Optimalisatie van nano-inkapseling op neonatale varkenseilandachtige celclusters met behulp van polymeren

Inleiding

Het gebruik van allo-eilandjestransplantatie bij de behandeling van type 1 diabetes is beperkt vanwege een gebrek aan geschikte donoren. In plaats daarvan is er een geleidelijke toename van het gebruik van dierlijke eilandjes bij transplantatie van xeno-eilandjes, waarbij varkens opkomen als optimale donorsoorten [1]. Wanneer varkens als donor worden gebruikt tijdens transplantatie, kunnen afzonderlijke eilandjes worden gebruikt, gebaseerd op de leeftijd van de varkens. Vaak hebben neonatale varkenseilandjesachtige celclusters (NPCC's) de voorkeur boven volwassen varkenseilandjes (API's) vanwege hun betaalbaarheid en gemakkelijke isolatie. Bovendien kunnen NPCC's zich na transplantatie geleidelijk vermenigvuldigen, waardoor hun functie in vivo wordt verlengd [1, 2]. Wanneer NPCC's echter worden getransplanteerd in poortaderen van menselijke of niet-menselijke primaten (NHP), kunnen variaties tussen soorten immuunreacties veroorzaken, zoals een directe bloedgemedieerde ontstekingsreactie (IBMIR) of hyperacute afstoting, wat leidt tot vroeg transplantaatverlies [3]. Om dit probleem op te lossen, is inkapseling van NPCC's vereist die verschillende immuunresponsen kunnen remmen. Er zijn drie soorten inkapseling:macro-, micro- en nano-inkapseling. Macro-inkapseling maakt gebruik van een apparaat met eilandjes, dat vervolgens rond bloedvaten wordt geïmplanteerd om insuline af te geven via een semipermeabel membraan als reactie op de bloedglucosespiegels. Micro-inkapseling verpakt een klein aantal eilandjes in een poreuze capsule. Hoewel deze inkapselingen eilandjes kunnen beschermen tegen immuunafstoting, zijn in in vivo onderzoeken bijwerkingen zoals membraaninstorting of trombusvorming gemeld. De eilandjes verstoren ook de stroom van hormonen, voedingsstoffen of zuurstof als gevolg van een grotere diffusieafstand. Nano-inkapseling is de strategie van celoppervlakmodificatie die hechting induceert tussen cellen en exogene eiwitten, voornamelijk polyethyleenglycol (PEG), bij bloedtransfusie [4].

Nano-inkapseling met behulp van PEG is op grote schaal gebruikt als een modificatiemethode voor het verbeteren van de werkzaamheid en de fysisch-chemische eigenschappen van doeleiwitten of -peptiden [5]. In het bijzonder kan nano-inkapseling van eilandjes remmende effecten hebben als reactie op immuuncelaanval en antilichaamherkenning. PEG wordt veel gebruikt voor celcoating vanwege zijn biocompatibele eigenschappen, zoals niet-immunogeniteit, antigeenmaskering en niet-vervuilend effect [6]. Van de nanodeeltjes die worden gebruikt voor nano-inkapseling van NPCC's, zijn "polymersomen" (PSomes) op basis van PEG-blok-polylactide (PEG-b-PLA) het meest geschikt omdat ze stabiel en eenvoudig aan te passen zijn; ze kunnen ook zowel hydrofiele als hydrofobe reagentia in hun samenstelling opnemen [7, 8]. De oppervlaktemodificatie van eilandjes met behulp van polymeren (die PEG bevatten) wordt bereikt door covalente of niet-covalente binding tussen de extracellulaire matrix (ECM) van het eilandje en het functionele groep geconjugeerde polymeer [9].

In eerdere onderzoeken werd een uitgebalanceerde zoutoplossing van Hank (HBSS, pH 8,0) gebruikt als de reactiebuffer voor nano-inkapseling van het eilandje vanwege het vermogen om N-hydroxysuccinimide (NHS)-NH₂ te vergemakkelijken. bindend [10,11,12]. Om cellulaire schade aan NPCC's tijdens nano-inkapseling te minimaliseren, hebben we echter F-10-medium (NPCC-kweekmedium) met fysiologische pH (pH 7,3) gebruikt. Omdat het behoud van de hoeveelheid NPCC's na nano-inkapseling belangrijk is voor de transplantatie van de juiste hoeveelheid cellen, hebben we bovendien runderserumalbumine (BSA) toegevoegd, dat de bodem van de celkweekschaal bedekt met een polymeer met lange keten, om het herstel te vergroten tarief [13]. In onze vorige studie werd de nano-inkapseling van NPCC's met PSomes uitgevoerd via enkele functionele groepen, zoals NHS of NH₂ , die worden gebruikt om respectievelijk covalente binding of elektrostatische interactie met ECM van NPCC's te induceren. Omdat de bindingsaffiniteit echter in de loop van de tijd afneemt, zijn strategieën nodig om de bindingsefficiëntie te verhogen [14]. PSommige met bifunctionele groepen kunnen worden gebruikt als kandidaat om de coating-efficiëntie te verhogen vanwege hun vermogen om te aggregeren. Daarom hebben we een verknoping geïnduceerd tussen PSomes die bifunctionele groepen bevatten (NHS-/NH₂ -PSome) die niet alleen kan binden aan de ECM van NPCC's, maar ook aan elke PSome door covalente interactie of elektrostatische interactie, waardoor de efficiëntie van nano-inkapseling wordt verhoogd.

In deze studie hebben we de mogelijke toepassing van de nano-inkapseling op NPCC's onderzocht door middel van een geoptimaliseerde methode op het gebied van xenotransplantatie van varkenseilandjes.

Materialen en methoden

Dieren

Alle dierproeven werden goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van het Institute of MGENPLUS co. ltd. (#2019–1) en alle procedures zijn uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen die door de commissie zijn opgesteld. Chirurgie werd uitgevoerd onder algemene anesthesie en er werden inspanningen gedaan om ervoor te zorgen dat de dieren minimale pijn ervoeren. Varkens werden gedood voorafgaand aan pancreatectomie.

Isolatie van neonatale varkenseilandachtige celclusters (NPCC's)

NPCC's werden geïsoleerd uit 3 tot 5 dagen oude biggen. In het kort, biggen werden verdoofd met ketamine (10 mg/kg, Yuhan, Seoul, Korea) en xylazine-hydrochloride (1 mg/kg, Rompun; Bayer Korea, Seoul, Korea) injectie in de dijbeenspier en vervolgens gedood door het injecteren van kaliumchloride ( Sigma-Aldrich, MO, VS) in het hart. De alvleesklier werd blootgesteld via een abdominale incisie, geoogst en ondergedompeld in Hank's uitgebalanceerde zoutoplossing (HBSS, Biosesang, Gyeonggi-do, Korea) met 8,3 mM natriumbicarbonaat, 10 mM N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-( 2-ethaansulfonzuur) (HEPES) (Sigma-Aldrich, MO, VS) en 0, 5% antibioticum-antimycoticum (Biowest, MO, VS). De alvleesklier werd in stukken van 1-2 mm gesneden ³ fragmenten en verteerd in collagenase type V (1 mg / ml, Sigma-Aldrich, MO, VS) in HBSS gedurende 10 minuten. Koude HBSS met 10% foetaal runderserum (FBS) (Biowest, MO, VS) werd toegevoegd aan verteerd pancreasweefsel om de enzymactiviteit te stoppen. Verteerde pancreasweefsels werden gewassen in HBSS en na resuspensie werden de weefsels gefilterd door een pluriStrainer 500 m (pluriSelect, Leipzig, Duitsland) en gewassen in HBSS. Ten slotte werden NPCC's gezaaid en gekweekt in 5% CO₂ bij 37 °C in F-10-medium (Gibco, CA, VS) aangevuld met 0,25% runderserumalbumine (BSA) (genDepot, TX, VS), 10 mM nicotinamide, 10 mM D-glucose, 2 mM L-glutamine, 2 mM calciumchloridedihydraat, 50 μM isobutylmethylxanthine (IBMX), 20 μg/ml ciprofloxacine (Sigma-Aldrich, MO, VS) en 1% antibioticum-antimycoticum. NPCC's werden 5 dagen [15] gekweekt, waarbij elke dag 10 nM exendin-4 (Prospec, Ness-Ziona, Israël) aan de kweekmedia werd toegevoegd.

In vitro beoordeling van NPCC's en nano-ingekapselde NPCC's

Na kweek werd het aantal NPCC's geteld als eilandje-equivalent (IEQ) met behulp van oculair dradenkruis in oculair. De levensvatbaarheid werd beoordeeld met behulp van acridine-oranje (AO, 0.67 M, Sigma-Aldrich, MO, VS) en propidiumjodide (PI, 75 M, Sigma-Aldrich, MO, VS) kleuring. Om de glucose-gestimuleerde insulinesecretie (GSIS) -test uit te voeren, werden 20-30 NPCC's uitgekozen en voorgeïncubeerd met een lage D-glucose (2,8 mM) concentratie in Krebs-Ringer bicarbonaatbuffer (KRBB) gedurende 1 uur. NPCC's werden vervolgens gedurende 1 uur geïncubeerd met lage D-glucose (2,8 mM) in KRBB-buffer, gevolgd door een hoge D-glucose-oplossing (28,0 mM) in KRBB gedurende 1 uur. Supernatanten werden verzameld om de insulinesecretie te meten bij lage en hoge glucoseconcentraties [11]. De hoeveelheid insuline die door elk monster werd uitgescheiden, werd gemeten met behulp van een Human / Canine / Porcine Insulin Quantikine ELISA Kit (R &D-systemen, MN, VS). De stimulatie-index (SI) werd berekend door de insulinehoeveelheden bij hoge glucose (28,0 mM) te delen door die bij lage glucose (2,8 mM) concentraties.

Voorbereiding van polymersoom (PSome)

Om PSomes te bereiden, ofwel N-hydroxysuccinimide-poly (ethyleenglycol)-blok-poly (lactide) copolymeren (10 mg/ml, NHS-PEG-b-PLA) of amine-poly (ethyleenglycol)-blok-poly (lactide ) copolymeren (10 mg/ml, NH₂ -PEG-b-PLA; Nanosoft-polymeren, NC, VS) werden opgelost in 1 ml dimethylsulfoxide (DMSO, Sigma-Aldrich, MO, VS). Naast de bereiding van bifunctioneel PSome, kan elk copolymeer (NHS of NH₂ -PEG-b-PLA) opgelost in DMSO werd in verhoudingen gemengd. Gedestilleerd water (DH20) werd aan de polymeeroplossing toegevoegd om een ​​eindconcentratie van 1 mg/ml te verkrijgen. De polymeeroplossing werd gedurende 5 minuten in een ultrasoonapparaat (Sea han ultrasoon, Seoul, Korea) gesoniceerd. 1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindodicarbocyanine, 4-chloorbenzeensulfonaatzout (DiD; Biotium, CA, VS) werd tijdens sonicatie aan de polymeeroplossing toegevoegd om visualisatie mogelijk te maken. Ten slotte werd het mengsel 3 dagen gedialyseerd in DH2O.

Nano-inkapseling

De PSome werd verdund in nano-inkapselingsreactiebuffer (ofwel HBSS (pH 7,3 of pH 8,0) of gewoon F-10-medium zonder supplementen (pH 7,3 of pH 8,0), met of zonder 0,25% BSA). Nano-inkapseling werd uitgevoerd door de PSome toe te voegen aan NPCC's in kweekmedia. Om dit te doen, werden 10.000 IEQ's van NPCC's gezaaid in een celkweekschaal met 6 putjes (SPL, Gyeonggi-do, Korea), en verdunde PSome toegevoegd aan de NPCC's en geïncubeerd in 5% CO₂ bij 37 ° C gedurende 1 uur. Een negatieve controlegroep (NC) (niet-gecoate NPCC's zonder PSomes) werd onder dezelfde omstandigheden als de experimentele groep geïncubeerd. Na incubatie werden de nano-ingekapselde NPCC's geoogst en gekweekt in F-10-kweekmedia.

Efficiëntie van nano-ingekapselde NPCC's

De DiD-geconjugeerde PSome nano-ingekapselde NPCC's werden gevisualiseerd met behulp van fluorescentiemicroscopie (Leica, Wetzlar, Duitsland) of confocale laser scanning microscopie (CLSM; Carl Zeiss, Oberkochen, Duitsland). De intensiteit van DiD-geconjugeerde PSome-gebonden NPCC's werd gekwantificeerd door de gemiddelde fluorescentie-intensiteit (MFI) te berekenen met behulp van ImageJ-software (NIH, Bethesda, VS). Kernen in de cel werden tegengekleurd met 4′,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI).

Polymersome permeabiliteitstest

De NHS-PSome nano-ingekapselde NPCC's in F-10 of F-10 (0,25% BSA) werden gedurende 2 uur geïncubeerd met fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC)-geconjugeerd dextran met verschillende molecuulgewichten (10, 20, 70 en 250 kDa). . De penetratie van FITC-geconjugeerd dextran in NHS-PSome nano-ingekapselde NPCC's werd bevestigd voor elk molecuulgewicht via een confocale laser scanning microscoop.

Polymersome Cell Viability Assay

De NHS-PSome nano-ingekapselde THP-1 (menselijke monocytische cellijn) in RPMI 1640 (Biowest, MO, VS) werd gedurende 1 uur geïncubeerd. De levensvatbaarheid van NHS-PSome nano-ingekapseld THP-1 werd gemeten volgens het protocol gepresenteerd in de MTT-celproliferatietestkit (iNtRon Biotechnology, Seongnamsi, Korea).

Statistische analyse

Ongepaarde t-test werd uitgevoerd in GraphPad Prism 6.0. De statistische significantie werd uitgedrukt als *, ** *** en ****, wat de P . aangeeft waarde van  ≤ 0.05, ≤ 0.01, ≤ 0.001 en ≤ 0.0001.

Resultaten

Cultuur en functionele beoordeling van NPCC's

NPCC's werden gedurende 5 dagen gekweekt en kwaliteitscontroles, waaronder levensvatbaarheid en GSIS, werden uitgevoerd. Het totale aantal NPCC's was 21.014,0 IEQ/g/pancreas. De levensvatbaarheid, met behulp van AO/PI-kleuring, was 89,9%. GSIS, dat werd uitgevoerd om de respons van NPCC's op glucoseconcentratie te bevestigen, gaf een gemiddelde stimulatie-index (SI) van 2,3 (tabel 1, aanvullend bestand 1:Fig. S1).

PSome concentratie vereist voor efficiënte nano-inkapseling van NPCC's

Om de concentratie van PSome te bepalen die nodig is voor efficiënte nano-inkapseling, hebben we verschillende concentraties NHS-PSome aan de NPCC's toegevoegd. NHS-PSome was opgeslagen in een concentratie van 1 mg/ml in DH₂ O en verdund tot 1:5, 1:10, 1:20 en 1:40 om eindconcentraties te geven variërend van 0,2 tot 0,025 mg/ml. Nano-inkapselingsefficiëntie werd gemeten door MFI van DiD-geladen PSome nano-ingekapselde NPCC's. De eindconcentratie van 0,1 mg/ml (1:10 verdunning) vertoonde de hoogste fluorescentie-intensiteit op 2 dagen na nano-inkapseling (Fig. 1a en b) en daaropvolgende nano-inkapseling van NPCC's werd uitgevoerd bij deze concentratie.

Optimalisatie van PSome-concentratie voor effectieve nano-inkapseling op 0 en 2 dagen. Optimalisatie van PSome-concentratie voor effectieve nano-inkapseling. een DiD-geladen NHS-PSome werd behandeld in NPCC's bij verschillende concentraties (BF; helder veld). De schaalbalken vertegenwoordigen 200 m. b MFI van DiD-geladen PSome nano-ingekapselde NPCC's (n = 3) en NC-besturing (n = 1)

Verbeterde efficiëntie van nano-inkapseling in F-10-media met fysiologische pH

Nano-inkapseling van pancreaseilandjes (die NPCC's bevatten) wordt vaak uitgevoerd in basische HBSS-buffer (pH 8,0 of hoger) om de bindingsaffiniteit tussen NH2 in ECM van eilandjes en NHS geconjugeerd in polymeer te verbeteren. Nano-inkapseling in basis HBSS-buffer kan echter mogelijk NPCC's beschadigen. Dus om de schade van NPCC's te minimaliseren en het effect van pH op NHS-NH₂ te bepalen binding, werden NPCC's nano-ingekapseld via NHS-PSome in HBSS-buffers of gewone F-10-kweekmedia (gebruikt in deze studie om NPCC's te kweken) met respectievelijk pH 7,3 (fysiologisch) of pH 8,0 (basisch). Toen NPCC's nano-ingekapseld waren in F-10, werd de normale morfologie van NPCC's behouden (Fig. 2a), en de efficiëntie van nano-inkapseling op basis van MFI was significant verhoogd in vergelijking met die in de HBSS-groep, ongeacht de pH op dag 0 en 6 (Fig. 2b). Hoewel HBSS-groepen op dag 6 een significant verschil vertoonden tussen pH 7,3 en 8,0, was de intensiteit van nano-inkapseling significant afgenomen in vergelijking met die in de F-10-groep. Daarom gebruikten we fysiologisch F-10-kweekmedium (pH 7,3) als de nano-inkapselingsreactiebuffer in daaropvolgende experimenten om de potentiële schade van NPCC's te minimaliseren.

Vergelijkingen van coatingefficiëntie van nano-inkapseling in verschillende reactiebuffers op 1 en 6 dagen. Vergelijkingen van coatingefficiëntie van nano-inkapseling in verschillende reactiebuffers. een Nano-ingekapselde NPCC's in HBSS (pH 7,3 en pH 8,0) of F-10 (pH 7,3 en pH 8,0) met behulp van DiD-geconjugeerde NHS-PSome (BF; helder veld). De schaalbalken stellen 200 um voor; b MFI van nano-ingekapselde NPCC's in HBSS (pH 7,3 en pH 8,0) of F-10 (pH 7,3 en pH 8,0) met behulp van DiD-geconjugeerde NHS-PSome (alle groepen; n = 3). Gegevens vertegenwoordigen de gemiddelde  ± S.D. *p < 0.05, ***p < 0.001 en ****p < 0.0001 versus andere groepen

Verhoogde herstelsnelheid van NPCC's na nano-inkapseling

Hoewel de cellulaire schade van NPCC's in F-10 tot een minimum werd beperkt, was de hoeveelheid NPCC's die na nano-inkapseling werd verzameld aanzienlijk verminderd. Om dit probleem op te lossen, hebben we 0,25% BSA aan F-10-medium toegevoegd tijdens cultuur en nano-inkapseling van NPCC's met behulp van NHS-PSome. We hebben in eerste instantie bevestigd of het toevoegen van 0,25% BSA aan F-10-medium de coating-efficiëntie en de selectieve permeabiliteit beïnvloedt, waardoor de doorgang van kleine moleculen (10 en 20 kDa FITC-geconjugeerd dextran) terwijl grotere moleculen (70 en 250 kDa FITC-geconjugeerde dextran), als een essentiële functie van PSome. Als resultaat werd de conforme coating getoond in afbeeldingen van CLSM (Fig. 3a, Mid) en werd de selectieve permeabiliteit normaal gehandhaafd (Fig. 3b, FITC-geconjugeerd dextran) in NHS-PSome nano-ingekapselde NPCC's met F-10 die 0,25 bevat. % BSA vergeleken met F-10, hoewel MFI enigszins was verlaagd (Fig. 3b). De hoeveelheden NPCC's verzameld na nano-inkapseling vertoonden een significant hoger herstelpercentage (71,9%) in F-10 met 0, 25% BSA dan in F-10 zonder BSA (42,3%) (figuur 3c). Levensvatbaarheid (NC:89,5%, NHS-PSome:90,3%) en glucose-gestimuleerde insulinesecretie (NC:2,1, NHS-PSome:1,6) van NPCC's in F-10 met 0,25% BSA werden ook gehandhaafd na nano-inkapseling (Fig. 4a, b, Extra bestand 1:Afb. S2). Onze resultaten geven aan dat de toevoeging van 0,25% BSA het herstelpercentage van NPCC's na nano-inkapseling aanzienlijk kan verbeteren en de coating-efficiëntie of functie van PSome niet beïnvloedde.

Vergelijkingen van coatingefficiëntie na toevoeging van 0,25% BSA in reactiebuffers voor nano-inkapseling om de terugwinningssnelheid te verhogen. Vergelijkingen van coatingefficiëntie na toevoeging van 0,25% BSA in reactiebuffers voor nano-inkapseling om de terugwinningssnelheid te verhogen. een Coatingefficiëntie en selectieve permeabiliteit van nano-ingekapselde NPCC's met NHS-PSome in F-10 of F-10 met 0,25% BSA (BF; helderveld, midden; middelste afbeelding met CLSM van DiD-geconjugeerde NHS-PSome nano-ingekapselde NPCC's, FITC-geconjugeerd dextran; middelste afbeelding met behulp van CLSM van FITC-geconjugeerde dextran in NHS-PSome nano-ingekapselde NPCC's). Blauw in Mid vertegenwoordigen de cel door middel van DAPI-kleuring. Schaalbalken zijn 200 (BF en DiD) en 100 (Mid- en FITC-geconjugeerd dextran) m; b MFI van nano-ingekapselde NPCC's met behulp van DiD-geconjugeerde NHS-PSome; c Herstelpercentage van NPCC's na nano-inkapseling in F-10 (n = 12) of F-10 met 0,25% BSA (n = 12). Gegevens vertegenwoordigen de gemiddelde  ± S.D. *p < 0.05 versus F-10

Levensvatbaarheid en functionaliteit van NHS-PSome nano-ingekapselde NPCC's met F-10 met 0,25% BSA. Levensvatbaarheid en functionaliteit van NHS-PSome nano-ingekapselde NPCC's met F-10 met 0,25% BSA. een Levensvatbaarheid van NHS-PSommige nano-ingekapselde NPCC's (n = 6) en NC-besturing (n = 6); b SI van NHS-PSommige nano-ingekapselde NPCC's (n = 5) en NC-besturing (n = 5). Gegevens vertegenwoordigen de gemiddelde  ± SD

Verbeterde stabiliteit van nano-inkapseling door verknoping van PSomes

Om een ​​stabielere nano-inkapseling van NPCC's te induceren, hebben we geprobeerd PSomes te conjugeren met twee verschillende functionele groepen. Eerst hebben we nano-inkapseling van de NPCC's uitgevoerd door gelijktijdig verschillende hoeveelheden PSome's toe te voegen die NHS en NH₂ bevatten. bifunctionele groepen (NHS-/ NH₂ -PSome) in één PSome (Schema 1). De efficiëntie van nano-inkapseling werd bevestigd door de MFI van DiD geconjugeerd in PSome nano-ingekapselde NPCC's. Resulterende beelden van fluorescentiemicroscopie toonden geen significante verschillen tussen 9:1, 5:5 en 1:9 groepen NHS-/NH2-PSome nano-ingekapselde NPCC's (9:1, 5:5, 1:9) op dag 0 en dag (Fig. 5a). In de CLSM-resultaten leek de 5:5-groep echter overgecoat te zijn en 1:9 vertoonde onvoldoende coating, terwijl de 9:1-groep op dag 1 een conforme coating vormde (figuur 5b). Daarom hebben we bepaald dat de optimale verhouding van NHS-/NH2 in PSome 9:1 is. Toen functionele testen werden uitgevoerd voor de 9:1-groep, toonden onze resultaten aan dat de levensvatbaarheid van de 9:1-groep significant was afgenomen in vergelijking met die van de NC-controle (92,1%), maar dat de levensvatbaarheid op normale niveaus werd gehouden (87,8 %). De SI-functie van de 9:1-groep was normaal (3.0) in vergelijking met die van de NC-controle (3.7) (Fig. 5c,d).

De illustratie van verbeterde stabiliteit van nano-inkapseling door verknoping van PSomes

Coating efficiëntie en functionaliteit van NHS-/NH₂ - Sommige nano-ingekapselde NPCC's. Coating efficiëntie en functionaliteit van NHS-/NH₂ - Sommige nano-ingekapselde NPCC's. een DiD vervoegde 9:1, 5:5, 1:9 van NHS-/NH₂ - PSommige nano-ingekapselde NPCC's (9:1, 5:5, 1:9) (NC; niet-gecoate NPCC's). MFI toont de intensiteit van DiD-geconjugeerde PSome nano-ingekapselde NPCC's (n = 3) en NC-besturing (n = 3). De schaalbalken stellen 200 um voor; b CLSM van DiD-geconjugeerd NHS-/NH₂ - PSommige nano-ingekapselde NPCC's (midden; middelste afbeelding met CLSM van DiD-geconjugeerde NHS-/NH₂ - PSommige nano-ingekapselde NPCC's). Blauw in Mid vertegenwoordigen de cel door middel van DAPI-kleuring. De schaalbalken vertegenwoordigen 100 um; C. Levensvatbaarheid van 9:1 (n = 9) en NC-besturing (n = 3). Gegevens vertegenwoordigen de gemiddelde  ± S.D. **p < 0,01 versus NC; D. SI van 9:1 (n = 9) en NC-besturing (n = 3). Gegevens vertegenwoordigen de gemiddelde  ± SD

Discussie

Diabetes mellitus, algemeen bekend als diabetes, is een stofwisselingsziekte die wordt gekenmerkt door hoge bloedsuikerspiegels. Type 1 diabetes is het gevolg van het falen van de bètacellen in de pancreas om voldoende insuline te produceren [16]. Transplantatie van pancreaseilandjes die insulineproducerende β-cellen bevatten, is onlangs gebruikt om diabetes type 1 te genezen. De transplantatie van allo-eilandjes is echter beperkt vanwege een tekort aan donoren; in plaats daarvan is xenotransplantatie met behulp van eilandjes van niet-menselijke dieren naar voren gekomen als een alternatieve bron van donorweefsel. Vanwege hun fysiologische overeenkomsten met mensen, het gemak van massale fokken en de beschikbaarheid van fokken in pathogeenvrije faciliteiten, worden varkens beschouwd als een optimaal diermodel voor transplantatie van xeno-eilandjes [1]. Vooral de NPCC's zijn even goed gebruikt als de API's. Hoewel de volwassenheid van NPCC's lager is dan die van API's, hebben NPCC's enkele voordelen ten opzichte van API's, waaronder een relatief eenvoudige en goedkope isolatieprocedure voor eilandjes, het vermogen om resistentie te ontwikkelen tegen hypoxische omgevingen en proliferatie in vivo na transplantatie [1,2,3] . Om deze redenen gebruikten we 3-5 dagen oude neonatale varkens als de eilandjesbron in dit onderzoek.

Helaas, als eenmaal varkenseilandjes zijn geïmplanteerd in bloedvaten van menselijke of niet-menselijke primaten, treden vaak ernstige immuunreacties op, zoals IBMIR of hyperacute afstoting. IBMIR treedt meestal op als gevolg van verschillende weefselfactoren (TF) die tot expressie worden gebracht in varkenseilandjes die coagulatie in menselijke bloedvaten bemiddelen via activering van een extrinsieke route. Alfa-galactose- of niet-gal-antigenen die tot expressie worden gebracht op het oppervlak van varkenscellen kunnen ook doelwitten zijn van natuurlijke menselijke antilichamen, gevolgd door een complementaire cascade-activering die hyperacute afstoting wordt genoemd. Dientengevolge gaan transplantaten verloren na hypoxie door stolselvorming vanuit de stollingsroute en celdood door complementactivering in de gastheer [3]. Om deze problemen op te lossen, is inkapseling geprobeerd, een methode om pancreaseilandjes te bekleden met biocompatibele materialen om ze te beschermen tegen aanvallen door antilichaam- of complementreacties. Ten eerste maakt macro-inkapseling gebruik van een apparaat met een semipermeabel membraan dat het eilandje bevat en wordt geïmplanteerd naast bloedvaten waar het insuline in de bloedbaan afgeeft als reactie op de bloedglucosespiegels [4]. Ten tweede heeft micro-inkapseling, voornamelijk met behulp van alginaat, selectieve permeabiliteit en kan zuurstof en voedingsstoffen door het poreuze oppervlak gaan, terwijl meerdere cytokinen en infiltratie van immuuncellen worden geblokkeerd. Omdat ze echter capsules van dezelfde grootte gebruiken, ongeacht de grootte van de eilandjes, is het moeilijk om de eilandjes conform te coaten. Bovendien kan fibrose optreden, waardoor het transplantaat na transplantatie wordt omsloten [17]. Ten slotte wordt bij oppervlaktemodificatie van eilandjes (nano-inkapseling) voornamelijk gebruik gemaakt van polyethyleenglycol (PEG) met een "stealth-effect" -eigenschap dat de interactie blokkeert van materialen die zijn gecoat met "stealth" -polymeer (PEG) en componenten in het bloed (immuuncellen) in levend [11, 18]. Onze nano-inkapselingsstrategie van NPCC's maakt gebruik van de gemodificeerde PEG-copolymeren (PEG-b-PLA, Polymersome, PSome). Psome heeft ook zowel hydrofiele als hydrofobe eigenschappen en kan immunosuppressiva of factoren die betrokken zijn bij celdifferentiatie of groei [8] bevatten.

Nano-inkapseling van eilandjes met behulp van PEG is uitgevoerd in basische HBSS-buffer (pH 8,0 of hoger) om de bindingsaffiniteit tussen NHS op PEG en NH₂ te verbeteren op ECM van eilandje [10,11,12]. Omdat deze omstandigheden echter geen geschikte celcultuuromgeving kunnen bieden, hebben we geprobeerd nano-inkapseling in een omgeving die de NPCC-kweekconditie nabootst. Om de bovenstaande problemen aan te pakken, hebben we gewone F-10-media, NPCC-kweekbasismedium, getest met fysiologische pH (zonder supplementen) die als de reactiebuffer voor nano-inkapseling werden gebruikt. Nano-inkapseling in F-10 met fysiologische pH vertoonde een vergelijkbare coatingefficiëntie en handhaafde de normale morfologie van NPCC's in vergelijking met de kweekconditie met behulp van basische HBSS-buffer (figuur 3). Daarom kunnen we een platform voorstellen dat NPCC-schade minimaliseert tijdens de nano-inkapseling in een omgeving die NPCC-cultuur nabootst.

Hoewel de nano-inkapselingsmethode voor het minimaliseren van NPCC-schade werd vastgesteld, nam de resterende hoeveelheid NPCC's die na nano-inkapseling werden verzameld af wanneer de nano-inkapseling werd uitgevoerd in petrischalen. Dit betekent dat je meer NPCC's nodig hebt voor nano-inkapseling voor transplantatie. Volgens eerdere rapporten werden de opbrengsten van eilandjes verbeterd in sommige muizenstammen door BSA te gebruiken tijdens isolatie [19]. Ook werd BSA gebruikt als suspensiekweek door het oppervlak van celkweekschalen vooraf te coaten in hepatoomcelkweken van ratten [13]. Om de hoeveelheid NPCC's na nano-inkapseling te verhogen, werd daarom 0,25% BSA toegevoegd in F-10 nano-inkapselingsreactiebuffer, hetzelfde als de concentratie BSA die werd gebruikt voor het kweken van NPCC's. Als gevolg hiervan nam de NPCC-herstelsnelheid aanzienlijk toe na nano-inkapseling (figuur 4). Dit betekent dat het juiste aantal eilandjes (met NPCC's) na de nano-inkapseling kan worden voorspeld en getransplanteerd door het verlies van eilandjes (met NPCC's) te minimaliseren. Samenvattend toonde deze studie met F-10 met 0,25% BSA voor nano-inkapseling aan dat (i) de normale morfologie van NPCC's werd behouden, (ii) de binding tussen NHS-geconjugeerd PSome en NH2 in ECM van NPCC's niet werd verstoord en (iii) het herstelpercentage van NPCC's na nano-inkapseling nam toe.

Ten slotte hebben we geprobeerd de stabiliteit van nano-inkapseling te verbeteren door (i) conjugatie tussen PSomes en (ii) binding tussen de PSomes en ECM van NPCC's. Eerst werden NHS- en NH2-PEG-b-PLA-polymeren proportioneel gemengd om de bifunctionele PSome (NHS-/NH2-PSome) te vormen die kan binden aan zowel PSome als ECM van NPCC's. We postuleerden dat conjugatie efficiënt zou kunnen worden bereikt door bifunctionele groepen binnen één PSome in plaats van twee PSomes te conjugeren met monofunctionele groepen vanwege de mogelijke onderbreking veroorzaakt door binding tussen PSomes met dezelfde functionele groep (NHS-NHS en NH2-NH2). Zoals te zien is aan de resultaten, werd de conforme coating van NPCC's bereikt in een verhouding van 9:1 van NHS-/NH2-PSommige nano-ingekapselde NPCC's, en de levensvatbaarheid en functionaliteit werden behouden (Fig. 5). Er zijn echter verdere studies nodig om de sterkte van de PSome-binding te kwantificeren, om te bewijzen dat nano-inkapseling met bifunctionele PSomes resulteerde in een stabielere inkapseling dan die met de monofunctionele PSome. Daarom stellen we voor dat onze effectieve nano-inkapselingsomstandigheden die de NPCC-cultuuromgeving nabootsen, kunnen worden gebruikt in de nano-inkapselingsstrategie met behulp van eilandjes die NPCC's bevatten (aanvullend bestand 1).

Conclusie

Deze studie werd uitgevoerd om een ​​optimale methode voor nano-inkapseling van pancreaseilandjes (NPCC's) te bepalen met behulp van op PEG gebaseerde polymersomen (PSomes). Ten eerste kan het gebruik van F-10-kweekmedium met een pH van 7,3 de normale morfologie van NPCC's na nano-inkapseling behouden in vergelijking met het gebruik van basische HBSS-buffer (pH 8,0), waardoor schade aan NPCC's tijdens inkapseling wordt geminimaliseerd. Ten tweede verbeterde het toevoegen van 0,25% BSA aan F-10-medium de opbrengst van NPCC's met ongeveer 1,7 keer na nano-inkapseling. Ten slotte hebben we een stabielere nano-inkapseling geïnduceerd door de conjugatie van bifunctionele PSomes (NHS-/NH2-PSomes). De methoden voor nano-inkapseling die in dit artikel worden gepresenteerd, kunnen van toepassing zijn op nano-inkapseling van pancreaseilandjes met behulp van op PEG gebaseerde nanodeeltjes.

Beschikbaarheid van gegevens en materialen

Niet van toepassing.

Afkortingen

DiD:

1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindodicarbocyanine, 4-chlorobenzenesulfonate salt

AO:

Acridine orange

APIs:

Adult porcine islets

BSA:

Bovine serum albumine

BF:

Helder veld

CLSM:

Confocal laser scanning microscopy

DAPI:

4′,6-Diamidino-2- phenylindole

DMSO:

Dimethylsulfoxide

DH2O:

Distilled water

ELISA:

Enzym-linked immunosorbent assay

FBS:

Foetaal runderserum

FITC:

Fluoresceïne isothiocyanaat

GSIS:

Glucose-stimulated insulin secretion

HBSS:

Hank’s balanced salt solution

IBMIR:

Instant blood-mediated inflammatory reaction

IEQ:

Islet equivalent

IBMX:

Isobutylmethylxanthine

KRBB:

Krebs–Ringer bicarbonate buffer

MFI:

Mean fluorescence intensity

HEPES:

N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid)

NC:

Negative control

NPCCs:

Neonatal porcine islet like cell clusters

NHS:

N-hydroxysuccinimide

NHP:

Non-human primate

PLA:

Poly lactide

PEG:

Polyethyleenglycol

PSomes:

Polymersomes

PI:

Propidium iodide

SI:

Stimulation index

TF:

Tissue factor