Gerichte NIR-responsieve PNIPAM-pyrrol-nanocomposieten voor synergistische chemo-fotothermale borstkankertherapie

Samenvatting

Combinatietherapie gebaseerd op multifunctionele nanocomposieten wordt beschouwd als een veelbelovende benadering om de kankertherapeutische effectiviteit te verbeteren. Hier rapporteren we gerichte multifunctionele poly(N-isopropylacrylamide) (PNIPAM)-gebaseerde nanocomposieten voor synergistische chemo-fotothermale therapie naar borstkankercellen. Om de overgangstemperatuur te verhogen, werd acrylzuur (AAc) toegevoegd in het synthetisch proces van PNIPAM, wat aantoonde dat de intrinsieke lagere kritische oplossingstemperatuur (LCST) veranderde naar 42 °C. Om het fotothermische effect te genereren onder nabij-infrarood (NIR) laserbestraling (808 nm), werden polypyrrole (ppy) nanopartikels uniform gedecoreerd in PNIPAM-AAc. Foliumzuur (FA), als kanker-targeting-ligand, werd succesvol geconjugeerd op de overbodige carboxylgroepen in PNIPAM-netwerk. De medicijnvrijgave van PNIPAM-ppy-FA nanocomposieten werd efficiënt getriggerd in respons op de temperatuurverandering door NIR-laserbestraling. We bevestigden ook dat PNIPAM-ppy-FA geïternaliseerd werd in MDA-MB-231 borstkankercellen door foliaatreceptor-gemedieerde endocytose en de kankertherapeutische effectiviteit aanzienlijk verbeterde met combinatiebehandeling van chemo-fotothermale effecten. Daarom moedigt ons werk verdere verkenning van multifunctionele nanodrager-agenten aan voor synergistische therapeutische benaderingen voor verschillende typen kankercellen.

Inleiding

Medicijnleveringssysteem (DDS) is een van de krachtige methoden om een farmaceutisch samenstel te administreren om een therapeutisch effect in kankertherapie te bereiken. Hoewel het doel van DDS is om het actieve medicijn te leveren en op te hopen in het gewenste gebied, wordt het conventionele DDS vaak vergezeld door ernstige bijwerkingen en inefficiënte therapeutische efficiëntie. Om deze obstakels te overwinnen, zijn diverse nanodragers ontwikkeld die de capaciteit hebben om te reageren op specifieke interne of externe stimuli inclusief temperatuur, licht, pH, elektrisch veld, oxidatie-reductie, enzymactiviteit en antigeenconcentratie, voor geavanceerde DDS en gebruikt om continue en gecontroleerde medicijnvrijgave te induceren.

Eén van de diverse stimuli, de thermo-responsieve nanodrager is een krachtige benadering om kankerbehandeling te verbeteren, omdat medicijnen in nanopartikels kunnen worden vrijgegeven bij een bepaalde temperatuur. Bovendien kan het voordeel van thermo-gevoelige nanopartikels gecombineerd worden met andere stimuli om complete kankeruitroeiing te induceren. Als thermo-responsieve nanopartikels, heeft poly(N-isopropylacrylamide) (PNIPAM) de meeste aandacht gekregen, omdat het een faseovergang vertoont bij een lagere kritische oplossingstemperatuur (LCST) van ongeveer 32 °C. Onder de LCST bestaat het hele polymere netwerk in PNIPAM in een gezwollen toestand door de waterstofbindingen. Aan de andere kant, PNIPAM gaat over in de hydrofobe toestand en waterstofbindingen worden verminderd, wat resulteert in een instorting van het polymere netwerk boven de LCST. Vergeleken met andere nanopartikels, heeft PNIPAM-gebaseerde nanodrager het voordeel van hoge medicijnencapsulatie-efficiëntie, gecontroleerde medicijnvrijgave-capaciteit en goede biocompatibiliteit. Echter, door de spontane medicijnvrijgave bij lichaamstemperatuur, is PNIPAM-gebaseerde nanodrager niet voldoende om in geavanceerde DDS te gebruiken. Om dit te overwinnen, voegden eerdere studies organische zuren (bijv. vinylazijnzuur, acrylzuur, en allylazijnzuur) toe in het synthetisch proces van PNIPAM, wat resulteerde in verminderde bijwerkingen door continue medicijnvrijgave.

Recentelijk hebben diverse studies gefocust op nieuwe therapeutische benaderingen waarbij de integratie van twee of meer stimuli-getriggerde nanopartikels voor verbeterde kankertherapeutische effectiviteit. Bijvoorbeeld, fotothermale therapie (PTT) vertoont diverse voordelen, zoals nauwkeurige lichtcontrole op tumoren, non-invasieve penetratie en lage toxiciteit voor normale cellen. Om de nanopartikels met PTT te combineren, moeten de fotothermale agenten (bijv. gouden nanostaven, koolstofnanobuizen, polypyrrole (ppy), en grafene-oxide) uniform geencapsuleerd worden in PNIPAM-gebaseerde nanopartikels. De eerdere studie fabriceren de mesoporeuze silica-gecoate gouden nanostaven met een thermo- en pH-responsieve PNIPAM-schil en verder verkend in vivo kankertherapie-toepassingen. Echter, deze PNIPAM-gebaseerde nanocomposieten vereisen een multi-stap synthetisch proces. Bovendien, aangezien nanocomposieten geen targeting-moiety hadden tegen specifieke kankercellen, kon dit ernstige bijwerkingen veroorzaken aan andere organen of normale weefsels. In ons eerdere rapport hebben we een bidirectioneel gecontroleerd vrijgavesysteem ontwikkeld met behulp van de thermo- en pH-gevoelige eigenschappen van PNIPAM. PNIPAM-nanogels werden gecopolymeriseerd met acrylzuur (AAc) inhoud voor efficiënte controle van LCST. Om kanker-targeting en therapeutische effectiviteit beter te verbeteren, hebben we de kanker-targeting combinatietherapie ontwikkeld met chemo- en fotothermisch effect (Schema 1). Als de temperatuur stijgt door NIR-laserbestraling, werden de medicijnen van thermo-responsieve PNIPAM-nanocomposieten vrijgegeven en het fotothermische effect werd vervolgens geactiveerd. Vanwege de geconjugeerde foliumzuur (FA), vertoonden PNIPAM-gebaseerde nanocomposieten aanzienlijk verbeterde therapeutische effectiviteit richting MDA-MB-231 borstkankercellen.

Materialen en methoden

Materialen

NIPAM, N,N′-methylenebisacrylamide (MBA), kaliumpersulfaat (KPS, 99%), N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC) en N-Hydroxysuccinimide (NHS) werden gekocht bij Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, VS). Polyvinylpyrrolidone (PVP) en pyrrol (98%) werden verkregen van Alfa Aesar (Ward Hill, MA, VS). AAc werd gekocht bij Dae Jung Chemicals & Materials. Co. Ltd (Korea). FA-PEG-amines (FA-PEG-NH₂, MW: 5 kDa) werd geleverd door Nanocs, Inc. (New York, NY, VS). Doxorubicine hydrochloride (Dox) werd verkregen van Tokyo Chemical Industry. Co. Ltd (Tokyo, Japan). Alle chemicaliën en materialen werden commercieel gebruikt zonder verdere zuivering.

Synthese van ppy-gedecoreerde PNIPAM-AAc nanopartikels

De thermo-responsieve PNIPAM gecopolymeriseerd met AAc nanopartikels werd gesynthetiseerd volgens eerdere rapportage. 1,13 g NIPAM-monomer, 0,077 g MBA en 0,136 g AAc werden opgelost in 100 mL gedemineraliseerd water en toegevoegd in een 250-mL drie-hals ronde-bodem fles. Na 30 min werd de reactietemperatuur verhoogd tot 80 °C en vigor roeren gedurende 1 uur. Om polymerisatie te induceren, werd KPS (1,5 mg) toegevoegd aan het mengsel, gevolgd door roeren gedurende 4 uur. Het mengsel werd gedialyseerd tegen een molecuulgewichtsafsnijpunt (MWCO) 12–14 kDa dialysemembraan in gedemineraliseerd water gedurende 7 dagen om ongereageerde monomer, initiator, dispenseerbare ionen te verwijderen en PNIPAM-AAc nanopartikels werden verkregen door vriesdrogen gedurende 48 uur. Om het fotothermische effect te functionaliseren, werd ppy gedecoreerd in PNIPAM-AAc nanopartikels. PVP (50 en 100 mg) en pyrrol-monomer (50 en 100 µL) werden snel toegevoegd in 10 mg/mL PNIPAM-AAc oplossing en werden 12 uur bij kamertemperatuur gerold. Toen werd KPS (3,4 mg) in de PNIPAM-AAc oplossing geïnserteerd en additioneel 14 uur gerold. De ppy-gedecoreerde PNIPAM-AAc werd drie keer gecentrifugeerd met gedestilleerd water. PNIPAM-ppy-5 en PNIPAM-ppy-10 werden verkregen door vriesdrogen gedurende 48 uur.

Synthese van kanker-getargete PNIPAM-ppy nanocomposieten

Om kanker-getargete PNIPAM-ppy nanocomposieten (PNIPAM-ppy-FA) te verkrijgen, werd 10 mg PNIPAM-ppy opgelost in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS, 10 mL, pH 5,5) en 5 min ultrasonisch behandeld. EDC (15 mg, 0,078 mmol) en NHS (15 mg, 0,13 mmol) werden toegevoegd aan de PNIPAM-ppy oplossing. Na 1 uur werd FA-PEG-NH₂ (5 mg) toegevoegd en additioneel overnacht gerold. Ongereageerde FA-PEG-NH₂, EDC en NHS in PNIPAM-ppy oplossing werden verwijderd door een dialysemembraan (MWCO 6–8 kDa) en PNIPAM-ppy-FA nanocomposieten werden vriesgedroogd gedurende 48 uur.

Synthese van antikanker-medicijn-geladen PNIPAM-ppy-FA nanocomposieten

10 mg PNIPAM-ppy-FA werd opgelost in gedemineraliseerd water en 5 min ultrasonisch behandeld. 0,5 mg/mL Dox werd in druppels toegevoegd aan PNIPAM-ppy-FA oplossing, vigor roerend bij kamertemperatuur. On-geladen Dox werd verwijderd door centrifugatie (14.000 rpm, 10 min) en gezuiverd met gedemineraliseerd water. Dox-geladen PNIPAM-ppy-FA (Dox@PNIPAM-ppy-FA) werd verkregen door vriesdrogen gedurende 48 uur.

Karakterisatie van NIR en thermo-responsieve PNIPAM-ppy-FA nanocomposieten

Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM, JEOL-2100F, JEOL, Japan) werd gebruikt om de grootte, morfologie en distributie van PNIPAM-ppy-FA nanocomposieten te karakteriseren. Voor TEM-meting werden monsters voorbereid door een druppel van de monsteroplossing in gedemineraliseerd water (concentratie: 1 g/L) op een 200-mesh koperen rooster gecoate met koolstof te plaatsen. De grootteverdeling en oppervlaktelading van PNIPAM-ppy-FA nanocomposieten, die in gedemineraliseerd water waren opgelost en 5 min ultrasonisch behandeld, werden gemeten met behulp van een Zetasizer Nano Z (Malvern Instruments, VK). De oppervlaktemodificatie en chemische binding van PNIPAM-ppy-FA nanocomposieten werden bevestigd door Fourier-transformatie-infraroodspectroscopie (FT-IR). FT-IR-spectra werden opgenomen op de KBr-pellets door gebruik te maken van een Nicolet iS50 instrument (Thermo Fisher Scientific, Inc., VS) in het bereik van 400–4000 cm⁻¹ bij een resolutie van 4 cm⁻¹. De optische eigenschap en Dox-ladingscapaciteit in PNIPAM-ppy-FA nanocomposieten werden waargenomen door UV-Vis-spectroscopie (UV 1800, Shimazu, Japan).

Fotothermische eigenschap en fotostabiliteit van NIR en thermo-responsieve PNIPAM-ppy-FA nanocomposieten

De fotothermische eigenschap van Dox-geladen PNIPAM-ppy-FA nanocomposieten (Dox@PNIPAM-ppy-FA) werd geëvalueerd door real-time detectie van temperatuurveranderingen. Dox@PNIPAM-ppy-FA werd opgelost in waterige oplossing met verschillende concentraties van 0,05, 0,1 en 0,2 mg/mL en werd 20 min bestraald met een 808 nm NIR-laser (MDL-N-808, CNI Optoelectronics Tech. Co. Ltd., China) bij een vermogensdichtheid van 2 W/cm². De invloed van NIR-laser-vermogensdichtheid werd bestudeerd door bestraling van NIR-laser gedurende 20 min met een vermogensdichtheid van 1, 2 en 3 W/cm², respectievelijk. Verder, om fotothermische stabiliteit tegen NIR-laser te onderzoeken, werd Dox@PNIPAM-ppy-FA oplossing (0,1 mg/mL) 15 min blootgesteld en daarna natuurlijk afkoelproces voor vijf keer. Tijdens NIR-laserbestraling werd de temperatuur van Dox@PNIPAM-ppy-FA oplossing gemeten door een thermokoppeling gekoppeld aan een digitale thermometer (DTM-318, Tecpel Co., Taiwan) elke 60 s gedurende 15 min.

NIR en thermo-responsieve medicijnvrijgave van PNIPAM-ppy-FA nanocomposieten

Om de vrijgaveprofielen van Dox via thermo-respons te bestuderen, werden Dox@PNIPAM-ppy-FA oplossingen (1 mg/mL) voorbereid in 5 mL flesjes en vervolgens gerold bij 25, 37 en 50 °C. Op een gedefinieerde vrijgavetijd (0–72 uur), werd het supernatanten van elk monster verzameld door centrifugatie en vervangen door een gelijk volume van vers medium. De hoeveelheid Dox vrijgegeven van PNIPAM-ppy-FA nanocomposieten werd geschat door meting van UV-Vis-spectroscopie bij 480 nm. Bovendien werd Dox-vrijgavegedrag via NIR-laser-stimuli-gerespondeerd Dox@PNIPAM-ppy-FA oplossing (1 mg/mL) vigor gerold bij 37 °C en bestraald gedurende 10 min op vooraf bepaalde tijdstippen (1, 2, 3, 4 en 5 uur). Als controle werd Dox@PNIPAM-ppy-FA oplossing zonder NIR-laserbestraling gebruikt. De vrijgegeven Dox werd bepaald door bovengenoemde methode.

Cytotoxiciteitsanalyse van PNIPAM-ppy-FA nanocomposieten

De cytotoxiciteit van de PNIPAM-ppy-FA nanocomposieten inclusief PNIPAM-ppy-FA en Dox@PNIPAM-ppy-FA werd geverifieerd door gebruik te maken van MTT-assay. A549 en MDA-MB-231 cellen werden gezaaid in 96-putplaten bij een dichtheid van 1 × 10⁴ cellen per put in 200 µL RPMI 1640 medium bevattende 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine en geïncubeerd bij 37 °C onder een vochtige atmosfeer met 5% CO₂. Na 1 dag werd 200 µL PNIPAM-ppy-FA nanocomposieten met verschillende concentraties (20–100 µL) behandeld aan elke cel en de plaat werd 24 uur geïncubeerd. De cellen werden gewassen met DPBS en het medium werd vervolgens vervangen door vers medium met MTT-agent (0,5 mg/mL). Na nog een incubatie van 4 uur werd het medium voorzichtig verwijderd en 200 µL DMSO toegevoegd aan elke put om de geïternaliseerde paarse formazan-kristallen op te lossen. De absorbantie werd gemeten bij 595 nm met een iMark™ microplaat-lezer (Bio-rad, Hercules, CA, VS).

Cellulaire opname-analyse van PNIPAM-ppy-FA nanocomposieten

Om de targeting-capaciteit naar specifieke kankercellen van PNIPAM-ppy-FA nanocomposieten te evalueren, werden A549 en MDA-MB-231 cellen gezaaid in een 8-put plaat (ibidi, München, Duitsland) bij een dichtheid van 2 × 10⁴ cellen/mL en 24 uur geïncubeerd. De cellen werden vervolgens geïncubeerd met PNIPAM-ppy-FA nanocomposieten (60 µg/mL) gedurende 6 uur. Vervolgens werden de cellen tweemaal gewassen met DPBS om de overgebleven nanocomposieten te verwijderen en vastgezet met 4% paraformaledehyde gedurende 15 min. Na behandeling van 0,1% Triton-X gedurende 15 min bij kamertemperatuur, werden de cellen uiteindelijk gekleurd door Alexa Fluor 488 phalloidine (1:200, Invitrogen, VS) gedurende 1 dag bij 4 °C en 4,6-diamidino-2-fenylindole (DAPI, Thermo Fisher Scientific, VS) gedurende 10 min, respectievelijk. De cellulaire opnamebeelden werden waargenomen door gebruik te maken van een confocal laser scanning microscopie (CLSM, LSM 710, Carl Zeiss, Duitsland).

Verbeterde antikanker-effecten van PNIPAM-ppy-FA nanocomposieten via NIR-laserbestraling

De verbeterde therapeutische effectiviteit met behulp van NIR- en thermo-responsieve PNIPAM-ppy-FA op borstkankercellen werd onderzocht door MTT-assay. MDA-MB-231 (1 × 10⁴ cellen/mL) werden gezaaid op 96-putplaten en 24 uur geïncubeerd. De cellen werden vervolgens gewassen met DPBS en PNIPAM-ppy-FA en Dox@PNIPAM-ppy-FA nanocomposieten bij verschillende concentraties (20, 40, 60, 80 en 100 µg/mL) werden toegevoegd aan elke put in een concentratie-afhankelijke manier. Na incubatie overnacht, werd het medium verwijderd, gevolgd door de toevoeging van vers medium. Voor de NIR-laserbestralingsgroepen, werden de cellen behandeld met 5 W/cm² gedurende 5 min. Toen werden MDA-MB-231 gewassen met DPBS en het vers medium inclusief MTT-oplossing toegevoegd. Na 4 uur werd het medium voorzichtig verwijderd en 200 µL DMSO toegevoegd aan elke put. Tenslotte werd de absorbantie bij 595 nm gemeten door een iMark™ microplaat-lezer om de cellevensvatbaarheid te bepalen. Als een andere methode voor observatie van kankertherapeutische effecten, werd de live/dead-assay uitgevoerd. PNIPAM-ppy-FA en Dox@PNIPAM-ppy-FA (60 µg/mL) werden behandeld in MDA-MB-231. Na 24 uur werden MDA-MB-231 blootgesteld met of zonder NIR-laserbestraling (5 W/cm², 5 min) en gekleurd met calceïne AM en ethidium-homodimer-1. Na 30 min werden de cellen diverse keren gewassen met DPBS. De live/dode beelden werden verkregen door gebruik te maken van geïnverteerde fluoresentiemicroscopie (Olympus Ix73, Japan).

Resultaten en discussie

Synthese en karakterisatie van NIR en thermos-responsieve kanker-getargete PNIPAM-ppy nanocomposieten

Voor de generatie van thermo-responsieve PNIPAM-gebaseerde nanocomposieten, werden PNIPAM-AAc nanopartikels gefabriceerd door een radicaal-polymerisatiemethode. Om LCST via NIR-laserbestraling te controleren, werd ppy bedekt door polymerisatiereactie in as-geprepareerde PNIPAM-AAc. De kanker-getargete PNIPAM-ppy-FA werd gesynthetiseerd door chemisch conjugeren van FA-PEG-NH₂ aan de carboxylgroep in PNIPAM-AAc. Volgens TEM-beelden in Fig. 1a, werden de morfologie, grootte en dispersiteit van PNIPAM-AAc, PNIPAM-ppy en PNIPAM-ppy-FA waargenomen. As-geprepareerde PNIPAM-AAc vertoonde de homogene vorm met een gemiddelde diameter van 274,32 ± 11,62 nm. Na decoratie van de ppy, toonden PNIPAM-ppy en PNIPAM-ppy-FA vergelijkbare groottes met 275,99 ± 11,41 en 285,77 ± 17,92 nm. De grootte van Dox-geladen PNIPAM-ppy-FA nam licht toe van 285,77 ± 17,92 naar 290,73 ± 12,28 nm, wat aangeeft dat de antikanker-medicijnen geladen waren in PNIPAM-ppy-FA nanocomposieten. Interessant, vergeleken met PNIPAM-AAc, was de aanwezigheid van de ppy binnen PNIPAM-ppy-FA nanocomposieten duidelijk getoond door kleine zwarte vlekken. Bovendien, door de PEG-keten, waren PNIPAM-ppy-FA nanocomposieten goed gedispergeerd in waterige oplossing zonder aggregatie. De gemiddelde hydrodynamische diameters van PNIPAM-AAc, PNIPAM-ppy, PNIPAM-ppy-FA, en Dox@PNIPAM-ppy-FA werden gemeten door DLS-analyse (Additioneel bestand 1: Fig. S1). De diameters van PNIPAM-AAc, PNIPAM-ppy, PNIPAM-ppy-FA, en Dox@PNIPAM-ppy-FA waren 432, 450,7, 468,6, en 486,7 nm, respectievelijk. Vanwege verschillende analytische methoden was de diameter van elk nanocomposiet groter dan die van TEM, maar de deeltjesgrootte en distributie van PNIPAM-ppy-FA nanocomposieten vertoonden een vergelijkbare trend.

Om de invloed van gepolymeriseerde ppy in PNIPAM-AAc te onderzoeken, werden de LCST-waarden van PNIPAM-AAc en Dox@PNIPAM-ppy-FA gemeten bij verschillende temperaturen (Fig. 1b). Vergeleken met ons eerdere werk, was de LCST van Dox@PNIPAM-ppy-FA lichtjes verlaagd ten opzichte van die van PNIPAM-AAc (42 °C). Dit verschil kan veroorzaakt zijn door de gereduceerde carboxylgroepen in PNIPAM-AAc ten gevolge van gepolymeriseerde ppy en geconjugeerde kanker-targeting-ligand. Vervolgens monitoren we de verandering van deeltjesgrootte afhankelijk van de temperatuur in Fig. 1c. Hiervoor werden de diameters van PNIPAM-AAc en Dox@PNIPAM-ppy-FA gemeten in het temperatuurbereik van 25 tot 50 °C. Toen de temperatuur toename, nam PNIPAM-AAc af van 436 naar 177 nm. Bovendien werd de grootte van Dox@PNIPAM-ppy-FA aanzienlijk verminderd van 630 naar 420 nm, wat aangeeft dat ppy-gedecoreerd in PNIPAM-nanocomposieten niet hoog beïnvloedde voor toepassingen van gecontroleerde en thermo-responsieve DDS.

De zeta-potentiaalwaarden van PNIPAM-AAc, PNIPAM-ppy, PNIPAM-ppy-FA, en Dox@PNIPAM-ppy-FA toonden de oppervlakteverandering van nanocomposieten voor en na modificatie (Fig. 2a). De zeta-potentiaal van PNIPAM-AAc was −37,1 ± 1,61 mV door de carboxylgroepen in AAc. De waarden van PNIPAM-ppy en PNIPAM-ppy-FA steeg naar −29,6 ± 0,96 en −15,6 ± 0,26 mV, wat aangeeft dat positief geladen polypyrrole en FA-PEG-NH₂ succesvol geïntroduceerd waren in PNIPAM-ppy-FA nanocomposieten. Vanwege de negatief geladen Dox, veranderde zeta-potentiaal van Dox@PNIPAM-ppy-FA naar meer negatieve lading (−28,6 ± 0,23 mV). Zoals getoond in Fig. 2b, werd de succesvolle synthese van PNIPAM-AAc, PNIPAM-ppy, en PNIPAM-ppy-FA bevestigd door FT-IR-spectroscopie. Het spectrum van PNIPAM-AAc toonde de rekkingstrillingspieken van C-N en CH₂ tussen 1100 en 1200 cm⁻¹ en de pieken van C=O, N–H en COOH werden waargenomen bij 1545, 1645 en 1750 cm⁻¹, wat toehoorde aan PNIPAM-AAc. De polypyrrole in PNIPAM-ppy en PNIPAM-ppy-FA demonstreerde de additionele pieken bij 935 en 1050 cm⁻¹ werden waargenomen. In spectra van PNIPAM-ppy-FA verschenen de nieuwe trillingspieken bij 1107 en 2880 cm⁻¹, wat toegeschreven werd aan C–O–C van PEG-keten. Dit resultaat gaf de succesvolle chemische conjugatie van FA-PEG-NH₂ aan. Echter, de targeting-ligand van FA werd niet gedetecteerd door FT-IR, omdat de structuur vergelijkbaar was met PEG. Om de aanwezigheid van FA in PNIPAM-nanocomposieten te bevestigen, werden PNIPAM-AAc, PNIPAM-ppy, en PNIPAM-ppy-FA uitgevoerd door UV-Vis-spectroscopie (Fig. 2c). Terwijl de spectra van PNIPAM-AAc en PNIPAM-ppy (zonder FA) geen absorptiepiek toonden, toonde PNIPAM-ppy-FA de additionele piek bij 280 nm, wat distinctief was in FA. Dit resultaat ondersteunde dat FA-moleculen gegraft waren op PNIPAM-gebaseerde nanocomposieten.

Fotothermische eigenschap van PNIPAM-ppy-FA nanocomposieten via NIR-laserbestraling

Om PNIPAM-gebaseerde nanocomposieten voor fotothermale therapie te gebruiken, werd de optische eigenschap van PNIPAM-ppy-FA nanocomposieten onderzocht door UV-Vis-spectroscopie. Zoals getoond in Fig. 2c, toonde PNIPAM-AAc geen absorptie in NIR-regio (λ = 700–1000 nm). Echter, de spectra van PNIPAM-ppy, PNIPAM-ppy-FA, en Dox@PNIPAM-ppy-FA toonden duidelijk de sterke absorptie in hetzelfde bereik door gepolymeriseerde ppy-nanopartikels. Deze absorptieresultaten demonstreerden dat PNIPAM-ppy-FA nanocomposieten NIR-licht konden converteren in warmte. Vervolgens evalueerden we de fotothermische eigenschap van PNIPAM-ppy-FA nanocomposieten door NIR-laserbestraling (Fig. 3). Om het fotothermische effect te optimaliseren, werden PNIPAM-FA (zonder pyrrol), PNIPAM-ppy-5-FA (ppy 50 µL), en PNIPAM-ppy-10-FA (ppy 100 µL) voorbereid bij dezelfde concentratie (0,1 mg/mL) en vervolgens blootgesteld aan 808 nm NIR-laserbestraling bij een dichtheid van 2 W/cm² gedurende 20 min (Fig. 3a). De temperatuur van PNIPAM-ppy-10-FA steeg tot 14,5 °C, wat 2 keer hoger was dan die van PNIPAM-ppy-5-FA. Als controle werd PNIPAM-FA zonder ppy bestraald, maar de temperatuur was verwaarloosbaar toegenomen (2,4 °C). Daarom kozen we PNIPAM-ppy-10-FA om additionele fotothermische experimenten te onderzoeken. Om de temperatuurveranderingen door concentraties te observeren, werd NIR-laser bestraald op PNIPAM-ppy-FA bij verschillende concentraties (0,05, 0,1 en 0,2 mg/mL). In Fig. 3b, afhankelijk van de concentratie, steeg de temperatuur tot 10, 14,5 en 18 °C, respectievelijk. Verder werd PNIPAM-ppy-FA oplossing (0,1 mg/mL) bestraald met diverse laser-vermogensdichtheden (1–3 W/cm²) in Fig. 3c. Zoals verwacht, was de temperatuurstijging van nanocomposiet hoogst afhankelijk van de laservermogen. Vervolgens observeerden we de fotothermische stabiliteit van PNIPAM-ppy-FA nanocomposieten in Fig. 3d. Hoewel NIR-laserbestraling herhaaldelijk werd uitgevoerd ten minste 5 keer, steeg de temperatuur stabiel tot 33 °C, wat aantoont dat PNIPAM-ppy-FA nanocomposiet een geschikte nanodrager was als fotothermale therapie.

NIR en thermische responsieve medicijnvrijgave van PNIPAM-ppy-FA nanocomposieten

Om de medicijnvrijgaveprofielen via NIR en thermo-respons te evalueren, analyseerden we de encapsulatie- en vrijgave-eigenschappen van Dox@PNIPAM-ppy-FA nanocomposieten. Initieel meetten we UV-Vis-absorptiespectra van de medicijn-geladen PNIPAM-ppy-FA en een sterke absorptiepiek werd waargenomen bij 480 nm (Fig. 2c). Dit resultaat gaf aan dat Dox succesvol geladen was in PNIPAM-ppy-FA nanocomposieten. De Dox-ladingsefficiëntie van PNIPAM-ppy-FA nanocomposieten werd berekend op 15% met behulp van Dox-kalibratiecurve (data niet getoond). In Fig. 4a werd Dox-vrijgaveprofiel van PNIPAM-ppy-FA bestudeerd bij verschillende temperaturen. We observeerden Dox-vrijgavegedrag gedurende 72 uur bij 25 °C, 37 °C en 50 °C en de cumulatieve vrijgave van Dox van PNIPAM-ppy-FA waren respectievelijk 15%, 42% en 67%. Aangezien LCST van PNIPAM-ppy-FA lichtjes daalde naar 42 °C, werd de cumulatieve vrijgave bij lichaamstemperatuur relatief hoger gevonden dan bij kamertemperatuur. Een grote hoeveelheid Dox werd vrijgegeven, echter, de vrijgegeven Dox beïnvloedde de therapeutische efficiëntie niet, omdat Dox@PNIPAM-ppy-FA nanocomposieten geïternaliseerd konden worden in alleen foliaatreceptor-positieve cellen, zoals eerder beschreven. Boven LCST (50 °C) werd de hoeveelheid Dox van PNIPAM-ppy-FA nanocomposieten vier keer hoger vrijgegeven dan bij kamertemperatuur, wat suggereert dat PNIPAM-ppy-FA nanocomposieten gebruikt kunnen worden in gecontroleerd medicijnvrijgavesysteem door thermische respons. Bovendien onderzochten we de NIR-licht-getriggerde vrijgavegedrag van PNIPAM-ppy-FA nanocomposieten in Fig. 4b. Dox@PNIPAM-ppy-FA oplossing (1 mg/mL) werd blootgesteld aan NIR-laser (3 W/cm²) bestraling gedurende 10 min en deze operatie werd elke 1 uur herhaald. Gedurende 6 uur bereikte de totale hoeveelheid Dox via NIR-laserbestraling 35%, terwijl het Dox-vrijgaveprofiel zonder NIR-laserbestraling ongeveer 5% en 15% (25 °C en 37 °C) toonde. Dit resultaat toonde aan dat NIR-laserbestraling resulteerde in een hogere temperatuur dan LCST van nanocomposieten en Dox-vrijgave induceerde van PNIPAM-ppy-FA nanocomposieten.

Cytotoxiciteit en cellulaire opname-analyse van PNIPAM-ppy-FA nanocomposieten

Volgens literatuur werd de cytotoxiciteit van PNIPAM-ppy-FA nanocomposieten onderzocht richting long- en borstkankercellen (Additioneel bestand 1: Fig. S2). Ongeacht monsterconcentraties, na incubatie met PNIPAM-ppy-FA gedurende 24 uur, werden beide cellevensvatbaarheden waargenomen (> 85%). Daarom toonden onze PNIPAM-ppy-FA nanocomposieten geen cytotoxiciteit als nanodrager voor medicijnleveringstoepassingen. Om te onderzoeken of PNIPAM-ppy-FA selectief kan leveren aan kankercellen, onderzochten we de fluoresente signalen van intracellulaire PNIPAM-ppy-FA nanocomposieten met behulp van confocal laser scanning microscopie (Additioneel bestand 1: Fig. S3). De cellulaire opnamegedragingen van PNIPAM-ppy-FA en Dox@PNIPAM-ppy-FA werden geëvalueerd in foliaatreceptor-negatieve (A549) en positieve (MDA-MB-231) cellijnen. Na incuberen van MDA-MB-231 borstkankercellen met Dox@PNIPAM-ppy-FA, werd sterke rode fluoresentie waargenomen, wat aantoont dat Dox@PNIPAM-ppy-FA geïternaliseerd werden in lysosomen van MDA-MB-231 cellen. In contrast, toen PNIPAM-ppy-FA en Dox@PNIPAM-ppy-FA behandeld werden met A549 cellen, werden Dox-signalen niet waargenomen. Deze confocale beelden demonstreerden dat PNIPAM-ppy-FA nanocomposieten selectief geïternaliseerd konden worden in foliaatreceptor-overexprimerende kankercellen via receptor-gemedieerde endocytose-route zoals eerder beschreven.

Chemo-fotothermale antikanker-effecten van NIR en thermo-responsieve PNIPAM-ppy-FA nanocomposieten

Om de in vitro combinatietherapeutische effectiviteit van PNIPAM-ppy-FA nanocomposieten te bevestigen, werden PNIPAM-ppy-FA nanocomposieten geëvalueerd op MDA-MB-231 cellen met of zonder NIR-laserbestraling en de cellevensvatbaarheden werden geëvalueerd door MTT-assay in Fig. 5a. Voor fotothermale therapie, werden MDA-MB-231 borstkankercellen met PNIPAM-ppy-FA geïncubeerd gedurende 12 uur en vervolgens blootgesteld aan NIR-laser (5 W/cm², 5 min). De cellevensvatbaarheid van MDA-MB-231 borstkankercellen daalde tot 70–90% afhankelijk van de concentraties van PNIPAM-ppy-FA. Om alleen het chemotherapeutische effect te bevestigen, werden Dox-geladen PNIPAM-ppy-FA nanocomposieten behandeld. We observeerden dat de levensvatbaarheden afnamen tot 50% door Dox-vrijgave van nanocomposieten, overeenkomstig vrijgaveprofiel in Fig. 4. Interessant, na NIR-laserbestraling in MDA-MB-231 cellen met Dox@PNIPAM-ppy-FA nanocomposieten, daalde de cellevensvatbaarheid dramatisch tot 24%, wat hoger was dan die van controle-groepen (PNIPAM-ppy-FA met NIR-laserbestraling, Dox@PNIPAM-ppy-FA zonder NIR-laserbestraling). Dit resultaat wijst op een optimaal synergie-effect van NIR-laserbestraling-gemediëerde chemo-fotothermale combinatietherapie. Bovendien, om de therapeutische efficiëntie in kankercellen direct te observeren, werd de live/dode assay uitgevoerd in Fig. 5b. Als controle-groep observeerden we de levensvatbaarheid van alleen MDA-MB-231 cellen met of zonder NIR-laserbestraling (5 W/cm², 5 min) en de meeste cellen toonden groene fluoresentie (levende cellen). Het demonstreerde dat NIR-laserbestraling de cellevensvatbaarheid niet duidelijk beïnvloedde. Bovendien toonden MDA-MB-231 cellen met PNIPAM-ppy-FA onder NIR-laserbestraling een paar rode fluoresentie (dode cellen), wat aangeeft op fotothermisch therapeutisch effect veroorzaakt door PNIPAM-ppy-FA nanocomposieten. Ondanks geen NIR-laserbestraling in MDA-MB-231 cellen met Dox@PNIPAM-ppy-FA, werd een paar sporadische rode fluoresentie waargenomen, wat chemotherapie aangeeft. Verder, toen MDA-MB-231 cellen behandeld werden met nanocomposieten en NIR-laserbestraling, vertoonden de meeste kankercellen een paar rode fluoresentie. Deze resultaten ondersteunden de synergistische therapeutische effecten van chemo-fotothermale therapie via NIR-laserbestraling en thermo-responsieve Dox@PNIPAM-ppy-FA nanocomposieten.

Conclusie

We hebben succesvol een kanker-getargete NIR- en thermo-responsieve PNIPAM-ppy-FA nanocomposieten geconstrueerd voor chemo-fotothermale combinatietherapie. Om de gecontroleerde vrijgave en fotothermisch effect via 808 nm NIR-laserbestraling te induceren, werden ppy-nanopartikels uniform gedecoreerd op PNIPAM-AAc door polymerisatiemethode. Dox-geladen PNIPAM-ppy-FA toonde significant fotothermisch effect en fotostabiliteit. Bovendien vertoonde Dox@PNIPAM-ppy-FA gunstige eigenschappen van thermo-gevoelige overgang bij verschillende condities en de medicijnvrijgave van PNIPAM-ppy-FA nanocomposieten kon gecontroleerd worden door NIR-licht en thermo-respons. In vitro studies verifieerden dat PNIPAM-ppy-FA nanocomposieten uitstekende biocompatibiliteit en verbeterde therapeutische effectiviteit richting borstkankercellen toonden. Deze verbeterde antikanker-effectiviteit via nanocomposieten werd bijgedragen aan de volgende redenen: (1) specifieke cellulaire opname van nanocomposieten in foliaatreceptor-gemedieerde endocytose, (2) geaccumulere Dox-vrijgave van PNIPAM-ppy-FA via NIR- en thermo-respons, en (3) synergistisch therapeutisch effect door chemo-fotothermale combinatie. Daarom kan ons PNIPAM-ppy-FA nanocomposiet potentiël gebruikt worden als een multifunctionele nanodrager voor synergistische therapeutische benaderingen richting verschillende typen kankers met verminderde bijwerking.

Beschikbaarheid van data en materialen

De data en de analyse in het huidige werk zijn beschikbaar bij de corresponderende auteurs op redelijke aanvraag.

Afkortingen

PTT:

Fotothermale therapie

NIR:

Nabij-infrarood

FA:

Foliumzuur

FA-PEG-NH₂:

FA-PEG-amine

LCST:

Lagere kritische oplossingstemperatuur

PNIPAM:

Poly(N-isopropylacrylamide)

ppy:

Polypyrrole

TEM:

Transmissiemicroscopie

UV-Vis:

Ultraviolet-zichtbare spectroscopie