Nabij-infrarood licht getriggerde thermo-responsieve poly(N-isopropylacrylamide)-pyrrool nanocomposieten voor chemo-fotothermische kankertherapie

Abstract

De combinatietherapie op basis van multifunctionele nanocomposieten wordt beschouwd als een veelbelovende benadering om de therapeutische werkzaamheid van kanker te verbeteren. Hierin rapporteren we gericht multifunctioneel poly(N -isopropylacrylamide) (PNIPAM)-gebaseerde nanocomposieten voor synergetische chemo-fotothermische therapie voor borstkankercellen. Om de overgangstemperatuur te verhogen, werd acrylzuur (AAc) toegevoegd in het synthetische proces van PNIPAM, wat aantoont dat de intrinsieke lagere kritische oplossingstemperatuur werd veranderd in 42 ° C. Om het fotothermische effect onder bijna-infrarood (NIR) laserbestraling (808 nm) te genereren, werden polypyrrool (ppy) nanodeeltjes uniform gedecoreerd in PNIPAM-AAc. Foliumzuur (FA), als een kankergerichte ligand, werd met succes geconjugeerd op de overtollige carboxylgroepen in het PNIPAM-netwerk. De medicijnafgifte van PNIPAM-ppy-FA-nanocomposieten werd efficiënt geactiveerd als reactie op de temperatuurverandering door NIR-laserbestraling. We hebben ook bevestigd dat PNIPAM-ppy-FA werd geïnternaliseerd in MDA-MB-231-borstkankercellen door folaatreceptor-gemedieerde endocytose en significant verbeterde therapeutische werkzaamheid van kanker met combinatiebehandeling van chemo-fotothermische effecten. Daarom stimuleert ons werk verdere verkenning van multifunctionele nanodragers voor synergetische therapeutische benaderingen van verschillende soorten kankercellen.

Inleiding

Drug delivery system (DDS) is een van de krachtige methoden voor het toedienen van een farmaceutische verbinding om een therapeutisch effect te bereiken bij kankertherapie [1]. Hoewel het doel van DDS is om het actieve medicijn af te geven en zich op te hopen in het gewenste gebied, gaat de conventionele DDS vaak gepaard met ernstige bijwerkingen en inefficiënte therapeutische efficiëntie [2, 3]. Om deze obstakels te overwinnen, is een verscheidenheid aan nanodragers ontwikkeld, die het vermogen hebben om te reageren op specifieke interne of externe stimuli, waaronder temperatuur, licht, pH, elektrisch veld, oxidatiereductie, enzymactiviteit en antigeenconcentratie, voor geavanceerde DDS en gebruikt om aanhoudende en gecontroleerde medicijnafgifte te induceren [4,5,6].

Een van de verschillende stimuli, de thermo-responsieve nanodrager, is een krachtige benadering om de behandeling van kanker te verbeteren, omdat medicijnen bij een bepaalde temperatuur kunnen worden vrijgegeven in nanodeeltjes [7]. Bovendien zou het voordeel van thermogevoelige nanodeeltjes kunnen worden gecombineerd met andere stimuli om de volledige uitroeiing van kanker te induceren [8, 9]. Als thermo-responsief nanodeeltje, poly(N -isopropylacrylamide) (PNIPAM) heeft de meeste aandacht gekregen, omdat het een faseovergang vertoont bij een lagere kritische oplossingstemperatuur (LCST) van ongeveer 32 °C [10, 11]. Onder de LCST bestaat het hele polymeernetwerk in PNIPAM in een gezwollen toestand vanwege de waterstofbruggen. Aan de andere kant gaat PNIPAM over naar de hydrofobe toestand en worden waterstofbruggen verminderd, wat resulteert in een ineenstorting van het polymeernetwerk boven de LCST [12, 13]. Vergeleken met andere nanodeeltjes heeft de op PNIPAM gebaseerde nanodrager het voordeel van een hoge efficiëntie van medicijninkapseling, een gecontroleerde medicijnafgiftecapaciteit en een goede biocompatibiliteit [14]. Vanwege de spontane afgifte van geneesmiddelen bij lichaamstemperatuur is de op PNIPAM gebaseerde nanodrager echter niet voldoende om te gebruiken bij geavanceerde DDS. Om dit te overwinnen, voegden de eerdere onderzoeken de organische zuren (bijv. vinylazijn, acryl en allylazijnzuur) toe aan het synthetische proces van PNIPAM, wat resulteerde in verminderde bijwerkingen door de continue afgifte van het geneesmiddel [15].

Onlangs hebben een aantal onderzoeken zich gericht op nieuwe therapeutische benaderingen waarbij de integratie van twee of meer stimuli nanodeeltjes activeerde voor een verbeterde therapeutische werkzaamheid van kanker [16,17,18]. De fotothermische therapie (PTT) vertoont bijvoorbeeld verschillende voordelen, zoals nauwkeurige lichtregeling op tumoren, niet-invasieve penetratie en lage toxiciteit voor normale cellen [19, 20]. Om de nanodeeltjes te combineren met PTT, moeten de fotothermische middelen (bijvoorbeeld gouden nanostaafjes, koolstofnanobuisjes, polypyrrool (ppy) en grafeenoxide) uniform worden ingekapseld in op PNIPAM gebaseerde nanodeeltjes [21,22,23]. De vorige studie vervaardigde de mesoporeuze met silica gecoate gouden nanostaafjes met een thermo- en pH-responsieve PNIPAM-schaal en onderzocht verder in vivo toepassingen voor kankertherapie [24]. Deze op PNIPAM gebaseerde nanocomposieten vereisen echter een synthetisch proces in meerdere stappen. Bovendien, aangezien nanocomposieten geen gerichte groep tegen specifieke kankercellen hadden, zou het ernstige bijwerkingen kunnen veroorzaken aan andere organen of normale weefsels. In ons vorige rapport hebben we een bidirectioneel gecontroleerd afgiftesysteem ontwikkeld met behulp van de thermo- en pH-gevoelige eigenschappen van PNIPAM [15]. PNIPAM-nanogels werden gecopolymeriseerd met acrylzuur (AAc) -inhoud voor efficiënte controle van LCST. Om kankertargeting en therapeutische werkzaamheid beter te verbeteren, hebben we de kankergerichte combinatietherapie ontwikkeld met behulp van chemo- en fotothermisch effect (schema 1). Naarmate de temperatuur stijgt door NIR-laserbestraling, werden de medicijnen van thermo-responsieve PNIPAM-nanocomposieten vrijgegeven en werd het fotothermische effect vervolgens geactiveerd. Dankzij het geconjugeerde foliumzuur (FA) vertoonden op PNIPAM gebaseerde nanocomposieten een significant verbeterde therapeutische werkzaamheid tegen MDA-MB-231-borstkankercellen.

Schematische illustratie van a synthese van NIR-licht en door thermos geactiveerde Dox@PNIPAM-ppy-FA nanocomposieten en b aanvraag voor verbeterde chemo-fotothermische combinatietherapie in borstkankercellen

Materialen en methoden

Materialen

NIPAM, N,N ′-methyleenbisacrylamide (MBA), kaliumpersulfaat (KPS, 99%), N-(3-Dimethylaminopropyl)-N ′-ethylcarbodiimidehydrochloride (EDC) en N -Hydroxysuccinimide (NHS) werd gekocht bij Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, VS). Polyvinylpyrrolidon (PVP) en pyrrool (98%) werden verkregen van Alfa Aesar (Ward Hill, MA, VS). AAc werd gekocht bij Dae Jung Chemicals &Materials. Co. Ltd (Korea). FA-PEG-amine (FA-PEG-NH₂ , MW:5 kDa) werd geleverd door Nanocs, Inc. (New York, NY, VS). Doxorubicinehydrochloride (Dox) werd verkregen van Tokyo Chemical Industry. Co. Ltd (Tokio, Japan). Alle chemicaliën en materialen werden commercieel gebruikt zonder verdere zuivering.

Synthese van met ppy versierd PNIPAM-AAc nanodeeltje

Het thermo-responsieve PNIPAM gecopolymeriseerd met AAc-nanodeeltjes werd gesynthetiseerd volgens eerder rapport [15]. 1,13 g NIPAM-monomeer, 0,077 g MBA en 0,136 g AAc werden opgelost in 100 ml gedeïoniseerd water en toegevoegd in een driehalsrondbodemkolf van 250 ml. Na 30 min werd de reactietemperatuur verhoogd tot 80°C en 1 uur krachtig geroerd. Om polymerisatie te induceren, werd KPS (1,5 mg) aan het mengsel toegevoegd, gevolgd door 4 uur roeren. Het mengsel werd gedurende 7 dagen gedialyseerd tegen een afgesneden molecuulgewicht (MWCO) 12-14 kDa dialysemembraan in gedeïoniseerd water om niet-gereageerd monomeer, initiator, overbodige ionen te verwijderen en PNIPAM-AAc nanodeeltjes werden verkregen door 48 uur vriesdrogen. Om het fotothermische effect te functionaliseren, werd ppy gedecoreerd tot PNIPAM-AAc-nanodeeltjes [25]. PVP (50 en 100 mg) en pyrroolmonomeer (50 en 100 L) werden snel toegevoegd in 10 mg/ml PNIPAM-AAc-oplossing en werden 12 uur bij kamertemperatuur geroerd. Vervolgens werd KPS (3,4 mg) in de PNIPAM-AAc-oplossing ingebracht en bovendien 14 uur geroerd. Het met ppy versierde PNIPAM-AAc werd driemaal gecentrifugeerd met gedestilleerd water. De PNIPAM-ppy-5 en PNIPAM-ppy-10 werden verkregen door 48 uur te vriesdrogen.

Synthese van op kanker gerichte PNIPAM-ppy nanocomposieten

Om op kanker gerichte PNIPAM-ppy nanocomposieten (PNIPAM-ppy-FA) te verkrijgen, werd 10 mg PNIPAM-ppy opgelost in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS, 10 ml, pH 5,5) en werd gedurende 5 minuten aan ultrasone trillingen onderworpen. EDC (15 mg, 0,078 mmol) en NHS (15 mg, 0,13 mmol) werden toegevoegd aan de PNIPAM-ppy-oplossing. Na 1 uur, FA-PEG-NH₂ (5 mg) werd toegevoegd en er werd nog een nacht geroerd. Niet-gereageerde FA-PEG-NH₂ , EDC en NHS in PNIPAM-ppy-oplossing werden verwijderd door een dialysemembraan (MWCO 6-8 kDa) en PNIPAM-ppy-FA-nanocomposieten werden 48 uur gevriesdroogd.

Synthese van met medicijnen geladen PNIPAM-ppy-FA-nanocomposieten tegen kanker

10 mg PNIPAM-ppy-FA werd opgelost in gedeïoniseerd water en werd gedurende 5 minuten aan ultrasone trillingen onderworpen. 0,5 mg/ml Dox werd druppelsgewijs toegevoegd aan de PNIPAM-ppy-FA-oplossing, waarbij krachtig werd geroerd bij kamertemperatuur. Ongeladen Dox werd verwijderd door centrifugeren (14.000 rpm, 10 min) en werd gezuiverd met gedeïoniseerd water. Dox-geladen PNIPAM-ppy-FA (Dox@PNIPAM-ppy-FA) werd verkregen door 48 uur te vriesdrogen.

Karakterisatie van NIR en thermo-responsieve PNIPAM-ppy-FA nanocomposieten

Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM, JEOL-2100F, JEOL, Japan) werd gebruikt om de grootte, morfologie en distributie van PNIPAM-ppy-FA nanocomposieten te karakteriseren. Voor TEM-meting werden monsters bereid door een druppel van de monsteroplossing in gedeïoniseerd water (concentratie:1 g/L) te plaatsen op een 200 mesh koperen rooster bedekt met koolstof. De grootteverdeling en oppervlaktelading van PNIPAM-ppy-FA nanocomposieten, die werden opgelost in gedeïoniseerd water en gedurende 5 minuten met ultrasone trillingen werden behandeld, werden gemeten met behulp van een Zetasizer Nano Z (Malvern Instruments, VK). De oppervlaktemodificatie en chemische binding van PNIPAM-ppy-FA-nanocomposieten werden bevestigd door Fourier-transformatie-infraroodspectroscopie (FT-IR). FT-IR-spectra werden opgenomen op de KBr-pellets met behulp van een Nicolet iS50-instrument (Thermo Fisher Scientific, Inc., VS) in het bereik van 400-4000 cm⁻¹ met een resolutie van 4 cm⁻¹ . De optische eigenschap en Dox-laadcapaciteit in PNIPAM-ppy-FA-nanocomposieten werden waargenomen met UV-Vis-spectroscopie (UV 1800, Shimazu, Japan).

Fotothermische eigenschappen en fotostabiliteit van NIR en thermo-responsieve PNIPAM-ppy-FA nanocomposieten

De fotothermische eigenschap van met Dox geladen PNIPAM-ppy-FA-nanocomposieten (Dox@PNIPAM-ppy-FA) werd geëvalueerd door temperatuurveranderingen in realtime te detecteren. Dox@PNIPAM-ppy-FA werd opgelost in een waterige oplossing met verschillende concentraties van 0,05, 0,1 en 0,2 mg/ml en werd 20 min bestraald met een 808 nm NIR-laser (MDL-N-808, CNI Optoelectronics Tech. Co. Ltd., China) met een vermogensdichtheid van 2 W/cm² . De invloed van de NIR-laservermogensdichtheid is onderzocht door 20 min bestraling met een NIR-laser met een vermogensdichtheid van 1, 2 en 3 W/cm² , respectievelijk. Bovendien werd, om de fotothermische stabiliteit tegen NIR-laser te onderzoeken, de Dox@PNIPAM-ppy-FA-oplossing (0,1 mg/ml) gedurende 15 minuten blootgesteld en gedurende vijf keer het natuurlijke afkoelingsproces gevolgd. Tijdens NIR-laserbestraling werd de temperatuur van Dox@PNIPAM-ppy-FA-oplossing elke 60 s gedurende 15 minuten gemeten door een thermokoppel dat was gekoppeld aan een digitale thermometer (DTM-318, Tecpel Co., Taiwan).

NIR en thermo-responsieve geneesmiddelafgifte van PNIPAM-ppy-FA-nanocomposieten

Om de afgifteprofielen van Dox door thermo-respons te bestuderen, werden Dox@PNIPAM-ppy-FA-oplossingen (1 mg/ml) bereid in een flesje van 5 ml en vervolgens geroerd bij 25, 37 en 50 °C. Op een gedefinieerde afgiftetijd (0-72 uur) werd het supernatant van elk monster verzameld door centrifugeren en vervangen door een gelijk volume vers medium. De hoeveelheid Dox die vrijkomt uit PNIPAM-ppy-FA-nanocomposieten werd geschat door meting van UV-Vis-spectroscopie bij 480 nm. Bovendien werd het Dox-afgiftegedrag via op NIR-laserstimuli reagerende Dox@PNIPAM-ppy-FA-oplossing (1 mg/ml) krachtig geroerd bij 37 °C en gedurende 10 minuten bestraald op vooraf bepaalde tijdstippen (1, 2, 3 , 4 en 5 uur). Als controle werd Dox@PNIPAM-ppy-FA-oplossing zonder NIR-laserbestraling gebruikt. De vrijgegeven Dox werd bepaald met de bovengenoemde methode.

Cytotoxiciteitsanalyse van PNIPAM-ppy-FA nanocomposieten

De cytotoxiciteit van de PNIPAM-ppy-FA-nanocomposieten, waaronder PNIPAM-ppy-FA en Dox@PNIPAM-ppy-FA, werd geverifieerd met behulp van de MTT-assay. A549- en MDA-MB-231-cellen werden gezaaid in platen met 96 putjes met een dichtheid van 1 × 10⁴ cellen per putje in 200 µL RPMI 1640-medium met 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine en werden geïncubeerd bij 37 ° C onder een bevochtigde atmosfeer met 5% CO₂ . Na 1 dag werd 200 µL PNIPAM-ppy-FA nanocomposieten met verschillende concentraties (20-100 µL) aan elke cel behandeld en werd de plaat 24 uur geïncubeerd. De cellen werden gewassen met DPBS en het medium werd vervolgens vervangen door vers medium met MTT-middel (0,5 mg/ml). Na nog een incubatie van 4 uur werd het medium voorzichtig verwijderd en werd 200 µL DMSO aan elk putje toegevoegd om de geïnternaliseerde paarse formazankristallen op te lossen. De absorptie werd gemeten bij 595 nm met behulp van een iMark™-microplaatlezer (Bio-rad, Hercules, CA, VS).

Cellulaire opnameanalyse van PNIPAM-ppy-FA-nanocomposieten

Om het vermogen tot richten op specifieke kankercellen van PNIPAM-ppy-FA-nanocomposieten te evalueren, werden A549- en MDA-MB-231-cellen gezaaid in een plaat met 8 putjes (ibidi, München, Duitsland) met een dichtheid van 2 × 10⁴ cellen / ml en werden 24 uur geïncubeerd. De cellen werden vervolgens 6 uur geïncubeerd met PNIPAM-ppy-FA nanocomposieten (60 µg/ml). Vervolgens werden de cellen tweemaal gewassen met DPBS om de resterende nanocomposieten te verwijderen en werden ze gedurende 15 minuten gefixeerd met 4% paraformaldehyde. Na behandeling van 0,1% Triton-X gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur, werden de cellen uiteindelijk gekleurd door Alexa Fluor 488 phalloidin (1:200, Invitrogen, VS) gedurende 1 dag bij 4 °C en 4,6-diamidino-2- fenylindol (DAPI, Thermo Fisher Scientific, VS) gedurende respectievelijk 10 minuten. De cellulaire opnamebeelden werden waargenomen met behulp van een confocale laser scanning microscopie (CLSM, LSM 710, Carl Zeiss, Duitsland).

Verbeterde antikankereffecten van PNIPAM-ppy-FA-nanocomposieten via NIR-laserbestraling

De verbeterde therapeutische werkzaamheid met behulp van NIR en thermo-responsieve PNIPA-ppy-FA op borstkankercellen werd onderzocht met MTT-assay. MDA-MB-231 (1 × 10⁴ cellen / ml) werden gezaaid op platen met 96 putjes en werden 24 uur geïncubeerd. De cellen werden vervolgens gewassen met DPBS en PNIPAM-ppy-FA en Dox@PNIPAM-ppy-FA nanocomposieten in verschillende concentraties (20, 40, 60, 80 en 100 μg/ml) werden op een concentratieafhankelijke manier aan elk putje toegevoegd. . Na een nacht incubatie werd het medium verwijderd, gevolgd door de toevoeging van vers medium. Voor de NIR-laserbestralingsgroepen werden de cellen behandeld met 5 W/cm² gedurende 5 min. Vervolgens werd MDA-MB-231 gewassen met DPBS en het verse medium inclusief MTT-oplossing werd toegevoegd. Na 4 uur werd het medium voorzichtig verwijderd en werd 200 L DMSO aan elk putje toegevoegd. Ten slotte werd de absorptie bij 595 nm gemeten met een iMark™-microplaatlezer om de levensvatbaarheid van de cellen te bepalen. Als een andere methode voor het observeren van de therapeutische effecten van kanker, werd de test van levend en dood uitgevoerd. PNIPAM-ppy-FA en Dox@PNIPAM-ppy-FA (60 g/ml) werden behandeld in MDA-MB-231. Na 24 uur werd MDA-MB-231 belicht met of zonder NIR-laserbestraling (5 W/cm² , 5 min) en werden gekleurd met calceïne AM en ethidium homodimer-1. Na 30 minuten werden de cellen verschillende keren gewassen met DPBS. De levende/dode beelden werden verkregen met behulp van omgekeerde fluorescentiemicroscopie (Olympus Ix73, Japan).

Resultaten en discussie

Synthese en karakterisering van NIR en thermos-responsieve kanker gerichte PNIPAM-ppy nanocomposieten

Voor het genereren van thermo-responsieve op PNIPAM gebaseerde nanocomposieten, werden PNIPAM-AAc nanodeeltjes gefabriceerd door een radicale polymerisatiemethode [15]. Om LCST te regelen via NIR-laserbestraling, werd ppy gedekt door een polymerisatiereactie in zoals bereid PNIAPM-AAc. Het op kanker gerichte PNIPAM-ppy-FA werd gesynthetiseerd door FA-PEG-NH₂ chemisch te conjugeren. aan de carboxylgroep in PNIPAM-AAc. Volgens TEM-afbeeldingen in Fig. 1a werden de morfologie, grootte en dispersiteit van PNIPAM-AAc, PNIPAM-ppy en PNIPAM-ppy-FA waargenomen. Zoals bereid vertoonde PNIPAM-AAc de homogene vorm met een gemiddelde diameter van 274,32 ± 11,62 nm. Na decoratie van de ppy vertoonden PNIPAM-ppy en PNIPAM-ppy-FA vergelijkbare maten met 275,99 ± 11,41 en 285,77 ± 17,92 nm. De grootte van met Dox geladen PNIPAM-ppy-FA nam licht toe van 285,77 ± 17,92 tot 290,73 ± 12,28 nm, wat aangeeft dat de geneesmiddelen tegen kanker waren geladen in PNIPAM-ppy-FA nanocomposieten [26]. Interessant is dat, in vergelijking met PNIPAM-AAc, de aanwezigheid van de ppy in PNIPAM-ppy-FA nanocomposieten duidelijk werd vertoond door kleine zwarte vlekken. Bovendien waren PNIPAM-ppy-FA-nanocomposieten vanwege de PEG-keten goed gedispergeerd in een waterige oplossing zonder aggregatie [27]. De gemiddelde hydrodynamische diameters van PNIPAM-AAc, PNIPAM-ppy, PNIPAM-ppy-FA en Dox@PNIPAM-ppy-FA werden gemeten met DLS-analyse (aanvullend bestand 1:Fig. S1). De diameters van PNIPAM-AAc, PNIPAM -ppy, PNIPAM-ppy-FA en Dox@PNIPAM-ppy-FA waren respectievelijk 432, 450,7, 468,6 en 486,7 nm. Door verschillende analytische methoden was de diameter van elke nanocomposiet groter dan die van TEM, maar de deeltjesgrootte en verdeling van PNIPAM-ppy-FA nanocomposieten vertoonden een vergelijkbare trend.

een TEM-afbeeldingen van PNIPAM-AAc, PNIPAM-ppy, PNIPAM-ppy-FA en Dox@PNIPAM-ppy-FA nanocomposieten. b LCST-analyse van Dox@PNIPAM-ppy-FA door DLS. c Gemiddelde diameters van PNIPAM-AAc en Dox@PNIPAM-ppy-FA afhankelijk van verschillende temperatuuromstandigheden (bij 25 °C, 37,5 °C en 50 °C)

Om de invloed van gepolymeriseerd ppy in PNIPAM-AAc te onderzoeken, werden de LCST-waarden van PNIPAM-AAc en Dox@PNIPAM-ppy-FA gemeten bij verschillende temperaturen (figuur 1b). Vergeleken met ons eerdere werk [15] was de LCST van Dox@PNIPAM-ppy-FA iets lager dan die van PNIPAM-AAc (42 °C). Dit verschil kan worden veroorzaakt door de verminderde carboxylgroepen in PNIPAM-AAc als gevolg van gepolymeriseerd ppy en geconjugeerd kankertargeting-ligand [28]. Vervolgens hebben we de verandering van de deeltjesgrootte gevolgd, afhankelijk van de temperatuur in figuur 1c. Hiervoor werden de diameters van PNIPAM-AAc en Dox@PNIPAM-ppy-FA gemeten in het temperatuurbereik van 25 tot 50 °C. Naarmate de temperatuur werd verhoogd, werd PNIPAM-AAc verlaagd van 436 naar 177 nm. Bovendien was de grootte van Dox@PNIPAM-ppy-FA sterk verminderd van 630 tot 420 nm, wat aangeeft dat ppy-versierd in PNIPAM-nanocomposieten geen grote invloed had op toepassingen van gecontroleerde en thermo-responsieve DDS [27].

De zeta-potentiële waarden van PNIPAM-AAc, PNIPAM-ppy, PNIPAM-ppy-FA en Dox@PNIPAM-ppy-FA vertoonden de oppervlakteverandering van nanocomposieten voor en na modificatie (figuur 2a). Het zeta-potentieel van PNIPAM-AAc was -37,1 ±-1,61 mV vanwege de carboxylgroepen in AAc [29]. De waarden van PNIPAM-ppy en PNIPAM-ppy-FA namen toe tot − 29,6 ± 0,96 en − 15,6 ± 0,26 mV, wat aangeeft dat positief geladen polypyrrool en FA-PEG-NH₂ werden met succes geïntroduceerd in PNIPAM-ppy-FA nanocomposieten [27]. Vanwege de negatief geladen Dox veranderde het zeta-potentieel van Dox@PNIPAM-ppy-FA in meer negatieve ladingen (− 28,6 ± 0,23 mV). Zoals getoond in Fig. 2b, werd de succesvolle synthese van PNIPAM-AAc, PNIPAM-ppy en PNIPAM-ppy-FA bevestigd door FT-IR-spectroscopie. Het spectrum van PNIPAM-AAc toonde de uitrekkende trillingspieken van C-N en CH₂ tussen 1100 en 1200 cm⁻¹ en de pieken van C=O, N–H en COOH werden waargenomen bij 1545, 1645 en 1750 cm⁻¹ , die toebehoorde aan PNIPAM-AAc [15]. De polypyrrool in PNIPAM-ppy en PNIPAM-ppy-FA toonde de extra pieken bij 935 en 1050 cm⁻¹ waargenomen [30]. In spectra van PNIPAM-ppy-FA verschenen de nieuwe trillingspieken bij 1107 en 2880 cm⁻¹ , die werd toegeschreven aan C-O-C van de PEG-keten. Dit resultaat duidde op de succesvolle chemische conjugatie van FA-PEG-NH₂ [31]. Het richtende ligand van FA werd echter niet gedetecteerd door FT-IR, omdat de structuur ervan vergelijkbaar was met PEG. Om de aanwezigheid van FA in PNIPAM-nanocomposieten te bevestigen, werden PNIPAM-AAc, PNIPAM-ppy en PNIPAM-ppy-FA uitgevoerd met UV-Vis-spectroscopie (figuur 2c). Terwijl de spectra van PNIPAM-AAc en PNIPAM-ppy (zonder FA) geen absorptiepiek vertoonden, vertoonde PNIPAM-ppy-FA de extra piek bij 280 nm, wat onderscheidend was in FA [32]. Dit resultaat ondersteunde dat FA-moleculen werden geënt op op PNIPAM gebaseerde nanocomposieten.

een Zeta-potentiaalanalyse van PNIPAM-AAc, PNIPAM-ppy, PNIPAM-ppy-FA en Dox@PNIPAM-ppy-FA. b FT-IR-spectra van PNIPAM-AAc, PNIPAM-ppy en PNIPAM-ppy-FA. c UV–Vis-spectra van PNIPAM-AAc, PNIPAM-ppy, PNIPAM-ppy-FA en Dox@PNIPAM-ppy-FA

Fotothermische eigenschap van PNIPAM-ppy-FA nanocomposieten via NIR-laserbestraling

Om op PNIPAM gebaseerde nanocomposieten te gebruiken voor fotothermische therapie, werden de optische eigenschappen van PNIPAM-ppy-FA nanocomposieten onderzocht met UV-Vis-spectroscopie. Zoals weergegeven in figuur 2c, vertoonde PNIPAM-AAc geen enkele absorptie in het NIR-gebied (λ =-700-1000 nm). De spectra van PNIPAM-ppy, PNIPAM-ppy-FA en Dox@PNIPAM-ppy-FA vertoonden echter duidelijk de sterke absorptie in hetzelfde bereik als gevolg van gepolymeriseerde ppy-nanodeeltjes. Deze absorptieresultaten toonden aan dat PNIPAM-ppy-FA nanocomposieten NIR-licht in warmte konden omzetten [26]. Vervolgens evalueerden we de fotothermische eigenschap van PNIPAM-ppy-FA-nanocomposieten door NIR-laserbestraling (figuur 3). Om het fotothermische effect te optimaliseren, werden PNIPAM-FA (zonder pyrrool), PNIPAM-ppy-5-FA (ppy 50 L) en PNIPAM-ppy-10-FA (ppy 100 μL) bereid in dezelfde concentratie (0,1 mg/ml) ) en werden vervolgens blootgesteld aan 808 nm NIR-laserstraling met een dichtheid van 2 W/cm² gedurende 20 min (Fig. 3a). De temperatuur van PNIPAM-ppy-10-FA steeg tot 14,5°C, wat 2 keer hoger was dan die van PNIPAM-ppy-5-FA. Als controle werd PNIPAM-FA zonder ppy bestraald, maar de temperatuur werd verwaarloosbaar verhoogd (2,4 °C). Daarom kozen we PNIPAM-ppy-10-FA om aanvullende fotothermische experimenten te onderzoeken. Om de temperatuurveranderingen door concentraties waar te nemen, werd de NIR-laser bestraald tot PNIPAM-ppy-FA in verschillende concentraties (0,05, 0,1 en 0,2 mg/ml). In figuur 3b liep de temperatuur, afhankelijk van de concentratie, op tot respectievelijk 10, 14,5 en 18 °C. Bovendien werd de PNIPAM-ppy-FA-oplossing (0,1 mg/ml) bestraald met verschillende laservermogensdichtheden (1-3 W/cm² ) in Afb. 3c. Zoals verwacht was de temperatuurstijging van nanocomposiet sterk afhankelijk van het laservermogen. Vervolgens hebben we de fotothermische stabiliteit van PNIPAM-ppy-FA-nanocomposieten waargenomen in figuur 3d. Hoewel NIR-laserbestraling herhaaldelijk ten minste 5 keer werd uitgevoerd, werd de temperatuur gestaag verhoogd tot 33 ° C, wat aantoont dat de PNIPAM-ppy-FA nanocomposiet een geschikte nanodrager was als fotothermische therapie.

Fotothermische prestaties van PNIPAM-ppy-FA nanocomposieten. een Temperatuuranalyse van Dox@PNIPAM-ppy-5-FA en Dox@PNIPAM-ppy-10-FA onder 808 nm NIR-laserbestraling (2 W/cm² ). b Temperatuuranalyse van verschillende concentraties Dox@PNIPAM-ppy-FA onder 808 nm NIR-straling (2 W/cm² ). c Fotothermisch effect van Dox@PNIPAM-ppy-FA met verschillende vermogensdichtheden (1, 2 en 3 W/cm² ). (D) Temperatuurcurve van Dox@PNIPAM-ppy-FA gedurende vijf aan/uit-cycli met NIR-laserbestraling (2 W/cm² )

NIR en thermische responsieve geneesmiddelafgifte van PNIPAM-ppy-FA Nanocomposites

Om de geneesmiddelafgifteprofielen via NIR en thermo-respons te evalueren, hebben we de inkapselings- en afgifte-eigenschappen van Dox@PNIPAM-ppy-FA nanocomposieten geanalyseerd. Aanvankelijk maten we UV-Vis-absorptiespectra van de met geneesmiddel beladen PNIPAM-ppy-FA en er werd een sterke absorptiepiek waargenomen in de buurt van 480 nm (figuur 2c). Dit resultaat gaf aan dat Dox met succes in PNIPAM-ppy-FA nanocomposieten is geladen. De Dox-laadefficiëntie van PNIPAM-ppy-FA-nanocomposieten werd berekend tot 15% met behulp van de Dox-kalibratiecurve (gegevens niet getoond). In Fig. 4a werd het Dox-afgifteprofiel van PNIPAM-ppy-FA bestudeerd bij verschillende temperaturen. We observeerden het Dox-afgiftegedrag gedurende 72 uur bij 25 °C, 37 °C en 50 °C en de cumulatieve afgifte van Dox van PNIPAM-ppy-FA was respectievelijk 15%, 42% en 67%. Aangezien de LCST van PNIPAM-ppy-FA iets afnam tot 42 °C, bleek de cumulatieve afgifte bij lichaamstemperatuur relatief hoger te zijn dan bij kamertemperatuur. Er kwam een grote hoeveelheid Dox vrij, maar de vrijgekomen Dox had geen invloed op de therapeutische efficiëntie, omdat Dox@PNIPAM-ppy-FA-nanocomposieten konden worden geïnternaliseerd in alleen folaatreceptor-positieve cellen, zoals eerder beschreven [26, 32]. Bij een temperatuur hoger dan LCST (50 ° C) werd de hoeveelheid Dox van PNIAPM-ppy-FA-nanocomposieten vier keer hoger afgegeven dan kamertemperatuur, wat suggereert dat PNIPAM-ppy-FA-nanocomposieten kunnen worden gebruikt in een systeem voor gecontroleerde geneesmiddelafgifte door thermische respons. Daarnaast hebben we het door NIR-licht getriggerde afgiftegedrag van PNIPAM-ppy-FA-nanocomposieten in figuur 4b onderzocht. Dox@PNIAPM-ppy-FA-oplossing (1 mg/ml) werd blootgesteld aan NIR-laser (3 W/cm² ) bestraling gedurende 10 minuten en deze bewerking werd elke 1 uur herhaald. Gedurende 6 uur bereikte de totale hoeveelheid Dox via NIR-laserbestraling 35%, terwijl het Dox-afgifteprofiel zonder NIR-laserbestraling ongeveer 5% en 15% (25 ° C en 37 ° C) vertoonde. Dit resultaat toonde aan dat NIR-laserbestraling resulteerde in een hogere temperatuur dan LCST van nanocomposieten en geïnduceerde Dox-afgifte uit de PNIPAM-ppy-FA nanocomposieten.

een Cumulatieve Dox-afgifteprofielen van Dox@PNIPAM-ppy-FA via thermo-respons en b 808 nm NIR-laserbestraling

Cytotoxiciteit en cellulaire opnameanalyse van PNIPAM-ppy-FA-nanocomposieten

Volgens de literatuur is de cytotoxiciteit van PNIPAM-ppy-FA-nanocomposieten onderzocht voor long- en borstkankercellen (Aanvullend bestand 1:Fig. S2) [33, 34]. Ongeacht de monsterconcentraties werden na incubatie met PNIPAM-ppy-FA gedurende 24 uur beide cellevensvatbaarheid waargenomen (> -85%). Daarom vertoonden onze PNIPAM-ppy-FA-nanocomposieten geen cytotoxiciteit als nanodrager voor toepassingen voor medicijnafgifte [35, 36]. Om te onderzoeken of PNIPAM-ppy-FA selectief aan kankercellen kon leveren, onderzochten we de fluorescente signalen van intracellulaire PNIPAM-ppy-FA-nanocomposieten met behulp van confocale laserscanningmicroscopie (aanvullend bestand 1:Fig. S3). Het cellulaire opnamegedrag van de PNIPAM-ppy-FA en Dox@PNIPAM-ppy-FA werd geëvalueerd in folaatreceptor-negatieve (A549) en positieve (MDA-MB-231) cellijnen [37]. Na incubatie van MDA-MB-231 borstkankercellen met Dox@PNIPAM-ppy-FA, werd sterke rode fluorescentie waargenomen, wat aantoont dat Dox@PNIAPM-ppy-FA geïnternaliseerd was in lysosomen van MDA-MB-231-cellen. Wanneer PNIPAM-ppy-FA en Dox@PNIPAM-ppy-FA constant werden behandeld met A549-cellen, werden geen Dox-signalen waargenomen. Deze confocale beelden toonden aan dat PNIAPM-ppy-FA-nanocomposieten selectief kunnen worden geïnternaliseerd in kankercellen die tot overexpressie worden gebracht door folaatreceptoren via een receptor-gemedieerde endocytose-route zoals eerder beschreven [38, 39].

Chemo-fotothermische antikankereffecten van NIR en thermo-responsieve PNIPAM-ppy-FA nanocomposieten

Om de therapeutische werkzaamheid van PNIPAM-ppy-FA-nanocomposieten in vitro te bevestigen, werden de PNIPAM-ppy-FA-nanocomposieten geëvalueerd op MDA-MB-231-cellen met of zonder NIR-laserbestraling en werd de levensvatbaarheid van de cellen geëvalueerd met MTT-assay in Fig. 5a . Voor fotothermische therapie werden de MDA-MB-231 borstkankercellen met PNIPAM-ppy-FA 12 uur geïncubeerd en vervolgens blootgesteld aan NIR-laser (5 W/cm² , 5 minuten). De cellevensvatbaarheid van MDA-MB-231 borstkankercellen nam af tot 70-90%, afhankelijk van de concentraties van PNIPAM-ppy-FA. Om het enige chemotherapeutische effect te bevestigen, werden met Dox geladen PNIPAM-ppy-FA-nanocomposieten behandeld. We zagen dat de levensvatbaarheid afnam tot 50% als gevolg van Dox-afgifte uit nanocomposieten, wat overeenkomt met het afgifteprofiel in Fig. 4. Interessant is dat na NIR-laserbestraling in de MDA-MB-231-cellen met Dox@PNIPAM-ppy-FA nanocomposieten, de de levensvatbaarheid van de cellen nam dramatisch af tot 24%, wat hoger was dan die van controlegroepen (PNIPAM-ppy-FA met NIR-laserbestraling, Dox@PNIPAM-ppy-FA zonder NIR-laserbestraling). Dit resultaat duidde op een optimaal synergie-effect van NIR-laserbestraling-gemedieerde chemo-fotothermische combinatietherapie. Bovendien, om de therapeutische efficiëntie in kankercellen direct te observeren, werd de levend / dood-assay uitgevoerd in Fig. 5b. Als controlegroep observeerden we de levensvatbaarheid van alleen MDA-MB-231-cellen met of zonder NIR-laserbestraling (5 W/cm² , 5 min) en de meeste cellen vertoonden groene fluorescentie (levende cellen). Het toonde aan dat NIR-laserbestraling de levensvatbaarheid van de cellen niet duidelijk beïnvloedde. In addition, the MDA-MB-231 cells with PNIPAM-ppy-FA under NIR laser irradiation showed a few red fluorescence (dead cells), indicating photothermal therapeutic effect caused from PNIPAM-ppy-FA nanocomposites. Despite no NIR laser irradiation in MDA-MB-231 cells with Dox@PNIPAM-ppy-FA, a few sporadic red fluorescence was observed, indicating chemotherapy. Furthermore, when MDA-MB-231 cells were treated with nanocomposites and NIR laser irradiation, the most cancer cells exhibited a few red fluorescence [39, 40]. These results supported the synergistic therapeutic effects of chemo-photothermal therapy via NIR laser irradiation and thermo-responsive Dox@PNIPAM-ppy-FA nanocomposites.

Polyaniline Nanoskein:synthetische methode, karakterisering en Redox-detectie Verbeterde optische absorptie in perovskiet/Si tandem zonnecellen met nanogaten-array

Nanomaterialen

Metaal

Hars

vezel

Samengesteld materiaal