Hooggeladen 5-aminolevulinezuur-squalene-nanodeeltjes: verbeterde tumorfotodetectie en -therapie in celmodellen

Samenvatting

Protoporphyrine IX (PpIX), de endogene fotosensitizer geproduceerd na toediening van 5-aminolevulinezuur (5-ALA), is een hoeksteen van fotodiagnostiek (FD) en fotodynamische therapie (FDT) voor verschillende maligniteiten. Toch beperkt 5-ALA's zwitterionische aard de penetratie door biologische barrières, wat de systemische klinische bruikbaarheid beperkt. Hier beschrijven we een nieuw gesqualeneerde 5-ALA (5-ALA-SQ) dat zich zelf-assembleert in nano-assemblages (NA's) met een gemiddelde diameter van 70 nm, een lage polydispersiteitsindex (0,12), een +36 mV zetapotentiaal, en een opmerkelijke geneesmiddellading van 26%. In humane prostaat (PC3) en glioblastoom (U87MG) cellijnen genereerden 5-ALA-SQ NA's PpIX-fluorescentie die gelijk of superieur was aan die van de commerciële hexyl-ester (5-ALA-Hex) bij vergelijkbare concentraties, terwijl superieure prestaties vertoonden bij vroege tijdspunten (≤4 uur). Deze resultaten benadrukken 5-ALA-SQ NA's als een veelbelovend platform voor systemische afgifte van 5-ALA in FD en FDT toepassingen.

Achtergrond

Nanotechnologie biedt biocompatibele, afbreekbare dragers die de chemische stabiliteit, farmacokinetiek en plaats-specifieke afgifte van therapeutische agenten kunnen verbeteren. Echter, veel nanopartikelsystemen lijden onder lage geneesmiddellading (<5%) en een burst-vrijgave-effect dat effectiviteit en veiligheid compromiseert. Squalene, een natuurlijke triterpeen en cholesterine-voorloper, heeft zich ontwikkeld als een veelzijdig skelet voor "squalenisatie" – covalente conjugatie van geneesmiddelen aan squalene die spontane zelfassemblage in hoog-geladen, stabiele nano-assemblages (NA's) drijft. Gesqualeneerde NA's zijn met succes ingezet voor cytostatica zoals gemcitabine, paclitaxel, cisplatine en doxorubicine, vaak met superieure farmacologische activiteit en in sommige gevallen theranostische functionaliteiten mogelijk makend.

5-ALA, de voorloper van PpIX, wordt al klinisch gebruikt voor FD, FDT en fluorescentie-geguideerde resectie van glioma's. Het therapeutische venster wordt beperkt door de geladen structuur, wat systemische absorptie en tumor-accumulatie beperkt. Hoewel geësterificeerde derivaten zoals 5-ALA-Hex de biobeschikbaarheid verbeterden, blijft hun gebruik grotendeels topicaal of beperkt tot specifieke kankers zoals blaascarcinoom. Recent onderzoek heeft de inkapseling van 5-ALA in polymere NA's, liposomen, dendrimers en goudnanopartikels verkend, doch geen van deze is vertaald naar klinisch levensvatbare systemische formuleringen.

Ons doel was om een 5-ALA-squaleen-conjugaaat te ontwerpen dat zich zelf-assembleert in NA's met hoge geneesmiddellading, robuuste stabiliteit en efficiënte tumor-opname, waardoor de klinische toepasbaarheid van 5-ALA voor FD en FDT in solide tumoren buiten de huidige indicaties wordt uitgebreid.

Resultaten en discussie

Synthese van de 5-ALA-SQ Bouwsteen

Het conjugaaat werd samengesteld in vier convergente stappen. Boc-beschermde 5-ALA werd gekoppeld aan een gehydroxyleerd squaleen-derivaat via EDC/DMAP-gemediëerde esterificatie, gevolgd door milde zuur-gemediëerde deprotectie en finale zuivering door omgekeerde-fase HPLC. De totale opbrengst was hoog en het product volledig gekarakteriseerd door NMR en massaspectrometrie.

Karakterisering van 5-ALA-SQ Nano-assemblages

Zelfassemblage werd geïnduceerd door nanoprecipitatie: het conjugaaat werd opgelost in een 1:1 aceton/ethanol mengsel en druppelgewijs geïnjecteerd in Milli-Q water onder roeren, gevolgd door oplosmiddelverwijdering. Dynamische lichtverstrooiing (DLS) en cryo-TEM onthulden monodisperse deeltjes met een gemiddelde hydrodynamische diameter van 70 nm en een polydispersiteitsindex van 0,12. Het zetapotentiaal van +36 mV suggereert sterke colloidale stabiliteit en gunstige interacties met negatief geladen celmembranen. Belangrijk is dat de 26% geneesmiddellading een substantiële verbetering vertegenwoordigt ten opzichte van de meeste 5-ALA nanopartikelformuleringen, die typisch <5% lading vertonen.

In vitro PpIX Fluorescentie-kinetiek in kankercellen

PC3 en U87MG cellen werden geïncubeerd met variërende concentraties van 5-ALA-SQ NA's of de commerciële 5-ALA-Hex. Fluorescentie werd gemonitord over 24 uur met een plaatlezer (405 nm excitatie, 630 nm emissie). Bij 1,0–2,0 mM produceerden 5-ALA-SQ NA's een stijgende PpIX-fluorescentie, plateau na ~8 uur. In tegenstelling, piekte 5-ALA-Hex bij 0,10–0,30 mM maar vertoonde cytotoxiciteit boven 1 mM, wat de algehele fluorescentie verlaagde.

Dosis-respons-kurven bij 4 uur en 24 uur onthulden dat 5-ALA-SQ NA's 5-ALA-Hex evenaarden of overtreffen in fluorescentie-intensiteit over beide cellijnen. De maximale fluorescentie bij 4 uur werd bereikt met 1–2 mM 5-ALA-SQ, terwijl 24 uur blootstelling hogere concentraties (tot 3,3 mM) vereiste om dezelfde niveaus te benaderen. Opvallend, 5-ALA-SQ handhaafde een meer sustained fluorescentieprofiel, met een geleidelijke afname alleen bij de hoogste concentraties en langste incubatietijden.

In vergelijking met de gemarkeerde 5-ALA-formulering, produceerden 5-ALA-SQ NA's significant hogere fluorescentie na 4 uur in U87MG-cellen, een kritisch venster voor intra-operatieve imaging. Bij 24 uur, de fluorescentie van 5-ALA-SQ stemde overeen met die van 5-ALA bij optimale concentraties, wat vergelijkbare algehele PpIX-productie over tijd aangeeft.

De verbeterde cellulaire opname van 5-ALA-SQ wordt waarschijnlijk gedreven door albumine-gemediëerde transport van het monomere conjugaaat, zoals eerder aangetoond voor squaleen-gemcitabine NA's. De positief geladen aminogroep van 5-ALA kan georiënteerd zijn naar de waterige fase, terwijl de hydrofobe squaleen-kern assembleert in het deeltjesinterieur, wat de verminderde deeltjesgrootte ten opzichte van andere squaleen NA's verklaart.

Conclusies

We hebben een 5-ALA-squaleen-conjugaaat ontworpen dat spontaan hoog-stabiele, hoog-geladen (26%) nano-assemblages vormt met gunstige grootte en oppervlaktelading. In vitro studies in prostaat- en glioblastomacellen tonen aan dat deze NA's 5-ALA efficiënt afgeven, PpIX-fluorescentie genereren die commerciele formuleringen evenaart of overtreft, en robuuste prestaties behouden over uitgebreide incubatie. Deze bevindingen ondersteunen verdere in vivo evaluatie van 5-ALA-SQ NA's als een systeemplatform voor tumor-fotodiagnostiek en fotodynamische therapie.

Methoden/Experimenteel

Alle reagentia werden van commerciële leveranciers verkregen en zonder verdere zuivering gebruikt. 5-ALA werd Boc-beschermd, gekoppeld aan een gehydroxyleerd squaleen-derivaat (3) met behulp van EDC/DMAP, vervolgens gedeporteerd onder milde zuur-omstandigheden. Het eindproduct (5) werd gezuiverd door omgekeerde-fase HPLC en gekarakteriseerd door NMR en HRMS.

Nano-assemblages werden bereid door nanoprecipitatie: 1,2 mg van de bouwsteen (5) werd opgelost in een 50/50 aceton/ethanol mengsel (500 µL) en druppelgewijs toegevoegd aan 1,25 mL Milli-Q water bij 100 µL/min. Na 5 min roeren, werden oplosmiddelen verwijderd door rotaire verdamping bij 30 °C, wat een 2,00 mM NA-oplossing opleverde.

Deeltjesgrootte, polydispersiteit en zetapotentiaal werden gemeten door DLS (Malvern Nano ZS) bij 25 °C. Cryo-TEM werd uitgevoerd op vitrifieerde monsters bereid met een Vitrobot plunger. Stabiliteit werd beoordeeld door DLS over 1 maand bij 4 °C.

PC3 (12.000 cellen/put) en U87MG (10.000 cellen/put) werden gezaaid in 96-put platen, geïncubeerd met seriële verdunningen van 5-ALA-SQ NA's, 5-ALA-Hex of 5-ALA (serum-vrij medium) gedurende maximaal 24 uur. PpIX-fluorescentie werd vastgelegd op een Safire plaatlezer (405 nm excitatie, 630 nm emissie). Data genormaliseerd ten opzichte van onbehandelde controles en geplot als gemiddelde ± SD. Statistische significantie ingesteld op p < 0,05 (GraphPad Prism 6).