Efficiënte nano-encapsulatie van neonatale varkens islet-achtige celclusters met PEG-blok-PLA polymersomen

Samenvatting

Dit onderzoek presenteert een efficiënte methode voor de nano-encapsulatie van neonatale varkens islet-achtige celclusters (NPCCs) met behulp van polymersomen (PSomen) gevormd uit polyetheen glycol-blok-polylactide (PEG-blok-PLA). De procedure minimaliseert schade en verlies van NPCCs. N-hydroxysuccinimide (NHS) aan de N-terminaal van PSomen induceert binding aan aminegroepen in de extracellulaire matrix (ECM) rondom NPCCs. F-10 kweekmedium met bovine serumalbumine (BSA) wordt gebruikt om schade en verlies te minimaliseren. Tenslotte wordt kruislinking geïnduceerd tussen bifunctionele PSomen (NHS-/NH₂-PSomen). F-10 medium met 0,25% BSA bij pH 7,3 minimaliseert schade en verlies significant beter dan basisch HBSS-buffer (pH 8,0). De conjugatie van bifunctionele PSomen verhoogt de encapsulatie-efficiëntie.

Inleiding

Allogene eilandtransplantatie bij diabetes type 1 wordt beperkt door tekort aan geschikte donoren. Xenogene eilandtransplantatie met varkenseilanden neemt toe, waarbij varkens de optimale donorsoort zijn. Neonatale varkens islet-achtige celclusters (NPCCs) worden bevorzugd boven volwassen varkenseilanden (APIs) vanwege lagere kosten, gemakkelijkere isolatie en de capaciteit om na transplantatie te prolifereren, wat de functionele levensduur verlengt. Echter, transplantatie in humane of niet-humane primaten portal vene kan immuunreacties uitlokken zoals instant blood-mediated inflammatory reaction (IBMIR) of hyperacute afstoting, wat leidt tot vroege graftverlies. Encapsulatie die immuunreacties inhibit is daarom essentieel.

Er zijn drie encapsulatietypes: macro-, micro- en nano-encapsulatie. Macro-encapsulatie gebruikt een device met een semipermeabele membraan; micro-encapsulatie verpakt eilanden in porieuze capsules. Beide kunnen bijwerkingen zoals membranecollaps of trombusvorming vertonen en verstoren de diffusie van hormonen, nutriënten en zuurstof. Nano-encapsulatie wijzigt het celoppervlak door binding aan exogene proteïnen, voornamelijk polyetheenglycol (PEG), wat de "stealth effect" geeft: interactie met immuuncellen en bloedcomponenten wordt geblokkeerd.

PEG-gebaseerde nano-encapsulatie verbetert efficiteit en fysicochemische eigenschappen. Voor NPCCs zijn polymersomen (PSomen) gebaseerd op PEG-blok-PLA het meest geschikt door hun stabiliteit, eenvoudige modificatie en capaciteit om zowel hydrofiele als hydrofobe stoffen te incorporeren. Oppervlaktemodificatie van eilanden met PEG-bevattende polymeren gebeurt via covalente of niet-covalente binding tussen de ECM van het eiland en functionele groepen op het polymer.

Eerdere studies gebruikten basisch HBSS (pH 8,0) als reactiebuffer voor NHS-NH₂ binding. Om celbeschadiging te minimaliseren, werd in deze studie F-10 medium (fysiologische pH 7,3) gebruikt. Daarnaast is behoud van NPCC-hoeveelheid cruciaal voor transplantatie; bovineserumalbumine (BSA) verhoogt de recoverysnelheid door de bodem van de kweekschaal te bedekken. Eerdere nano-encapsulatie gebruikte monofunctionele groepen (NHS of NH₂), maar bindingaffiniteit neemt af over tijd. Bifunctionele PSomen (NHS-/NH₂-PSomen) kunnen zich aggregeren en binden zowel aan de ECM als aan elkaar, wat de encapsulatie-efficiëntie verhoogt.

Deze studie onderzoekt de toepasbaarheid van geoptimaliseerde nano-encapsulatie op NPCCs voor varkenseiland xenotransplantatie.

Materialen en Methoden

Dieren

Alle dierproeven zijn goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van MGENPLUS co. ltd. (#2019–1). Chirurgie onder algemene narcose; dieren ervoeren minimale pijn. Varkens werden gedood vóór pankreatectomie.

Isolatie van neonatale varkens islet-achtige celclusters (NPCCs)

NPCCs geïsoleerd van 3- tot 5-dagen oude biggen. Na anesthesie (ketamine/xylazine) en euthanasie (KCl), wordt de pancreas gehaald, gehakt (1–2 mm³) en verteerd met collagenaas type V in HBSS. Enzymactiviteit gestopt met koud HBSS + 10% FBS. Na wassen en filtratie (500 μm) worden NPCCs gekweekt in F-10 medium aangevuld met 0,25% BSA, nicotinamide, glucose, L-glutamine, CaCl₂, IBMX, ciprofloxacine en antibioticum-antimycoticum, 5 dagen bij 37 °C, 5% CO₂. Dagelijks 10 nM exendine-4 toegevoegd.

In vitro beoordeling van NPCCs en nano-geencapsuleerde NPCCs

Aantal NPCCs geteld als islet equivalent (IEQ). Vitaliteit via acridine orange (AO) / propidium iodide (PI) kleuring. Glucose-gestimuleerde insulinesecretie (GSIS) assay: 20–30 NPCCs geïncubeerd in lage glucose (2,8 mM) KRBB, daarna hoge glucose (28,0 mM). Insuline gemeten met ELISA. Stimulatie-index (SI) = insuline bij hoge glucose / insuline bij lage glucose.

Bereiding van polymersomen (PSomen)

NHS-PEG-blok-PLA of NH₂-PEG-blok-PLA (10 mg/ml) opgelost in DMSO. Voor bifunctionele PSomen: beide copolymers in verhouding gemengd. Destilleerd water toegevoegd tot 1 mg/ml. Gesonicat 5 min met DiD-kleurstof voor visualisatie. 3 dagen gedialyseerd in destilleerd water.

Nano-encapsulatie

PSomen gedilueerd in reactiebuffer: HBSS (pH 7,3 of 8,0) of plain F-10 (pH 7,3 of 8,0), met of zonder 0,25% BSA. 10.000 IEQ NPCCs in 6-well plaat, PSomen toegevoegd, 1 uur geïncubeerd (37 °C, 5% CO₂). Negatieve controle (NC): niet-gecoate NPCCs. Na incubatie geoogst en gekweekt in F-10 medium.

Efficiëntie van nano-encapsulatie

DiD-gekoppelde PSomen gevisualiseerd met fluorescentiemicroscopie of confocal laser scanning microscopie (CLSM). Mean fluorescence intensity (MFI) gekwantificeerd met ImageJ. Kernen gecounterstained met DAPI.

Polymersom permeabiliteitsassay

NHS-PSome nano-geencapsuleerde NPCCs in F-10 of F-10 (0,25% BSA) geïncubeerd met FITC-dextran (10, 20, 70, 250 kDa) gedurende 2 uur. Penetratie bevestigd via CLSM.

Polymersom celvitaliteitsassay

NHS-PSome nano-geencapsuleerde THP-1 cellen in RPMI 1640, 1 uur geïncubeerd. Vitaliteit gemeten met MTT-assay.

Statistische analyse

Unpaired t-test in GraphPad Prism 6.0. Significantie: * P ≤ 0,05, ** P ≤ 0,01, *** P ≤ 0,001, **** P ≤ 0,0001.

Resultaten

Kweek en functionele beoordeling van NPCCs

NPCCs 5 dagen gekweekt. Totaal aantal: 21.014 IEQ/g/pancreas. Vitaliteit (AO/PI): 89,9%. GSIS: gemiddelde SI = 2,3.

PSom-concentratie voor efficiënte nano-encapsulatie

Verschillende NHS-PSome concentraties getest (0,2–0,025 mg/ml). 0,1 mg/ml (1:10 verdunning) gaf hoogste MFI op dag 2. Vervolgexperimenten met deze concentratie.

Verbeterde efficiëntie in F-10 medium met fysiologische pH

Nano-encapsulatie in F-10 (pH 7,3) behield normale morfologie en vertoonde significant hogere MFI dan HBSS-groepen (pH 7,3 en 8,0) op dag 0 en 6. HBSS toonde wel verschil tussen pH 7,3 en 8,0 op dag 6, maar intensiteit bleef significant lager dan F-10. F-10 (pH 7,3) gekozen als optimale buffer.

Verhoogde recoverysnelheid na nano-encapsulatie

Hoewel F-10 schade minimaliseerde, was hoeveelheid geoogste NPCCs laag. Toevoeging van 0,25% BSA aan F-10 tijdens kweek en encapsulatie verhoogde recoverysnelheid van 42,3% (Zonder BSA) naar 71,9% (Met BSA). Conformatie coating en selectieve permeabiliteit (doorlaatbaarheid 10/20 kDa FITC-dextran, blokkade 70/250 kDa) bleven intact. MFI licht verminderd. Vitaliteit (NC: 89,5%, NHS-PSome: 90,3%) en GSIS (NC: 2,1, NHS-PSome: 1,6) bleven behouden. 0,25% BSA verhoogt recoverysnelheid significant zonder coating of functie te beïnvloeden.

Verbeterde stabiliteit van nano-encapsulatie door kruislinking van PSomen

Om stabilere encapsulatie te verkrijgen, werden PSomen met twee functionele groepen geconjugeerd. Verschillende verhoudingen NHS-/NH₂-PSomen (9:1, 5:5, 1:9) getest. Fluorescentiemicroscopie: geen significante verschillen op dag 0 en 1. CLSM: 9:1 vormde conformatie coating, 5:5 over-gecoat, 1:9 onvoldoende coating. Optimale verhouding = 9:1. Vitaliteit 9:1 groep: 87,8% (NC: 92,1%, significant lager maar normaal). SI: 3,0 (NC: 3,7, normaal).

Discussie

Diabetes mellitus kenmerkt zich door hoge bloedglucose. Type 1 diabetes: bètacellen produceren onvoldoende insuline. Eilandtransplantatie kan genezen, maar allogene transplantatie gelimiteerd door donortekort. Xenotransplantatie met varkenseilanden is alternatief. Varkens zijn ideaal door fysiologische overeenkomsten, massaalkweek en pathogenvrije faciliteiten. NPCCs hebben voordelen ten opzichte van APIs: eenvoudigere/goodkopere isolatie, resistentie tegen hypoxie, proliferatie in vivo.

Implantatie in humane/NHP bloedvaten veroorzaakt IBMIR (weefselfactoren activeren stolling) en hyperacute afstoting (alpha-gal/non-gal antigenen → complementactivering). Encapsulatie met biocompatibele materialen beschermt tegen antistoffen/complement. Macro-encapsulatie: device met semipermeabele membraan. Micro-encapsulatie (alginate): selectieve permeabiliteit, maar moeilijk conformale coating, fibrose risico. Nano-encapsulatie: PEG "stealth effect" blokkeert interactie met immuuncellen. Onze strategie gebruikt gemodificeerde PEG-copolymere (PEG-b-PLA, PSomen). PSomen zijn amphifiel en kunnen immunsuppressiva of groeifactoren incorporeren.

Traditionele nano-encapsulatie in basisch HBSS (pH ≥ 8,0) bevordert NHS-NH₂ binding, maar is niet fysiologisch. We testten plain F-10 (pH 7,3) als buffer. Resultaten: vergelijkbare coatingefficiëntie, normale morfologie behouden. Dit biedt een platform dat NPCC-schade minimaliseert in een cultuur-nabijende omgeving.

Ondanks schademinimalisatie, daalde NPCC-hoeveelheid na encapsulatie in petrischalen. BSA verbeterde in eerdere studies isolatie-opbrengst (muizen) en suspensiekweek (rat hepatoma cellen). 0,25% BSA (dezelfde concentratie als kweekmedium) toegevoegd aan F-10 buffer. Resultaat: significant hogere recoverysnelheid. Dit stelt correcte transplantatiedosis voorspelbaar. Samengevat: F-10 met 0,25% BSA behoudt morfologie, belemmert NHS-NH₂ binding niet, verhoogt recoverysnelheid.

Tenslotte stabiliteit verbeterd door: (1) conjugatie tussen PSomen, (2) binding PSomen-ECM. NHS- en NH₂-PEG-b-PLA gemengd tot bifunctionele PSomen (NHS-/NH₂-PSomen) die binden aan zowel PSomen als ECM. Hypothese: bifunctionele groepen in één PSoom efficiënter dan conjugatie van twee monofunctionele PSomen (verstoring door homogene binding). Resultaat: conformatie coating bij 9:1 verhouding, vitaliteit en functionaliteit behouden. Vervolgonderzoek nodig om bindingssterkte te kwantificeren en te bewijzen dat bifunctionele PSomen stabilere encapsulatie geven dan monofunctionele. Onze effectieve nano-encapsulatiecondities, die de NPCC-kweekomgeving nabootsen, zijn toepasbaar in xenotransplantatiestrategieën.

Conclusie

Deze studie bepaalt een optimale nano-encapsulatiemethode voor pancreaseilanden (NPCCs) met PEG-gebaseerde polymersomen (PSomen). Erstens: F-10 kweekmedium (pH 7,3) behoudt normale morfologie en minimaliseert schade ten opzichte van basisch HBSS (pH 8,0). Tweedens: 0,25% BSA in F-10 verbetert NPCC-opbrengst ~1,7 keer na encapsulatie. Derdens: stabielere encapsulatie via conjugatie van bifunctionele PSomen (NHS-/NH₂-PSomen). De gepresenteerde methoden zijn toepasbaar op nano-encapsulatie van pancreaseilanden met PEG-gebaseerde nanopartikelen.