Eenvoudige Fabricage van rGO@Fe3O4-microsferen voor magnetisch gerichte, NIR-responsieve chemo-fotothermale kankertherapie

Samenvatting

Er is aangetoond dat grafeneen die reageert op nabij-infrarood (NIR) licht een veelbelovend effect heeft op fotothermale ablatietherapie tegen kanker. In dit onderzoek rapporteren we de bereiding van Fe₃O₄-gedecoreerde holle grafeneen-microsferen (rGO@Fe₃O₄) via een eenvoudige spraydroog- en co-precipitatiemethode voor magnetisch gerichte en NIR-responsieve chemo-fotothermale combinatietherapie. De microsferen vertonen een zeer hoge specifieke oppervlakte (~120,7 m² g⁻¹) en een groot poriënvolume (~1,012 cm³ g⁻¹), wat zich uiting geeft in een hoge laadcapaciteit voor DOX (~18,43%). De NIR-getriggerde fotothermale werking van de rGO@Fe₃O₄-microsferen reageert op een aan-uit-manier en induceert een hoge fotothermale conversie-efficiëntie. Bovendien tonen de Fe₃O₄-deeltjes op de microsferen een uitstekende gerichtheid op tumorkelchen. De chemo-fotothermale behandeling op basis van rGO@Fe₃O₄/DOX vertoont een superieure cytotoxiciteit tegen HeLa-cellen in vitro. Onze studies wijzen erop dat rGO@Fe₃O₄/DOX-microcapsules groot potentiële waarde hebben voor gecombineerde chemo-fotothermale kankerbehandeling.

Inleiding

Kanker is een van de meest maligne ziekten ter wereld en een leidende doodsoorzaak bij de mens. Hoewel chemotherapie algemeen in de kliniek wordt toegepast, beperken verschillende kernproblemen, zoals lage therapeutische efficiëntie en uitgebreide bijwerkingen, de toepassing ervan ernstig. Medicijnafgiftesystemen (MAS) tonen grote voordelen in het verbeteren van de oplosbaarheid, biobeschikbaarheid en tumoraccumulatie van geneesmiddelen, wat de antitumorale efficiëntie aanzienlijk kan verbeteren. Recentelijk hebben holle microsferen als medicijnafgiftesystemen toenemende aandacht gekregen vanwege hun grote oppervlakte en rijk porieuze structuur.

Grafeneenoxide (GO), een nieuw type anorganisch vrij-metaalmateriaal, is uitgebreid onderzocht voor medicijnafgifte vanwege unieke kenmerken zoals goede bio-compatibiliteit, lage kosten en eenvoudige bereiding. Belangrijk is dat grafeneenoxide effectief licht kan omzetten in warmte bij NIR-belichting, wat een veelbelovende strategie vormt om het fotothermale therapie-effect tegen kanker te verbeteren. De onderzoeksgroep van Chen rapporteerde dat GO anticancergeneesmiddelen kan leveren via niet-covalente interacties zoals π-π stapeling, waterstofbruggen en elektrostatische adsorptie. Echter, 2D-grafeneenoxide-nanosheets neigen tot agglomeratie door de grote specifieke oppervlakte en van der Waals-krachten tussen de grafeneenlagen, wat leidt tot slechte oplosbaarheid in water en verminderde medicijnlaadcapaciteit. Verschillende strategieën zijn verkend om deze tekortkomingen op te lossen. De groep van Tsukruk ontwikkelde holle grafeneencapsules met behulp van laag-voor-laag-assemblagetechnologie, die een extreme hoge medicijnlading vertoonden ten opzichte van andere GO-materialen. Dit kan worden toegeschreven aan de hoge specifieke oppervlakte en het grote poriënvolume van de door GO gestabiliseerde holle capsule. Er zijn echter weinig studies die GO met een driedimensionaal verbonden poriënstructuur voor medicijnafgifte onderzoeken.

Hoewel veel gerapporteerde medicijnafgiftesystemen superieure laadcapaciteit en gecontroleerde afgifte vertonen, wordt hun preklinisch onderzoek en toepassing beperkt door onvoldoende specificiteit voor tumorgeweefsel. Onder de diverse gerichte afgiftesystemen wordt Fe₃O₄, een magnetisch gericht materiaal, wijd toegepast in kankertherapie vanwege de hoge magnetische respons, stabiele kwaliteit en eenvoudige bereidbaarheid. De groep van Ni ontwikkelde Fe₃O₄@SiO₂ kern-schil-nanodeeltjes met superparamagnetische eigenschappen voor magnetische tumortargeting. Verder zijn Fe₃O₄-geankerde GO-nanodeeltjes goed bestudeerd in combinatie met magnetische gerichte afgifte en fotothermale therapie.

In de huidige studie rapporteren we een geavanceerde strategie voor het ontwikkelen van een MAS-platform bestaande uit ijzeroxide-gedecoreerde rGO-holle microsferen (rGO@Fe₃O₄) voor magnetisch gerichte en NIR-getriggerde fotothermale therapie (FTT). Zoals weergegeven in Schema 1, worden rGO@Fe₃O₄-holle microsferen in drie stappen bereid. Ten eerste wordt rGO-SiO₂ gesynthetiseerd via de spraydroogmethode met SiO₂ als sjabloon, waarna holle rGO-microsferen verkregen worden door SiO₂ te verwijderen met HF-etsing. Vervolgens worden Fe₃O₄-nanodeeltjes op de rGO-holle microsferen geankerd om rGO@Fe₃O₄-microsferen te construeren. In dit systeem fungeert rGO als NIR-getriggerde FTT-agent, terwijl Fe₃O₄ de magnetische targeting-eigenschap naar HeLa-cellen biedt. Doxorubiciline (DOX), geencapsuleerd in de microsferen (rGO@Fe₃O₄/DOX) op basis van poriëne adsorptie en π-π stapeling, verwacht een ultrahohe medicijnlaadcapaciteit en pH-responsief afgiftegedrag, en kan het anticancereffect aanzienlijk verbeteren door de combinatie van fotothermale en chemotherapie.

Eenvoudige Fabricage van rGO@Fe3O4-microsferen voor magnetisch gerichte, NIR-responsieve chemo-fotothermale kankertherapie

Materialen en Methodes

Materialen

IJzerchloride hexahydraat (FeCl₃·H₂O), natriumhydroxide (NaOH) en ijzer(II)sulfaat heptahydraat (FeSO₄·7H₂O) werden gekocht bij Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. HeLa-cellen afkomstig van het Tianjin Kankerziekenhuis. Fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), doxorubicinhydrochloride (DOX·HCl), Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), 4',6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) en Cell Counting Kit-8 (CCK-8) werden verkregen van Solarbio Science and Technology Co., Ltd. SiO₂ (~300 nm) werd aangeschaft bij Shanghai Yuanjiang Chemical Company. Grafeneenoxide-oplossing in gedemineraliseerd water (2 mg/ml) was een commercieel beschikbaar product van Nanjing Xianfeng Company.

Bereiding van rGO@Fe₃O₄-microsferen

Holle grafeneenmicrosferen werden bereid via de spraydroogmethode met SiO₂ (300 nm) als sjabloon. Kortom, 100 ml SiO₂-suspensie (50 mg ml⁻¹) werd langzaam toegevoegd aan 300 ml GO-waterige oplossing (2 mg ml⁻¹) onder hevig roeren, waarna het mengsel werd gespraydroogd bij 200 °C in een spraydroogunit. Het product werd vervolgens 2 uur bij 300 °C onder Ar-bescherming gehouden, waardoor rGO-SiO₂ verkregen werd. Om SiO₂ te verwijderen, werd rGO-SiO₂ 48 uur bij 60 °C in HF-oplossing (10%) geplaatst. Het vaste product werd diverse keren gewassen en gedroogd in een vacuümestoven bij 60 °C gedurende 12 uur, met een opbrengst van 75% voor rGO.

De rGO@Fe₃O₄-nanodeeltjes werden bereid via de co-precipitatiemethode. In een typisch proces werden 0,27 g FeCl₃·H₂O, 0,28 g FeSO₄·7H₂O en 0,1 g rGO-holle microsferen opgelost in 10 ml gedemineraliseerd water en 30 minuten gerold bij 50 °C. Vervolgens werd 60 ml NaOH (0,15 mol L⁻¹) langzaam toegevoegd onder continue roering bij 50 °C gedurende 12 uur. De producten werden ten slotte magnetisch gescheiden en herhaaldelijk gewassen met gedemineraliseerd water en ethanol, gevolgd door droging bij 60 °C onder vacuüm gedurende 12 uur.

Structuurkarakterisatie

De grootte en morfologie van de monsters werden geanalyseerd met veldemissie scanning elektronenmicroscopie (FE-SEM, Hitachi, S-4800) en transmissie elektronenmicroscopie (TEM, JEM2100F, JEOL). De samenstelling werd bepaald via Röntgendiffractie (XRD, D8 Focus, Cu Kα-straling, Bruker, Duitsland) met een scansnelheid van 12 °/min in het bereik van 10 tot 80°. Röntgenfoto-elektronspectroscopie (XPS) werd uitgevoerd op een XPS-spectrometer (Thermo Fisher Scientific, ESCALAB 250Xi, VS). FTIR-spectra (FT-IR, AVATAR360, Nicolet) werden opgenomen van 500 tot 4000 cm⁻¹ met een resolutie van 4 cm⁻¹. Magnetische metingen werden verricht met een supergeleidende kwantuminterferentie-apparaat (SQUID, Quantum Design MPMS) magnetometer bij kamertemperatuur (300 K). Ramanspectra werden verzameld met een Ramanspectrometer (Renishaw, inVia Reflex, Engeland) met een 532 nm golfengte laser. De rGO-inhoud werd geëvalueerd met een thermogravimetrische analyzer (TGA, TA Instruments-water LLC, SDTQ-600). De specifieke oppervlakte werd gemeten met de Brunauer-Emmett-Teller (BET)-techniek. UV-Vis-spectra werden opgenomen met een Beckman DU 800 nucleic acid/proteïne analyzer (Beckman Instruments, Inc., Rosemead, CA).

DOX-lading en -afgifte

DOX, een model chemotherapeutisch geneesmiddel, werd in de kernen van rGO@Fe₃O₄ geencapsuleerd om de laad- en afgiftedraging van anticancergeneesmiddelen in vitro te evalueren. rGO@Fe₃O₄/DOX werd bereid volgens eerdere literatuur. Kortom, 10 ml (0,2 mg ml⁻¹) DOX-waterige oplossing werd toegevoegd aan 10 mg rGO@Fe₃O₄-oplossing, het mengsel werd ultrasoon gehomogeniseerd om significante neerslag te voorkomen. Het mengsel werd 24 uur geëquilibreerd op een heen-en-weer schuddelaar (SK-O180-Pro) met een snelheid van 150 rpm. Na centrifugatie bij 6000 rpm gedurende 10 min werd niet-geladen DOX verwijderd, en de supernataant van rGO@Fe₃O₄/DOX werd gemeten via UV-Vis-spectrofotometrie om de hoeveelheid geladen DOX te bepalen. De OD van DOX werd vastgelegd bij 490 nm, en de volgende vergelijkingen werden gebruikt om de laadefficiëntie (LE) en laadcapaciteit (LC) van DOX te berekenen:

$$ \mathrm{LE}=\left(\mathrm{totaal}\ \mathrm{aantal}\ \mathrm{DOX}-\mathrm{Vrij}\ \mathrm{DOX}\right)/\mathrm{totaal}\ \mathrm{aantal}\ \mathrm{DOX} $$

$$ \mathrm{LC}=\left(\mathrm{totaal}\ \mathrm{aantal}\ \mathrm{DOX}-\mathrm{Vrij}\ \mathrm{DOX}\right)/\mathrm{aantal}\ \mathrm{rGO}@{\mathrm{Fe}}_3{\mathrm{O}}_4/\mathrm{DOX} $$

De in vitro afgiftestudies van DOX werden uitgevoerd door rGO@Fe₃O₄/DOX (10 mg) in een dialysezak (MWCO = 1000) met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS, 30 ml) bij pH 5,4, 6,5 of 7,4 te plaatsen, in een 37 °C waterbad te schudden met 80 rpm. Op vooraf bepaalde intervallen werd 3 ml van het afgiftemedium verzameld en de hoeveelheid vrijgekomen DOX berekend door UV-Vis-metingen bij 480 nm.

NIR-getriggerde fotothermale werking van rGO@Fe₃O₄-microsferen

Om de invloed van de rGO@Fe₃O₄-dosis op de NIR-getriggerde fotothermale werking te monitoren, werden rGO@Fe₃O₄-oplossingen met verschillende concentraties (0,0625, 0,125, 0,25, 0,5 en 1 mg ml⁻¹) bestraald met een NIR-laser bij 2 W cm⁻² gedurende 5 minuten. Verder werd de invloed van de NIR-energie geëvalueerd door rGO@Fe₃O₄ (0,25 mg ml⁻¹) te bestralen met verschillende vermogens (1 W cm⁻², 1,5 W cm⁻², 2 W cm⁻²) gedurende 5 minuten. De realtime temperatuur werd gemeten met een FLIR I5 infrarood thermische camera.

In vitro opname

HeLa-cellen werden gezaaid in 35 mm² confocal schoteltjes met een dichtheid van 1 × 10⁵ cellen/put. Na 24 uur incubatie (5% CO₂, 37 °C) werd het medium verwijderd en vers medium met rGO@Fe₃O₄/DOX-microsferen en rGO@Fe₃O₄/DOX met magneet toegevoegd voor nog eens 5 uur incubatie. De rGO@Fe₃O₄/DOX-concentratie was 0,1 mg ml⁻¹. De cellen werden driemaal gewassen met koude PBS (pH = 7,4) en gefixeerd met 4% paraformaldehyde-oplossing gedurende 20 minuten (CLSM, TCSSP5II, Leica, Duitsland).

Cellevensvatbaarheidsassays

De cytotoxiciteit van deze microsferen werd geëvalueerd met een CCK-8-assay na NIR-behandeling. HeLa-cellen werden gezaaid op 96-puttenplaten (5 × 10³ cellen/put) in 100 μl medium en gecultureerd in 5% CO₂ bij 37 °C gedurende 24 uur. Voor de bio-compatibiliteitsbeoordeling werd rGO@Fe₃O₄ toegevoegd met een concentratiebereik van 0,01 tot 0,2 mg ml⁻¹; voor de enkelvoudige fotothermale therapiegroep werd rGO@Fe₃O₄ toegevoegd met dezelfde concentraties en NIR-belichting toegepast gedurende 10 min (2 W cm⁻², 808 nm); voor de gecombineerde fotothermale-chemotherapie groep werd rGO@Fe₃O₄/DOX toegevoegd met een concentratiebereik van 0,01 tot 0,2 mg ml⁻¹ en NIR-belichting toegepast gedurende 10 min (2 W cm⁻², 808 nm). De cellen werden verder geïncubeerd gedurende 24 of 48 uur. Daarna werden de cellen gewassen met PBS en geïncubeerd in 100 μl DMEM-medium met 10 μl CCK-8-oplossing gedurende nog eens 40 min. De levensvatbaarheid werd gedetecteerd met een microplaatlezer bij een golfengte van 450 nm. Alle experimenten werden in drievoud uitgevoerd.

Resultaten en Discussie

Synthese en Morfologische Karakterisatie

De bereiding van rGO@Fe₃O₄-microsferen verliep in drie stappen. Ten eerste werden rGO-SiO₂-microsferen gesynthetiseerd via spraydroging met SiO₂ als sjabloon. De morfologie werd gekarakteriseerd met SEM en TEM. Zoals getoond in Fig. 1a, vertoonden de rGO-SiO₂-microsferen met diameters van 3 μm een uniforme bolvormige vorm en bestonden uit veel samengedrukte SiO₂-nanodeeltjes (~300 nm). TEM-gegevens en de hydrodynamische diameter gemeten met dynamische lichtverstrooiing bevestigden deze resultaten (Fig. 1d, g). Vervolgens werden holle rGO-microsferen verkregen door SiO₂ uit rGO-SiO₂ te verwijderen door verwarmen bij 300 °C en HF-etsing. Duidelijke poriën met een poriëngrootte van ongeveer 300 nm konden worden waargenomen door de oplossing van SiO₂ (Fig. 1b, e). Ten slotte werd Fe₃O₄, vanwege de magnetische targeting-eigenschap, op de poreuze rGO gedeponeerd via de co-precipitatiemethode. SEM- en TEM-waarnemingen toonden een opvallende afname van de poriëngrootte na Fe₃O₄-lading (Fig. 1c, f), wat de haalbaarheid van medicijnafgifte en gecontroleerde afgifte aantoont. Opvallend is dat de deeltjesgrootte en hydrodynamische groottedistributie van rGO-SiO₂, rGO en rGO@Fe₃O₄ tijdens deze behandelingen nauwelijks veranderden (Fig. 1g, h, i).

Structuur- en Samenstellingskarakterisatie

Om de succesvolle bereiding van rGO@Fe₃O₄ te bevestigen, werd SEM met EDS gebruikt om de structuur en samenstelling van de microsferen te onderzoeken. De EDS-afbeeldingen van rGO@Fe₃O₄ werden gekarakteriseerd door het visualiseren van de inelastisch verstrooide elektronen in de energieverliesvensters voor de elementen O, Fe en C, waarbij de verschillende kleurengebieden O-, Fe- en C-rijke locaties in de echte structuren vertegenwoordigen. Zoals getoond in Fig. 2a en b, waren Fe en O wijdverspreid in de rGO@Fe₃O₄-microsferen met een hoge lading dichtheid. Figuur 2d bevestigde dat de Fe₃O₄-nanodeeltjes uniform verdeeld waren in de rGO met een diameter van ongeveer 18 nm, wat resulteerde in een scherpe afname van de poriëngrootte in de rGO@Fe₃O₄-microsferen. Het geselecteerde gebied elektronen diffractie (SAED) patroon bevestigde de aanwezigheid van Fe₃O₄ in rGO (Fig. 2e), de karakteristieke resonanties in 2,98 nm, 2,53 nm, 2,09 nm, 1,62 nm en 1,49 nm vlakafstand toegewezen aan de 220, 311, 400, 511 en 440 vlakken van de kubisch vlakgecentreerde fase van Fe₃O₄, respectievelijk. De pieken op 220, 311, 400, 511 en 440 corresponderend met Fe₃O₄ werden ook gedetecteerd in de XRD-spectra, consistent met SAED-resultaten (Fig. 2c). Er is echter gerapporteerd dat Fe₃O₄ en γ-Fe₂O₃ niet onderscheiden kunnen worden door het XRD-patroon onafhankelijk vanwege dezelfde locatie van karakteristieke pieken. XPS-resultaten toonden dat de predominante pieken bij 725,9/724,5 eV en 714,1/711,0 eV, corresponderend met Fe2p_1/2 en Fe 2p_3/2 van rGO@Fe₃O₄ (Fig. 2g, h), respectievelijk, wat wijst op de co-existentie van Fe³⁺ en Fe²⁺ in Fe₃O₄. Thermogravimetrische (TGA) analyse werd uitgevoerd om het thermische afbraakgedrag van rGO in rGO@Fe₃O₄-microsferen te monitoren door het monster te verwarmen tot 800 °C en af te koelen tot 100 °C in een luchtatmosfeer (Fig. 2f). De massa-verliescurve toonde twee duidelijke massa-verliesregio's, waaronder de dehydratatieregio (40-300 °C) en de devolatisatieregio (300-800 °C) van rGO in rGO@Fe₃O₄, de koolstofinhoud berekend uit het monster was 25,6 wt.%.

De magnetische eigenschappen van rGO@Fe₃O₄-microsferen werden onderzocht met een supergeleidende kwantuminterferentie-apparaat. Het magnetische veld werd gescand in een bereik van -20.000 tot 20.000 Oe bij kamertemperatuur. Figuur 2i toont de verzadigingsmagnetisatie (Ms) waarde en coercitieve veld (Hc) waarde van Fe₃O₄ van respectievelijk 66,6 emu g⁻¹ en 9,3 Oe. Na het laden van Fe₃O₄ op rGO, daalde de Ms-waarde en Hc-waarde van de rGO@Fe₃O₄-microsferen tot 33,9 emu g⁻¹ en 7,44 Oe. De opvallende afname in magnetische verzadiging kan worden toegeschreven aan de diamagnetische eigenschappen van rGO in de rGO@Fe₃O₄-microsferen. Bovendien werd de selectieve agglomeratie-eigenschap van rGO@Fe₃O₄-microsferen intuïtief gedemonstreerd door een magnetische scheidingsexperiment. De suspensies van Fe₃O₄ en rGO@Fe₃O₄-microsferen werden in een fiool met een externe magneet geplaatst gedurende 2 min, de suspensies concentreerden zich aan de magneetkant en de waterige oplossing werd transparant. Toen de magneet werd verwijderd, werden de rGO@Fe₃O₄-microsferen na langzaam schudden weer uniform verdeeld, wat aangeeft dat rGO@Fe₃O₄-microsferen de eigenschap van goede water-dispergeerbaarheid bezitten. De uitstekende water-dispergeerbaarheid en magnetische respons-eigenschap banen de weg voor de magnetische gerichte toepassing van rGO@Fe₃O₄ als medicijndragers in kankerbehandeling.

Fotothermale Effect Analyse

Gegeven de diepere penetratie in het weefsel en minder schade aan omringende weefsels van NIR, werd NIR-responsieve fotothermale therapie vaak toegepast voor tumorbehandeling. Daarom werd het fotothermale transformatiegedrag van rGO@Fe₃O₄ waterige oplossingen bij verschillende concentraties en vermogensdichtheden opgenomen onder NIR-laserbestraaling bij 808 nm gedurende 5 minuten. Figuur 3a, b toonde dat de temperatuurstijging van rGO@Fe₃O₄ sterk afhankelijk was van de concentratie en de laservermogensdichtheid. Bij een concentratie van de microsferen van 1 mg ml⁻¹ steeg de temperatuur van 27,9 tot 70,3 °C onder NIR-laserbestraaling gedurende 5 minuten bij 2 W cm⁻², terwijl de temperatuur voor de PBS-groep slechts steeg van 31,7 tot 36,2 °C. De hoge fotothermale conversie-efficiëntie van rGO@Fe₃O₄ heeft groot potentieel voor tumorfotothermale therapie volgens eerdere rapporten dat eiwitafwijkingen en DNA-schade in cellen optreden bij blootstelling aan 50 °C gedurende 4 tot 6 minuten. Om het fotothermale transformatiegedrag van rGO@Fe₃O₄ intuïtief weer te geven, werd IR-thermografie uitgevoerd en de resultaten getoond in Fig. 4c. De rGO@Fe₃O₄-oplossing met een concentratie van 1 mg ml⁻¹ steeg snel tot 70,3 °C na NIR-bestraaling gedurende 5 minuten, terwijl de watergroep geen duidelijke veranderingen vertoonde, consistent met de thermometrie-resultaten. Verder werd de fotothermale stabiliteit van rGO@Fe₃O₄ bestudeerd door een laser aan/uit-procedure uit te voeren met een 808 nm laser bij 2 W cm⁻² voor zes cycli (Fig. 3d). Identieke temperatuurstijgingen werden verkregen, wat de perfecte NIR-fotothermale stabiliteit van rGO@Fe₃O₄-composieten aangeeft. Deze resultaten tonen aan dat rGO@Fe₃O₄-microsferen grote belofte inhouden als fotothermale agent voor fotothermale therapie bij kanker.

Medicijnlading en -afgifte

De oppervlakte en poriëngrootte van rGO@Fe₃O₄ werden geëvalueerd door BET- en BJH-analyses (Fig. 2a, b). De N₂-adsorptie-desorptiecurve was van isoterm type IV, en de oppervlakte en poriëngrootte waren respectievelijk 120,7 m² g⁻¹, 2-8 nm en 1,012 cm³ g⁻¹. De resultaten toonden aan dat rGO@Fe₃O₄ mesoporieuze kanalen en een gemiddelde poriëngrootteverdeling bezat, wat groot potentieel voor anti-tumor medicijnlading aantoonde. Vervolgens werden de rGO@Fe₃O₄-microsferen met poreuze structuur gebruikt om een model chemotherapeutisch geneesmiddel doxorubiciline te laden door simpelweg te mengen en lichte sonicatie. De ATR-FTIR-analyse bevestigde verder de stabiele incorporatie van DOX in rGO@Fe₃O₄ door de karakteristieke resonantie van -COOH en benzeengroepen van DOX bij 1726 cm⁻¹ en 1618 cm⁻¹ (Fig. 4c). Scanning elektronenmicroscopie (SEM) observatie toonde dat de nieuwe signalen van N-elementen toegewezen aan DOX uniform verdeeld waren in de microsfeer na DOX-lading (Fig. 4d, e). Bovendien waren de DOX-laadefficiëntie (LE) en laadcapaciteit (LC) van rGO@Fe₃O₄/DOX respectievelijk 92,15% en 18,43%. De opvallend hogere LC van rGO@Fe₃O₄/DOX dan veel medicijndragers kan worden toegeschreven aan de extreme hoge oppervlaktes en poriëngroottes. De hoge LE van rGO@Fe₃O₄/DOX kan worden toegeschreven aan twee aspecten: enerzijds kan rGO@Fe₃O₄ interacteren met DOX door sterke π-π stapeling tussen sp2-gehybridiseerde π-bindingen van rGO@Fe₃O₄ en het chinon-gedeelte van DOX, en anderzijds kunnen ze waterstofbruggen vormen tussen de carboxyl (–COOH), hydroxyle (–OH) groepen van rGO@Fe₃O₄ en de amine (–NH₂), hydroxyle (–OH) groepen van DOX. Vervolgens monitorerden we het DOX-afgiftegedrag in PBS bij pH 7,4, 6,5 en 5,4, om de extracellulaire omgevingen van tumor- en normale weefsels na te bootsen. Zoals aangegeven in Fig. 4f, versnelde de afgiftesnelheid van DOX toen de pH werd aangepast van 7,4 naar 5,4, en de cumulatieve DOX-afgifte bij pH 5,4 kon oplopen tot 73% na 98 uur behandeling. Daarom vertoonde het cumulatieve afgifteprofiel van DOX uit rGO@Fe₃O₄ een pH-afhankelijke manier. Deze versnelde afgifte onder zuure omstandigheden kan te maken hebben met de partiële protonering van de hydroxyle en amine groepen van DOX, wat leidt tot hogere medicijnooplosbaarheid en verzwakking van waterstofbruggen tussen DOX en grafeneen. Verder bestudeerden we ook het NIR-responsieve DOX-afgiftegedrag in vitro. Zoals aangegeven in Fig. 4g, werd DOX-afgifte versneld door NIR-bestraaling en de afgiftesnelheid van DOX was tot 85%. Dit pH- en NIR-stimuli-responsieve gedrag speelt een belangrijke rol in effectieve medicijnafgifte naar de tumorplaats.

In vitro Celopname

Om de magnetische targeting-eigenschap van Fe₃O₄ in rGO@Fe₃O₄-microsfeer te verifiëren, werden de cellulaire opname-experimenten met of zonder magnetische veldbehandeling kwalitatief onderzocht met confocale laserscanningmicroscopie (CLSM). HeLa-cellen werden geïncubeerd met rGO@Fe₃O₄/DOX gedurende 4 uur en de kernen van HeLa werden gekleurd met DAPI. De resultaten in Fig. 5 toonden aan dat de zwarte vlek corresponderend met rGO@Fe₃O₄-microsfeer en duidelijke intracellulaire rode fluorescentiesignalen toegewezen aan DOX waargenomen werden in de rGO@Fe₃O₄-groep met een magnetische veldbehandeling. In tegenstelling, waren er minder zwarte vlekken en zwakkere DOX-fluorescentie te vinden wanneer de rGO@Fe₃O₄-groep zonder magnetische veldlading. De verklaring kan zijn dat de zwarte vlekken toegeschreven aan rGO@Fe₃O₄ geïternaliseerd in de cel, kunnen worden bevorderd door de magneet. De resultaten wijzen erop dat Fe₃O₄ in rGO@Fe₃O₄/DOX HeLa-cellen efficiënt kan targeten en de celinternalisatie van microsferen aanzienlijk verbetert, wat de gunstige magnetische targeting-eigenschap van het medicijnafgiftesysteem in kankertherapie aantoont.

In vitro Cytotoxiciteitsanalyses

De bio-compatibiliteit van rGO@Fe₃O₄ werd geëvalueerd met een CCK-8-assay tegen HeLa-cellen. Zoals getoond in Fig. 6a, na incubatie met rGO@Fe₃O₄ bij een breed bereik van verschillende concentraties, was de cellevensvatbaarheid ook hoger dan 90% zelfs bij hoge concentraties tot 200 μg ml⁻¹, de resultaten gaven aan dat rGO@Fe₃O₄ een hoge bio-compatibiliteit vertoont en kan dienen als een efficiënt medicijnafgifteplatform. De fotothermale therapie-efficiëntie van rGO@Fe₃O₄ werd verder onderzocht na incubatie met HeLa-cellen gedurende 24 en 48 uur onder NIR-lichtbestraaling (808 nm NIR-laser, 10 min). Zoals getoond in Fig. 6b, was de fototoxiciteit duidelijk dosis-afhankelijk bij NIR-stimulatie, en de cellevensvatbaarheid daalde van 90,37 naar 35,52% na 24 uur, en van 93,77 naar 31,75% na 48 uur, wat impliceert dat rGO@Fe₃O₄ een uitstekende fototoxiciteit vertoont en grote belofte inhouden voor fotothermale therapie. Om de synergistische therapeutische efficiëntie van fotothermale-chemotherapie te schatten, werd de cytotoxiciteit van rGO@Fe₃O₄/DOX tegen HeLa-cellen met en zonder NIR-bestraaling bestudeerd. Zoals getoond in Fig. 6c, d, vertoonde de cellevensvatbaarheid een concentratie-afhankelijke en tijd-gecontroleerde manier. Ongeveer 65% en 80% van HeLa-cellen werden gedood door rGO@Fe₃O₄/DOX zonder NIR-bestraaling en DOX na 24 uur, de afgenomen tumor-dodende capaciteit van rGO@Fe₃O₄/DOX vergeleken met vrij DOX kan te maken hebben met het vertraagde DOX-afgiftegedrag van rGO@Fe₃O₄/DOX-microsferen. Na NIR-laserbestraaling (808 nm NIR-laser, 10 min) doodde de rGO@Fe₃O₄/DOX met lasergroep meer dan 86% cellen bij een equivalente dosis DOX (30 μg ml⁻¹). Vergelijkbare resultaten konden worden waargenomen na dezelfde behandeling van cellen gedurende 48 uur, de afname in cellevensvatbaarheid van DOX, rGO@Fe₃O₄/DOX, rGO@Fe₃O₄/DOX met NIR-bestraaling groep was 80%, 76% en 90%, respectievelijk, wat een synergistisch effect van de gecombineerde fotothermale therapie en chemotherapie aangeeft.

Conclusies

Samengevat, hebben we een eenvoudige strategie verkend om een rGO-gebaseerd medicijnafgifteplatform rGO@Fe₃O₄/DOX te construeren voor synergistische fotothermale-chemotherapie. rGO@Fe₃O₄/DOX-microsfeer vertoonde een uitstekende NIR-getriggerde FTT-efficiëntie en perfecte NIR-fotothermale stabiliteit. De Fe₃O₄ op de microsferen zorgde voor een uitstekende tumorkelchtargeting. DOX kon in rGO@Fe₃O₄ geencapsuleerd worden met een ultrahohe medicijnlaadcapaciteit en een pH-responsief medicijn-afgiftegedrag kon gelijktijdig worden bereikt. Bovendien werd een verbeterde antitumorale efficiëntie bereikt wanneer een combinatie van chemotherapie en fotothermale therapie werd toegepast. Daarom kan dit multifunctionele medicijnafgifteplatform een veelbelovende kandidaat zijn voor tumortargeting en combinatorische kankertherapie in de toekomst.