de proliferatie, migratie en invasie van hepatomcellen remde. Het is opmerkelijk dat GAL-GNR-siBRAF een sterkere celdodende capaciteit vertoont in de combinatie van fotothermisch effect en gen-uitdoving van BRAF.

RNA-interferentie (RNAi) heeft veel aandacht getrokken vanwege zijn cruciale rol in genexpressie en -regulatie. Het gebruik van siRNA om sequentie-specifieke genen in kankercellen uit te schakelen voor gentherapie is een effectieve en specifieke gerichte gentherapie, en is een nieuw therapeutisch instrument geworden voor veel ziekten inclusief kanker [29, 31]. Echter, lage stabiliteit in serum en slechte celopname beperken siRNA in klinische toepassing [38]. Aan de andere kant bezit siRNA negatieve lading die het verhindert om te binden aan negatief geladen celmembranen, en siRNA zelf is onwaarschijnlijk direct in cellen te leveren [32, 39]. Bovendien zijn er problemen geassocieerd met lage transfactie-efficiëntie en slechte celinternalisatie in siRNA-therapie [40]. Deze barrières belemmeren de levering van siRNA aan targetcellen. Om de siRNA-stabiliteit te verbeteren en de gen-uitdovingsefficiëntie te versterken, synthetiseerden we een nieuwe nanodrager, GAL-GNR-siBRAF, die drie componenten omvat (Schema 1). Deze nanodrager heeft een lage moleculaire grootte (ongeveer 30 nm lengte en 10 nm diameter) en goede disperseerbaarheid (Afbeelding 1). Bovendien kan GAL-GNR-siBRAF effectief grote hoeveelheden siRNA laden bij lage concentratie (Afbeelding 2a) en beschermt siRNA-afbraak door RNase in serum; het siRNA werd bewijsbaar stabiel voor ten minste twee dagen bij 37 °C in aanwezigheid van vers muissereüm (Afbeelding 2b).

Goede biocompatibiliteit is essentieel voor nanomaterialen gebruikt in het veld van biotherapie. CTAB is een essentieel actief reagent in de synthese van gouden nanorods, hoewel het duidelijke cytotoxiciteit vertoont die de biologische toepassing beperkt [41]. Om de cytotoxiciteit van het materiaal te verminderen, manipuleerden we de GNR door externe modificatie van positief geladen PEI en targeterende adaptor GAL (d-galactose). Onze resultaten toonden aan dat, in vergelijking met ongefuntionaliseerde GNR, GAL-gemodificeerde GNR een betere biocompatibiliteit had. De cellevensvatbaarheid bleef boven 80% zelfs bij zeer hoge concentraties (105 μg/mL) van GAL-GNR gedurende 48 h (Afbeelding 3). Bovendien vergemakkelijkt de kleine moleculaire grootte en cilindrische vorm van de nanorod de penetratie door het celmembraan in de cel [37, 38, 42]. Dit fenomeen is met name duidelijk in gerichte therapie van kankercellen. Nano-construct gemodificeerd met galactose-targeterende moieties resulteerde in hoge accumulatie van GAL-GNR-siBRAF in tumorcellen, wat effectieve downregulatie van BRAF-genexpressie induceerde (Afbeelding 4). Bovendien, volgens de competitieve inhibitie-experimenten, vonden we dat GAL-GNR de cellen voornamelijk binnenkwam via ASGPR-oppervlaktereceptoren van Hepa1-6-cellen (Afbeelding 4c).

Het is gerapporteerd dat HCC met hoge expressie van BRAF en RAF1 neigt tot snelle proliferatie en groei [41, 43, 44]. B-Raf en Raf1 werken voornamelijk op de downstream van ERK/MAPK-route, regulerend nucleaire factoren door cascaderende amplificatie. Activatie van deze route versnelt de proliferatie en differentiatie van HCC-cellen abnormaal [41, 44, 45]. RAF-gen kan ook de expressie van matrix-metalloproteïnases (MMPs) bevorderen, wat de adhesie van tumorcellen kan veranderen, extracellulaire matrix (ECM) en basalmembraan kan afbreken, en de invasie en metastase van tumoren kan bevorderen [44, 45]. BRAF-kinase reguleert de RAS-RAF-MEK-ERK-route, die tumorcelproliferatie, invasie en metastase bevordert, en celdood via apoptose toelaat [5, 46, 47]. In eerdere werk vonden we dat het BRAF-gen hoog tot expressie kwam in Hepa1-6-cellen (gegevens niet getoond). Er wordt gespeculeerd dat de uitdoving van BRAF-expressie in Hepa1-6 de RAS-RAF-MEK-ERK-route zal blokkeren en biologische veranderingen van Hepa1-6 zal leiden. Om onze hypothese te verifiëren, transficeerden we hepatocellulaire carcinoomcellen met GAL-GNR-siBRAF en vonden we dat het de celproliferatie, migratie en invasie significant kan remmen (Afbeelding 5), wat een nieuwe strategie biedt voor klinische behandeling van hepatocellulair carcinoom.

Een ander belangrijk voordeel van GNR is dat het lokale oppervlakte-plasmon-resonantie (LSPR) bezit, dat geabsorbeerde lichtenergie kan omzetten in warmte-energie onder nabij-infrarood lichtbestrailing, waardoor cellen gedood en vernietigd worden [42]. Vervolgens verkenden we de licht-naar-warmte conversiecapaciteit van GAL-GNR, en de resultaten toonden aan dat de gemodificeerde GAL-GNR effectief warmte-energie kan induceren onder bestraling van nabij-infrarood licht (Afbeelding 6a). Vervolgens onderzochten we verder de synergistische effecten van GAL-GNR-siBRAF. Terwijl BRAF-gen-uitdoving beperkte cytotoxiciteit vertoonde, had de behandeling van GAL-GNR-siGL2 + laser een veel sterkere dodelijke capaciteit op tumorcellen. Tegelijkertijd kon de combinatie van fotothermische hyperthermie en BRAF-gen-uitdoving meer dan 85% celdood veroorzaken (Afbeelding 6b) wat aangeeft dat de synergie van GAL-GNR-siBRAF en fotothermische effecten een ideale strategie kan zijn om leverkanker te remmen.

Conclusie

Deze studie toonde aan dat GAL-GNR-siBRAF het obstakel van siRNA-afbraak overkomt, effectief de stabiliteit van siRNA in serum in vitro verhoogt. Bovendien kan GAL-GNR-siBRAF siRNA targetgericht leveren aan hepatocellulaire carcinoomcellen en de expressie van BRAF uitschakelen en de celproliferatie, invasie en migratie significant remmen. Belangrijker nog, GAL-GNR-siBRAF, als een nieuwe multifunctionele nanodrager, kan de capaciteit om tumorcellen te doden aanzienlijk verhogen wanneer gecombineerd met nabij-infrarood licht. Concluderend, GAL-GNR-siBRAF heeft groot potentieel in de behandeling van hepatocellulair carcinoom en biedt nieuwe ideeën voor klinische toepassing van leverkanker.