Antistof-Functioneleerde Silica-Gecoate Goud Nanostaven voor Snelle Diagnose en Fotothermische Behandeling van Cryptococcus neoformans

Samenvatting

Achtergrond

Cryptococcus neoformans is een geencapsuleerde gist. Er is nog steeds weinig snelle en effectieve oplossing voor de diagnose of behandeling van C. neoformans infectie in een vroeg stadium in de kliniek. Antistof-geconjugeerde silica-gemodificeerde goud nanostaven (GNR-SiO₂-Ab) kunnen C. neoformans selectief conjugeren. Het kan een mogelijkheid bieden voor behandeling van cryptococcose veilig en effectief.

Methoden

Goud nanostaven (GNRs) werden gesynthetiseerd volgens het zaad-gemiddelde sjabloon-geassisteerde protocol. Anti-C. neoformans antistof was covalente geankerd op het oppervlak van GNRs met silaankoppelingsmiddel. In vitro computertomografie beeldvorming werd uitgevoerd om het diagnostische effect van de GNR-SiO₂-Ab te verkennen. De levensvatbaarheid van cellen werd geëvalueerd om het foto-thermische therapie-effect van GNR-SiO₂-Ab gecombineerd met nabij-infrarood (NIR) laserlicht te bevestigen.

Resultaten

GNR-SiO₂-Ab heeft een potentiële toepassing als positief Röntgen/CT beeldvormingscontrastmiddel. Een antistof kan een veel grotere aggregatie van GNRs induceren door te binden aan het oppervlak van C. neoformans cellen, wat resulteert in veel hogere attenuatiewaarden dan ooit. Na bestraling, leden C. neoformans cellen foto-thermische schade en de normale structuur van cellen werd vernietigd. De levensvatbaarheid van cellen verminderde significant vergeleken met onbehandelde cellen.

Conclusies

Ons werk bevestigde dat antistof-geconjugeerde silica-gemodificeerde goud nanostaven de Röntgenattenuatie van C. neoformans cellen in CT-beelden kunnen verhogen. En immuun GNRs, die gemedieerd werden door antistoffen, konden de effecten van NIR-geïnduceerde foto-thermische therapie in C. neoformans cellen verhogen.

Achtergrond

Cryptococcus neoformans is een geencapsuleerde gist, die voor het eerst werd beschreven door Busse in 1894 [1]. Infectie met de geencapsuleerde gist Cryptococcus neoformans kan resulteren in onschuldige kolonisatie van de luchtwegen, maar kan ook leiden tot meningitis of gedissemineerde ziekte [2], met name bij personen met defecte cel-gemedeerde immuniteit. Cryptococcose vertegenwoordigt een grote levensbedreigende schimmelinfectie bij patiënten met ernstige HIV-infectie en kan ook organtransplantatie, reticulo-endotheliale maligniteit, corticosteroïdebehandeling, of sarcoïdose compliceren [3]. Cryptococcale meningitis geassocieerd met HIV-infectie is verantwoordelijk voor meer dan 600.000 dodes per jaar wereldwijd [4]. Cryptococcale meningitis en gedissemineerde ziekte waren onvermijdelijk fataal. In 1995 rapporteerden Speed en Dunt een sterftecijfer van 14% onder patiënten met cryptococcale ziekte die behandeld werden met amphotericine B plus flucytosine [5]. De diagnostiek bij patiënten met verdachte cryptococcose was afhankelijk van schimmelcultuur. Echter, er is nog steeds weinig snelle en effectieve oplossing voor de diagnose of behandeling van C. neoformans infectie in een vroeg stadium. Bovendien ontvangen de meeste patiënten met cryptococcale infecties geen snelle behandeling, wat resulteert in een hoge sterfte.

Onder alle beeldvormingstechnieken is Röntgen gecomputeriseerde tomografie (CT) een van de meest nuttige diagnostische hulpmiddelen in ziekenhuizen in termen van beschikbaarheid, efficiëntie, en kosten [6]. CT kan anatomische patronen identificeren en complementaire anatomische informatie leveren inclusief tumorlocatie, grootte, en spreiding op endogeen contrast [7]. Een veelvoorkomende manifestatie van pulmonale cryptococcose is de aanwezigheid van solitaire of multiple pulmonale knopen of massa's, cavitatie, of parenchymale abnormaliteiten. Deze manifestaties worden duidelijk gedetecteerd door gecomputeriseerde tomografie (CT) beeldvorming [8]. Met radiografische beeldvorming worden de volgende kenmerken van Cryptococcale meningitis typisch gepresenteerd: gedilateerde Virchow-Robin ruimtes, meningeale versterking, prominente choroidale spleet, en parahippocampale cysten [9]. Echter, vroege cryptococcose kan niet worden gedetecteerd met radiologische beeldvorming. Dat wil zeggen, we kunnen geen snelle behandeling in een vroeg stadium uitvoeren. Onlangs hebben vooruitgang in het controleren van de oppervlaktevorm/morfologie van goud nanomaterialen de grote capaciteit gedemonstreerd om hun gelokaliseerde oppervlakteplasmonresonantie te ontwerpen [10, 11]. Hier onderzoeken we een soort nanoschaal goudmateriaal genaamd goud nanostaven (GNRs), die selectief kunnen conjugeren met de schimmels. In klinische CT-beeldvorming zijn gejodeerde verbindingen de meest gebruikte contrastmiddelen. Echter, het atoomnummer en de elektrondichtheid van goud zijn veel hoger dan die van jodium. Goud kan een sterke Röntgenattenuatie induceren, wat het een ideale kandidaat maakt voor CT-contrastmiddelen [7]. Door GNRs te conjugeren met specifieke antistoffen, kunnen wetenschappers potentieel specifieke weefsels en pathogenen targeten en vastleggen [12].

Amphotericine B is een belangrijk therapeutisch middel voor de behandeling van cryptococcale ziekte, dat sinds eind 1960s is ingezet [13]. Echter, de klinische effectiviteit van amphotericine B is beperkt, en het vertoont significante nefrotoxiciteit [14]. De effectiviteit van huidige geneesmiddelen is gecompromitteerd door toxiciteit, medicijnresistentie, of een ontoereikend bereik van activiteit [15, 16]. Dus, nieuwe selectieve therapeutische methoden voor cryptococcale ziekte moeten worden bedacht. Onlangs worden foto-thermische behandelingen uitgebreid gebruikt om kankercellen, virussen, en bacteriën te targeten en te vernietigen [17,18,19]. Vergeleken met traditionele therapeutische regimes is het mechanisme van dergelijke therapeutische middelen volledig anders. Nabij-infrarood (NIR) laserlicht is een ideale foto-thermische behandelmethode, die specifiek kan worden geabsorbeerd door weefsels of materialen. Licht kan effectief door weefsels penetreren met minimale schade aan normale weefsels [20]. GNRs absorberen licht in het NIR-gebied (650–900 nm), en de geabsorbeerde lichtenergie kan worden omgezet in thermische energie. Op basis van dit principe is het een ideale methode om NIR laserlicht te combineren met GNRs voor behandeling. Vergeleken met klassieke fotosensitizers hebben GNRs verschillende voordelige kenmerken: hoge absorptiekruissectie, hoge oplosbaarheid, uitstekende biologische compatibiliteit, hypotoxiciteit, grote lichtstabiliteit, en gemakkelijke conjugatie met doelwitmoleculen [21]. Verscheidene rapporten hebben beschreven hoe GNRs gebruikt kunnen worden voor foto-thermische behandelingen [22,23,24]. Carpin voerde een experiment uit in borstkankercellen, die HER2-gen over-exprimeerden en geïncueerd werden met anti-HER2-geconjugeerde silica-goud nanoshells. Vervolgens werden de complexen bestraald met 808-nm NIR-straling. Vergeleken met de controlegroep, werden de cellen vernietigd [17]. Wang rapporteerde dat antistof-geconjugeerde GNRs pathogene Salmonella bacteriën konden selecteren en vernietigen wanneer blootgesteld aan NIR-straling. Er was een hoogst significante reductie in Salmonella cellevensvatbaarheid [19].

Hier gebruiken we antistof-geconjugeerde silica-gemodificeerde goud nanostaven om specifiek C. neoformans cellen te binden. Verder kunnen de cellen die binden aan de complexen eenvoudig worden onderscheiden in CT-beelden. Deze goudnanodeeltjes werden geassocieerd met C. neoformans cellen via immuunconjugatie, en foto-thermische lyse veroorzaakte een significante reductie in cellevensvatbaarheid. Onze studie bevestigde een geheel nieuwe optie voor de diagnose en foto-thermische therapie van C. neoformans in vitro en biedt een mogelijkheid voor behandeling van cryptococcose veilig en effectief.

Methoden

Materialen

Anti-C. neoformans antistof werd aangeschaft van Meridian Life Science (Memphis, TN, VS). Chloroauurzuur (HAuCl₄·3H₂O) werd verkregen van Sigma (St. Louis, MO, VS). Zilvernitraat (AgNO₃), tetraethylorthosilicaat (TEOS), 3-aminopropyltrimethoxysilaan (APTS), cetyltrimethylammoniumbromide (CTAB), natriumborohydride (NaBH₄), 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide (EDC), poly(natrium-4-styreensulfonate) (PSS), en ascorbijnzuur werden verkregen van J & K Chemical Limited (China). Alle bovenstaande chemicaliën werden zonder verdere zuivering gebruikt. Gedemineraliseerd water (Millipore Milli-Q graad) met een resistiviteit van 18,2 MΩ cm werd in alle bereidingen gebruikt.

Synthese van Antistof-Geconjugeerde Silica-Gemodificeerde Goud Nanostaven

In een typisch experiment werden GNRs gesynthetiseerd volgens het zaad-gemiddelde sjabloon-geassisteerde protocol [25,26,27]. Synthetische weg voor het maken van de antistof-geconjugeerde silica-gemodificeerde goud nanostaven (GNR-SiO₂-Ab) is geïllustreerd in Fig. 1. Vijfentwintig milliliter van de GNR-oplossing werd gecentrifugeerd bij 12000 toer/min voor 15 min. Het supernatans, met voornamelijk CTAB-moleculen, werd verwijderd, en het neerslag werd heropgelost in 20 mL anhydrous ethanol aangepast tot pH 10 met 20 µL van 28% ammoniak. Na sonicatie werd 5 mL TEOS (10 mM) toegevoegd en het hele systeem werd 24 uur heftig geroerd. Silica-gecoate GNRs werden verzameld door centrifugatie bij 4000 toer/min voor 30 min en driemaal met water en tweemaal met ethanol gewassen. De verkreende zuiverde GNR-SiO₂ monsters werden hergedispergeerd in 10 mL ethanol voor verder experiment [28]. Vervolgens werd 10 mL APTS toegevoegd om een gemengde oplossing te vormen en 1 uur onder terugkoken bij 60 °C gereageerd. Het resultaat werd vijf keer met gedemineraliseerd water gewassen en 3 uur bij 60 °C in een vacuümoven gedroogd om de GNR-SiO₂-NH₂ te verkrijgen. Het resultaat werd verder gecoat met een polymer (PSS) door een laag-voor-laag techniek die toegankelijke aminegroepen aan het oplosmiddel biedt [29]. Deze amine-getermineerde nanostaven werden toegestaan 12–16 uur te reageren met het carboxylzuur van gezuiverde antistoffen in de aanwezigheid van EDC, een wateroplosbare carbodiimide die amidebindingvorming bevordert tussen het carboxylzuur en primaire amine [30]. Na incubatie werden de nanostaf-antistofo complexen gezuiverd door centrifugatie en heropgelost in PBS [31].

Karakterisering van GNR-SiO₂-Ab

De grootte en morfologie van GNR en GNR-SiO₂-Ab werden gekarakteriseerd met transmissie-elektronenmicroscopie (TEM; Tecnai G2 spirit Biotwin, FEI, VS), werkend bij een versnellingsspanning van 120 kV [20]. UV-vis spectra werden gemeten bij 20 °C met een UV-zichtbaar spectrophotometer (Shimadzu UV-2450, Shimadzu, Japan) uitgerust met een 10-mm kwartscel, waar de lichtweg 1 cm was. De 200- tot 1000-nm golflengte werd gescand, aangezien het de absorptiepieken van de GNRs, anti-C. neoformans antistof, en GNR-SiO₂-Ab omvat. De GNR-SiO₂-Ab werd geïncueerd bij 4 °C voor 2 en 4 weken. De 200- tot 1000-nm golflengte werd gescand op de twee tijdstippen.

Hounsfield Eenheden van GNR-SiO₂-Ab Meting

De waterige oplossing van GNR-SiO₂-Ab met verschillende concentraties in het bereik van 0,04–4 mg/mL werd direct gedetecteerd met een Philips Brilliance 64 CT-scanner (Philips Healthcare, Best, Nederland). De attenuatiewaerden werden verkregen uit de CT-beeldvormingssoftware.

Hechting van C. neoformans aan GNR-SiO₂-Ab

C.neoformans type A H99-stam werd verkregen van Shanghai Key Laboratory of Molecular Medical Mycology (Shanghai Changzheng Ziekenhuis, Tweede Militaire Medische Universiteit, Shanghai, China). Schimmels werden toegestaan 1 uur te incuberen met de GNRs en antistof-nanostafcomplexen voor TEM-analyse. Afbeeldingen werden verzameld op een TEM-instrument (Tecnai G2 spirit Biotwin, FEI, VS) werkend bij een versnellingsspanning van 120 kV.

In Vitro CT-scanning van Schimmel-Antistof-Nanostaf Complexen

De materialen en schimmels werden verdeeld in drie groepen, welke omvatten schimmelsgroep (N), GPR-SiO₂-Ab groep (G), en GPR-SiO₂-Ab-gehechte C. neoformans groep (G+N). De concentratie van GNR-SiO₂-Ab waterige oplossing hierboven was 4 mg/mL. Voor in vitro CT-beeldvorming werden de oplossingen van de drie groepen bereid in 1,5-mL steriele Ep-buizen. Alle CT-scans werden uitgevoerd met het bovengenoemde CT-systeem.

In Vitro Foto-Thermische Therapie Effecten

C. neoformans cellen geïncueerd met en zonder GNR-SiO₂-Ab werden blootgesteld aan NIR-laser (LWIRL 808, Laserwave Ltd., China) bestraling voor 5 min, met een golflengte van 808 nm en een intensiteit van 30 mW (4 W/cm²). Afbeeldingen werden verzameld op een TEM-instrument (Tecnai G2 spirit Biotwin, FEI, VS) werkend bij een versnellingsspanning van 120 kV. Na bestraling werden cellen 2 uur geïncueerd bij 37 °C in het donker. C. neoformans cellen geïncueerd met en zonder GNR-SiO₂-Ab werden als controlegroepen ontworpen. Cellevensvatbaarheid werd bepaald door uitvoering van CellTiter-Glo® luminescente cellevensvatbaarheidstoets (Promega Corporation, Madison, WI, VS) in overeenstemming met de fabricage-instructies [28]. Deze specifieke cellevensvatbaarheidstoets was een homogene methode, die het aantal levensvatbare cellen kon bepalen. De luciferase-gemiddelde reactie tussen luciferine en ATP werd gebruikt voor de synthese van metabolisch actieve cellen. Alle experimenten werden zes keer herhaald, en hun gemiddelde waarden werden bepaald.

Statistische Analyse

Alle analyses werden uitgevoerd met SPSS versie 13.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL, VS). Data worden uitgedrukt als gemiddelde ± SD. P-waarde van minder dan 0,05 werd genomen om statistische significantie aan te duiden. Alle figuren getoond in dit artikel zijn verkregen uit meer dan drie onafhankelijke experimenten met vergelijkbare resultaten.

Resultaten

Synthese en Karakterisering van GNR-SiO₂-Ab

Een methode voor silica-gecoate GNRs met TEOS als silicabron en APTS als koppelingsmiddel is eerder gerapporteerd [30]. De vorm of grootte van GPRs veranderde niet wanneer ze geconjugeerd werden met anti-C. neoformans. Figuur 2 toont de TEM-afbeelding van GNR-SiO₂-Ab. Deze nanodeeltjes zijn 18,48 ± 2,39 nm in breedte en 57,56 ± 4,57 nm in lengte.

Spectroscopische Eigenschap en Stabiliteit van GNR-SiO₂-Ab

Wat betreft de foto-fysieke eigenschap van GNR-SiO₂-Ab, toont Fig. 3 de absorptiespectra van GNR-SiO₂, GNR-SiO₂-Ab, en anti-C. neoformans antistof. Het spectrum van GNR-SiO₂ toont dat GNR-SiO₂ twee absorptiebanden heeft, een zwakke transversale oppervlakteplasmonresonantiegolflengte (TSPRW) rond 520 nm en een sterke longitudinale oppervlakteplasmonresonantiegolflengte (LSPRW) rond 808 nm. Na conjugatie met antistoffen zijn de TSPRW en LSPRW van GNR-SiO₂-Ab respectievelijk 540 en 835 nm. In een vergelijking tussen het spectrum van de antistof en GNR-SiO2-Ab, hebben beide dezelfde speciale piek rond 280 nm. Dit resultaat bewijst dat de anti-C. neoformans antistof succesvol geconjugeerd was met GNR-SiO₂. Na incubatie bij 4 °C voor 2 weken, zijn de TSPRW en LSPRW van GNR-SiO₂-Ab respectievelijk 540 en 835 nm. En dezelfde data werd waargenomen bij 4 weken. De TSPRW en LSPRW van GNR-SiO₂-Ab veranderden niet na 4 weken incubatie. Het bevestigde de stabiliteit van GNR-SiO₂-Ab.

Hounsfield Eenheden van GNR-SiO₂-Ab Meting

De Hounsfield eenheden (Hu) van GNR-SiO₂-Ab zoals geëvalueerd door een klinische CT. Figuur 4 toont de CT-beelden in het bereik van 0,04–4 mg/mL van GNR-SiO₂-Ab. Naarmate de concentratie van GNR-SiO₂-Ab toename, nam de CT-signaalintensiteit continu toe. Zoals getoond in Fig. 3, tonen Hu als functie van GNR-SiO₂-Ab concentratie een goed gecorreleerde lineaire relatie (R² = 0,9903), beschreven door de volgende typische vergelijking: y = 12,52x + 11,971. Deze resultaten suggereren dat GNR-SiO₂-Ab een potentiële toepassing heeft als positief Röntgen/CT beeldvormingscontrastmiddel.

Hechting van C. neoformans Cellen aan GNR-SiO₂-Ab

TEM-afbeeldingen tonen de morfologische kenmerken van C. neoformans cellen en schimmel-antistof-nanostafcomplexen. Deze cellen hebben een diameter variërend van 2 tot 20 µm. Figuur 5a toont de TEM-afbeelding van C. neoformans cellen, die omringd is door een polysacchariden capsule. Deze cellen waren 4–6 µm in diameter zonder binding van enige structuren. Zoals getoond in Fig. 5b, zijn de C. neoformans cellen bedekt door veel geaggregeerde GNR-SiO₂-Ab, na incubatie met de antistof-nanostafcomplexen. We incuberen de schimmelcellen met GNR-SiO₂ om te verkennen of GNR-SiO₂ gehecht was aan C. neoformans. Onze resultaten gaven aan dat GNR-SiO₂ verstrooid waren zoals getoond in Fig. 5c. Onze studie toont aan dat C. neoformans cellen selectief kunnen conjugeren met GNR-SiO₂-Ab.

In Vitro CT-scanning van Schimmel-Antistof-Nanostaf Complexen

We voerden kwantitatieve analyse van CT-signaalintensiteit uit via het fabricant's standaard weergaveprogramma (Philips portal, Philips Healthcare, Best, Nederland). Figuur 6 beeldt Röntgenattenuatiewaarden van de drie groepen. De waarden van de G+N groep waren significant hoger dan die van de G en N groepen. Bovendien waren Röntgenattenuatiewaarden van de G groep significant hoger dan die van de N groep. Dit resultaat stemt overeen met de bevindingen van eerdere literatuur [31].

In Vitro Effecten van Foto-Thermische Therapie

We evalueerden cellevensvatbaarheid door cellevensvatbaarheidstoets uit te voeren in een CellTiter-Glo® luminescent instrument. Cellen zonder bestraling hadden hogere levensvatbaarheid dan NIR-bebestralen cellen (P < 0,05). Bovendien was levensvatbaarheid van schimmels hoger dan cellen geconjugeerd met GNR-SiO₂-Ab na NIR-bestraling (P < 0,05). Bovendien hadden cellen hogere levensvatbaarheid dan schimmel-antistof-nanostafcomplexen (P < 0,05). Figuur 7 illustreert duidelijk de variatie in de levensvatbaarheid van C. neoformans cellen met verschillende behandelingen. Na bestraling lieten C. neoformans cellen foto-thermische schade lijden en de normale structuur van de cellen werd vernietigd. Zoals getoond in Fig. 8, vertoonden de cellen atrofische, irreguliere, en ingevallen uiterlijken. De kenmerkende polysacchariden capsule was beschadigd.

Discussie

Silica heeft veel voordelen ten opzichte van polymer [32]. De bereidingsprocessen zijn redelijk eenvoudig, en de dikte van een silicahuls kan worden afgesteld op de gewenste grootte en porositeit. Verder is silica uiterst stabiel en heeft bio-compatibiliteit, geen zwelling of porositeitsveranderingen met verandering in pH, en is niet kwetsbaar voor microbiële aanval. Bovendien heeft silica gemak van oppervlaktemodificatie met een verscheidenheid aan functionele groepen met behulp van silaanchemie en commercieel beschikbare organosiliciumreagentia voor biotargeting. Silica-gecoate GNRs behouden de superieure optische eigenschappen van GNRs en kunnen hun thermische stabiliteit onder hoge-energiebestraaling verbeteren. In onze studie, na coating met silica en conjugatie met anti-C. neoformans antistof, vertoonden GNRs beide een rode verschuiving in het oppervlakteplasmonresonantiepiek, door de toename in brekingsindex van het omringende medium [32, 33]. De resultaten gaven ook aan dat de grootte van het monster groter en groter werd na modificatie en conjugatie. Deze gegevens gaven aan dat we goudnanodeeltjes succesvol geconjugeerd hebben met een anti-C. neoformans antistof. Echter, we kunnen de mogelijkheid niet uitsluiten dat de GNR-SiO₂ na binding met de antistoffen enige speciale kracht zou bezitten om cellen te conjugeren, en we zullen in de toekomst een verdere studie uitvoeren. In deze studie hebben we GNR-SiO₂-Ab succesvol aan de celcapsule gehecht via een eenvoudige antigeen-antistofreactie. Daarnaast hebben we ervoor gezorgd dat onze complexen antigenen op de celcapsule targetten.

GNRs hebben de afgelopen decennia veel aandacht gekregen. Hainfeld et al. [34] rapporteerden voor het eerst dat GNRs gebruikt kunnen worden als Röntgencontrastmiddel. GNRs bieden verschillende voordelen ten opzichte van gejodeerde moleculen, een conditioneel contrastmiddel. Vanwege een hoog atoomnummer en elektrondichtheid vertonen GNRs een relatief hoge Röntgenattenuatiecoëfficiënt. Het atoomnummer en de elektrondichtheid van goud (79 en 19,32 g/cm³, respectievelijk) zijn hoger dan die van jodium (53 en 4,9 g/cm³) [7]. Jodium als Röntgencontrastmiddel heeft veel ernstige bijwerkingen, zoals nefrotoxiciteit en ernstige allergische reacties. Echter, GNRs persisteren in het lichaam veel langer dan jodiumcontrastmiddelen, wat betekent dat er voldoende tijd is om de beelden te observeren. Verder kunnen GNRs kankercellen, virussen, en bacteriën targeten, via oppervlaktefunctionalizering met een verscheidenheid aan moleculen, zoals peptiden of antistoffen. Reuveni et al. [31] hebben getoond dat verscheidene verschillende typen moleculen aan het oppervlak van GNRs kunnen worden gehecht. In deze studie nam de CT-signaalintensiteit continu toe, samen met de toegenomen concentratie van GNR-SiO₂-Ab, resulterend in helderdere beelden. GNR-SiO₂-Ab vertoonde significant positief potentieel als Röntgen/CT beeldvormingscontrastmiddelen, alsook GNRs. De Röntgenabsorptie van goud nanostaven bleef onveranderd, zelfs met oppervlaktemodificatie. Deze gegevens wijzen erop dat de Röntgenattenuatie-eigenschappen van GNR-SiO₂-Ab niet significant veranderden als gevolg van oppervlaktemodificatie. Dit komt overeen met bevindingen gerapporteerd in eerdere literatuur [35,36,37]. Oppervlaktefunctionalizering is een krachtig hulpmiddel dat passieve of actieve targeting van GNRs naar een specifieke locatie van belang mogelijk maakt. In onze studie hebben we GNR-SiO₂-Ab succesvol aan de capsules van C. neoformans gehecht. Bovendien hebben we bepaald of deze antistof-geconjugeerde deeltjes gebruikt konden worden als nanoprobes tijdens gerichte CT-beeldvorming van C. neoformans cellen in vitro. We observeerden dat CT-beelden van C. neoformans cellen gedispergeerd in PBS er heel vergelijkbaar uitzagen als beelden afgeleid van C. neoformans cellen gedispergeerd in water. Echter, het is moeilijk om de beelden van schimmels van zachte weefsels te onderscheiden. Een antistof kan een veel grotere aggregatie van GNRs induceren door te binden aan het oppervlak van C. neoformans cellen, wat resulteert in veel hogere attenuatiewaarden dan ooit. Dus kunnen we succesvol onderscheidbare Röntgenattenuatie van schimmels bereiken. Gebaseerd op onze resultaten kan de detectie van C. neoformans door CT-beeldvorming bereikt worden en nieuwe kansen in diagnostiek bieden.

GNRs zijn breed ingezet voor tumor foto-thermische therapie [22, 38, 39]. Onze studie wijst erop dat GNR-SiO₂-Ab een selectief hulpmiddel kan zijn om C. neoformans cellen te vernietigen. Onze resultaten bevestigden dat het celmembraan van C. neoformans cellen onherstelbaar en slecht vernietigd werd na bestraling door NIR. Bovendien verminderde de levensvatbaarheid van cellen significant vergeleken met onbehandelde cellen. Deze resultaten gaven aan dat NIR-straling alleen de dood van C. neoformans cellen veroorzaakt. Echter, de levensvatbaarheid van cellen geïncueerd met GNR-SiO₂-Ab was ook gedempt. In cellen geïncueerd met GNR-SiO₂-Ab en onderworpen aan NIR-bestraaling, verminderde de levensvatbaarheid van cellen significant vergeleken met andere groepen. We stellen vast dat de GNR-SiO₂-Ab geconjugeerd met de schimmels selectief en de effecten van de NIR-straling verbeterde. GNR-SiO₂-Ab heeft de capaciteit van selectieve foto-thermische therapie-effecten op de C. neoformans cellen. Het werkingsmechanisme is eerder niet gerapporteerd. We speculeren dat ontwrichting in celmembraan waarschijnlijk geïnduceerd werd door bestralings-geïnduceerde celdood. Norman et al. [18] rapporteerden dat levensvatbaarheid van Pseudomonas aeruginosa significant verminderde wanneer deze soort blootgesteld was aan bestraling en gebonden was met goud nanostaven, die covalent geconjugeerd waren met specifieke antistoffen. Deze cellen toonden ook gebieden van slecht ontwricht celmembraan met onherstelbare schade, veroorzaakt door blootstelling aan NIR-bestraaling. Wanneer nanodeeltjes blootgesteld werden aan NIR-straling, werd het celmembraan beschadigd door verschillende factoren, waaronder nanodeeltjesexplosie, schokgolven, belvorming, en thermische desintegratie [40].

In deze studie trad de dood of verminderde activiteit van C. neoformans cellen op wanneer het celmembraan ontbonden en vernietigd werd door thermische energie. Echter, verdere studies moeten worden uitgevoerd om deze hypothese te bevestigen. C. neoformans cellen worden beschadigd door de volgende factoren: gelokaliseerde temperatuurstijgingen, nanodeeltjesexplosie, schokgolven, belvorming, en thermische desintegratie die veroorzaakt wordt door NIR-straling. In het bijzonder werden C. neoformans cellen aanzienlijk beschadigd wanneer blootgesteld aan alleen NIR-straling. Er zijn twee mogelijke redenen om uit te leggen hoe getargete GNR-SiO₂-Ab NIR-straling stimuleert door foto-thermische vernietiging van C. neoformans cellen te eliciteren. Een mogelijkheid is dat in de capsule van C. neoformans cellen, de getargete GNR-SiO₂-Ab een gelokaliseerde temperatuurstijging induceert. De tweede mogelijkheid is dat, door een antigeen-antistofreactie tussen GNR-SiO₂-Ab en de capsule van C. neoformans cellen, structurele veranderingen in de celwand en capsule ontstaan. Vanwege dergelijke veranderingen zouden cellen gevoeliger zijn voor foto-thermische behandeling [41]. Eerdere studies hebben de lage toxiciteit van goud nanostaven bevestigd [22, 42, 43], en verdere studies zullen nodig zijn om het effect van foto-thermische therapie in vivo te onderzoeken. Het meest spijtige van onze studie is dat we de beladingscapaciteit van GNR-SiO₂-Ab niet bespraken. Verdere studie zal zich concentreren op de relatie tussen de beladingscapaciteit van GNR-SiO₂-Ab en het foto-thermische effect.