Oplosmiddelvrije, foliumzuur-gefunctionaliseerde nanonaldjes voor gerichte afgifte van 10‑hydroxycamptothecine

Samenvatting

Traditionele nanopartikelformuleringen van hydrofobe antikankermiddelen zijn vaak afhankelijk van organische oplosmiddelen, wat zorgen oproept over residuele toxiciteit. Hier presenteren we een volledig groene synthese van foliumzuur-gemodificeerde 10‑hydroxycamptothecine (HCPT) nanonaldjes (HFNDs) die organische oplosmiddelen elimineert, terwijl een hoge middellading (70,2 %) en een robuuste targeteringscapaciteit worden bereikt. In vitro tonen HFNDs een superieure cellulaire opname in HeLa-cellen vergeleken met niet-getargete chitosaan-HCPT nanonaldjes, en MTT-tests onthullen een verhoogde cytotoxiciteit bij equivalente HCPT-doses. In vivo imaging bevestigt preferentiële tumoraccumulatie van HFNDs, en therapeutische studies in HeLa-xenografts tonen duidelijke tumorderving met minimale systemische toxiciteit. Deze oplosmiddelvrije benadering biedt een veelbelovend platform voor veilige, efficiënte chemotherapeutische afgifte en imaging.

Achtergrond

In de afgelopen twee decennia heeft onderzoek zich gericht op het overwinnen van de farmacokinetische beperkingen van conventionele chemotherapie door nanopartikel-gebaseerde afgiftesystemen die verlengde circulatie, actieve targetering en multimodale imaging mogelijk maken [1, 2]. Recente vooruitgang heeft het belang van de deeltjesvorm benadrukt, waarbij nanostructuren met een hoge lengte-breedteverhouding verbeterde cellulaire internalisatie en tumorpenetratie tonen [10, 26]. Toch zijn de meeste van deze strategieën nog steeds afhankelijk van organische oplosmiddelen om hydrofobe geneesmiddelen op te lossen, wat leidt tot zorgen over residuele oplosmiddelen die zich in het lichaam kunnen accumuleren en veiligheidsrisico's vormen [27]. Onze studie vult deze kloof in door HCPT-geladen, foliumzuur-gemodificeerde nanonaldjes te ontwikkelen via een volledig groene, oplosmiddelvrije methode, waardoor hoge middellading, gerichte afgifte en imagingpotentie gecombineerd worden.

Methoden

Materialen

Alle reagentia waren van analytische graad en werden zoals ontvangen gebruikt. Gedeioniseerd water werd doorheen gebruikt. Foliumzuur (FA) werd verkregen van Bio Basic Inc.; HCPT (> 99 % zuiverheid) van Lishizhen Pharmaceutical Co.; chitosaan (Mw = 70 kDa, 90 % deacetylering) van Zhejiang Aoxing; NHS en EDC van Sigma‑Aldrich.

Synthese van het FA‑chitosaanconjugaat

FA (10 mg), chitosaan (20 mg), EDC (4 mg) en NHS (4 mg) werden 12 uur bij kamertemperatuur gerold in 2 mL PBS (pH 5,5). De mengstroom werd gedialyseerd tegen pH 10-buffer om overtollig FA te verwijderen, gecentrifugeerd (5 000 toeren/min) en 24 uur vriesgedroogd om CS‑FA-poeder te verkrijgen.

Bereiding van HFNDs

HCPT (10 µg) werd opgelost in 200 µL 0,1 M NaOH (oplossing A); CS‑FA (10 µg) in 200 µL 0,1 M HCl (oplossing B). Oplossingen A en B werden druppelwijze toegevoegd aan 1 mL zuiver water onder hevig roeren gedurende 30 s, gevolgd door sonicatie (200 W, ijskelder) gedurende 6 min. De resulterende suspensie werd gecentrifugeerd (10 000 toeren/min, 5 min) en 24 uur vriesgedroogd. Voor vergelijking werd alleen chitosaan in oplossing B gebruikt om niet-getargete nanonaldjes (NDs) te produceren.

Karakterisering

SEM (UV‑70, 15 kV) visualiseerde de morfologie. Deeltjesgrootte en zetapotentiaal werden gemeten met een Malvern Zetasizer Nano‑ZS. XRD (X'pert PRO) beoordeelde kristalliniteit. FA-gehalte werd gekwantificeerd door UV bij 281 nm; HCPT-lading door fluorescentie bij 383 nm. Ladingsefficiëntie en insluitefficiëntie werden berekend met vergelijkingen (1)–(4) hieronder.

$$\begin{aligned} \text{Middellading \%} &= \frac{\text{gewicht HCPT in HFNDs}}{\text{gewicht HFNDs}}\times100\%\;(1)\\ \text{Insluitefficiëntie \%} &= \frac{\text{gewicht geneesmiddel in HFNDs}}{\text{gewicht toegediend geneesmiddel}}\times100\%\;(2)\\ \text{FA \% in conjugatie} &= \frac{\text{gewicht FA in conjugatie}}{\text{gewicht conjugatie}}\times100\%\;(3)\\ \text{FA lading \%} &= (1-\text{HCPT lading \%})\times\text{FA \% in conjugatie}\times100\%\;(4) \end{aligned}$$

In vitro vrijgaveonderzoek

HFNDs werden gedispergeerd in 10 mL PBS en in een dialysezak (3 kDa MWCO) geplaatst, vervolgens ondergedompeld in 200 mL PBS (pH 7,4) bij 37 °C, 100 toeren/min. Monsters werden 48 uur lang verzameld en geanalyseerd met fluorescentiespectroscopie.

Confocale imaging van cellen

HeLa-cellen werden gezaaid en 24 uur geïncueerd voordat ze 8 uur lang blootgesteld werden aan HFNDs. Imaging werd uitgevoerd op een Leica confocalemicroskoop (HCPT-excitatie 382 nm, emissie 500–550 nm).

Cellulaire opname gemeten door fluorescentie

Na 6 uur incubatie met NDs of HFNDs (equivalente HCPT) werden cellen gewassen, gedigesteerd met trypsine/EDTA en gesonicteerd. HCPT-gehalte werd gekwantificeerd door fluorescentie bij 382 nm.

Cytotoxiciteitstests

MTT-tests werden uitgevoerd op HeLa-cellen in 96-putplaten. Na 24 uur blootstelling aan het geneesmiddel werd 20 µL van 5 mg/mL MTT 4 uur toegevoegd, gevolgd door 150 µL DMSO. Absorbantie werd gemeten bij 570 nm.

Biodistributie

DiR-geladen NDs en HFNDs werden IV geïnjecteerd in naakte muizen met HeLa-tumorren. Fluorescentie-imaging werd uitgevoerd met een Maestro-systeem na 1, 4, 8, 12 en 24 uur. Ex vivo imaging van tumoren en grote organen werd na 24 uur gedaan.

Tumorinhibitie in vivo

Wanneer tumorvolumes ~60 mm³ bereikten, kregen muizen IV-injecties van fysiologisch zout, vrij HCPT, NDs of HFNDs (80 µg HCPT per muis) elke 3 dagen. Tumorvolume (0,5×L×W²) en lichaamsgewicht werden 21 dagen gemonitord. Na dissectie werden tumoren geweegd en H&E-gekleurd voor histologie.

Statistische analyse

Data werden geanalyseerd met een tweezaagse Student's t‑test; *p* < 0,05 gaf significantie aan (95 % betrouwbaarheid).

Resultaten en discussie

Synthese van het FA‑chitosaanconjugaat

FA werd covalente gebonden aan chitosaan via een EDC/NHS-gemediëerde amidatie (Fig. 1). FT‑IR-spectra (Fig. 2) toonden een duidelijke C=O-rekband bij 1605 cm⁻¹, wat amidebindingsvorming bevestigt. UV-kwantificering leverde een FA-lading van 23,4 ± 2,5 % in het conjugaat op.

Bereiding van HFNDs

De wateronoplosbaarheid van HCPT en de zuuropplosbaarheid van chitosaan werden benut: HCPT in NaOH en CS‑FA in HCl opgelost. Neutralisatie van de twee oplossingen leverde een slechte oplosstof voor beide species op, wat HCPT-precipitatie en gelijktijdige CS‑FA-encapsulatie in nanonaldjes triggreerde (Fig. 3a). Ultrasound en sterische stabilisatie door CS‑FA voorkwamen bulk-kristalgroei, wat resulteerde in nanonaldjes met hoge lengte-breedteverhouding (Fig. 3b–c). Een ontwerp-van-experimenten screening (Tabel 1) optimaliseerde de HCPT:CS‑FA-verhouding, ultrasoonvermogen, pH en concentratie voor de gewenste morfologie.

SEM-analyse (Fig. 4) toonde aan dat overtollig CS‑FA het deeltjesoppervlak bedekte, terwijl onvoldoende CS‑FA tot aggregatie leidde. Neutraal pH was essentieel voor de integriteit van de nanonaldjes, en ultrasoonvermogen beïnvloedde aggregatie en fragmentatie. Hogere mengconcentratie verkleinde de deeltjesgrootte, bevestigd door DLS (Fig. 4f). De geoptimaliseerde HFNDs vertoonden een gemiddelde lengte van ~800 nm, breedte ~80 nm, hydrodynamische diameter 104,3 ± 5,7 nm, en een zetapotentiaal van +16,3 ± 1,9 mV. De 2 wt % dispersie bleef ≥2,5 dagen stabiel.

Middellading was 70,2 ± 3,1 % en insluitefficiëntie 83,1 %. FA was 7,0 % van de totale massa, berekend vanuit het FA-percentage in het conjugaat.

XRD-analyse

XRD-patronen (Fig. 5) bevestigden dat HCPT kristallijn bleef binnen HFNDs, terwijl semi-kristallijn chitosaan brede pieken leverde. In tegenstelling waren bulk HCPT-kristallen (Fig. 6) staafvormig en >10 µm lang, wat de rol van CS‑FA in het moduleren van HCPT-groeikinetiek benadrukt.

In vitro geneesmiddelvrijgave

Vrij HCPT gaf 30 % vrij binnen 1 uur en bijna 100 % na 18 uur. HFNDs vertoonden een duidelijk langzamere, continue vrijgave over 48 uur (Fig. 7), toegeschreven aan de diffusiebarrière van de CS‑FA-huls. Dit profiel is ideaal voor het handhaven van therapeutische concentraties terwijl piekgerelateerde toxiciteit wordt geminimaliseerd.

Cellulaire opname

Confocale imaging (Fig. 8) onthulde sterkere HCPT-fluorescentie in HeLa-cellen behandeld met HFNDs versus niet-getargete NDs, wat foliumzuur-gemediëerde opname aantoont. Kwantitatieve fluorescentie (Fig. 9) bevestigde een hogere internalisatiesnelheid voor HFNDs, wat de targeteringsstrategie valideert.

Cytotoxiciteitstests

MTT-resultaten (Fig. 10) lieten zien dat HFNDs meer celdod bereikten dan vrij HCPT of NDs bij equivalente HCPT-concentraties, wat het dubbele voordeel van gerichte afgifte en continue vrijgave onderstreept. De verhoogde cytotoxiciteit wordt toegeschreven aan efficiënte receptor-gemediëerde internalisatie en een verlengd intracellular vrijgaveprofiel.

Biodistributie

In vivo imaging (Fig. 11a) toonde verwaarloosbaar tumorsignaal voor DiR‑NDs, terwijl DiR‑HFNDs een duidelijke, tijdsafhankelijke accumulatie vertoonden, met een piek na 12 uur. Ex vivo analyse (Fig. 11b–c) bevestigde hogere tumorfluorescentie voor HFNDs, wat succesvolle foliumzuur-gemediëerde tumortargetering aantoont.

Tumorinhibitie in vivo

HFNDs bereikten de meest significante tumorgroeionderdrukking, met eindtumorgewichten aanzienlijk lager dan vrij HCPT of NDs (Fig. 12c). Histologie (Fig. 12d) onthulde uitgebreide necrose in HFND-behandelde tumoren. Belangrijk is dat HFNDs geen gewichtsverlies of duidelijke toxiciteit veroorzaakten, in contrast met de duidelijke bijwerkingen van vrij HCPT (Fig. 12b). Deze bevindingen tonen aan dat HFNDs krachtige antitumoractiviteit combineren met een gunstig veiligheidsprofiel.

Conclusies

We hebben een volledig groene, oplosmiddelvrije route geïntroduceerd om foliumzuur-gefunctionaliseerde HCPT-nanonaldjes te produceren die hoge middellading, gerichte cellulaire opname en continue vrijgave combineren. In vitro en in vivo data bevestigen superieure antikankeractiviteit en verminderde systemische toxiciteit vergeleken met conventionele formuleringen. Dit platform illustreert hoe milieuvriendelijke chemie benut kan worden om nanopartikel-gebaseerde therapeutica vooruit te helpen.