Gerichte siRNA-afgifte aan eierstokkanker met foliumzuur-gefunctionaliseerde grafeneoxide/PEI-nanocomplexen

Samenvatting

Gentherapie duikt op als een geldige methode voor de behandeling van eierstokkanker, met name small interfering RNA (siRNA). Ondanks de krachtige werking, heeft het gebrek aan efficiënte gerichte gendeliverysystemen de ontwikkeling van gentherapie ernstig gehinderd. In deze studie synthetiseerden we een nieuw genvector PEG-GO-PEI-FA door grafeneoxide (GO) te functionaliseren, waarbij foliumzuur (FA) specifiek kan binden aan de foliaatreceptor (FR), die overexprimeerd is in eierstokkanker. De karakteristieken van de nanocomplexen werden geëvalueerd met dynamische lichtverstrooiing (DLS), atoomkrachtmicroscopie (AFM) en Fourier-transformatie-infraroodspectroscopie (FTIR). De siRNA-condensatiecapaciteit en stabiliteit werden beoordeeld met agarosegelelektroforese. De celopname-efficiëntie en lysosomale ontsnappingscapaciteit in eierstokkankercellen werden onderzocht met confocale laserscanningmicroscopie. Verder werden de cellulair bioveiligheid van het systeem en de inhibitie van de siRNA-draagbaarheid geëvalueerd met de CCK-8-test. De grootte van de PEG-GO-PEI-FA-nanocomplexen was 216,1 ± 2,457 nm, met milde cytotoxiciteit in eierstokkankercellen. Met hoge opname-efficiëntie kan PEG-GO-PEI-FA snel uit het lysosom ontsnappen en het gen vrijgeven. Bovendien kan PEG-GO-PEI-FA/siRNA de groei van eierstokkankercellen effectief remmen. Samengevat biedt PEG-GO-PEI-FA/siRNA een veelbelovende strategie voor siRNA-afgifte bij de behandeling van FR-positieve eierstokcarcinoomen of vergelijkbare tumoren.

Inleiding

Eierstokkanker is de leidende gynaecologische doodsoorzaak in de wereld en wordt meestal geassocieerd met slechte klinische uitkomsten door de moeilijkheid van vroege diagnose en therapie [1-3]. Helaas vertonen conventionele chemotherapeutica inherente beperkingen zoals aspecifieke distributie, slechte biobeschikbaarheid, snelle bloedclearance en slechte oplosbaarheid in fysiologische omgevingen [4]. In de afgelopen decennia is gentherapie onderzocht als een potentiële benadering voor de behandeling van diverse genetische aandoeningen, waaronder kanker [5-8]. Echter, het gebrek aan een veilig, hoog efficiënt en selectief gendeliveryvector heeft de vooruitgang naar klinische toepassing gehinderd. Op dit moment zijn er twee categorieën genvectoren: virale en niet-virale vectoren. Hoewel virale vectoren hoge transfictie-efficiëntie tonen, beperken verschillende nadelen hun klinische toepassing, zoals ernstige immuuninflammatoire reacties en het risico op recombinatie met wild-type virussen [9, 10]. Integenstelling, niet-virale vectoren hebben een uitgebreide delivercapaciteit, lage immunogeniciteit en structurele flexibiliteit, wat ze uitstekende alternatieven voor virale vectoren maakt [11-13]. Met de snelle ontwikkeling van nanotechnologie zijn veel nanopartikels onderzocht voor potentiële gebruik als gendeliverycarriers [14, 15]. Hierbij hebben we een nieuwe niet-virale vector PEG-GO-PEI-FA ontworpen die efficiënt aan tumorweefsel kan worden afgeleverd.

Grafeneoxide (GO) is een derivaat van grafiet dat geproduceerd wordt door meervoudige oxidatie, ultrasonische behandeling en zuivering van grafiet [16]. Het GO-oppervlak bevat epoxy-, hydroxyle- en carboxylgroepen [17]. De zuurstoffunctionele groepen op het oppervlak geven GO een uitstekende biocompatibiliteit, waardoor het een stabiele suspensie in water en organische oplosmiddelen kan vormen, wat chemische modificaties en functionalisering vergemakkelijkt [18, 19]. Daarom wordt GO breed gebruikt voor fotothermale kankertherapie, medicijn- en gendelivery en biosensoren [20-22]. Polyethyleenglycol (PEG) is een veilig, niet-toxisch, biologisch afbreekbaar materiaal; het is goedgekeurd door de Amerikaanse FDA als hydrofiele medicijndrager [23]. De GO-functionaliserings met PEG kan de stabiliteit onder fysiologische condities verbeteren, de cyclustijd van GO-nanomateriaal in het lichaam verlengen en de farmacokinetiek van GO-nanomateriaal verbeteren voor betere tumortargeting [24, 25]. Polyethyleenimine (PEI) is een gouden standaard van niet-virale vectoren geworden vanwege de hoge transfictie-efficiëntie in diverse cellijnen [26]. Echter, PEI toont ernstige cytotoxiciteit en slechte biocompatibiliteit, wat de klinische toepassingen beperkt. In deze studie observeerden we een significante afname van cytotoxiciteit wanneer PEI op het oppervlak van GO werd gegrifteerd. De foliaatreceptor is overexprimeerd op diverse kankercellen, met name in eierstokkankercellen zowel voor als na chemotherapie [27]. Voor gerichte gendelivery werden foliumzuurmoleculen covalent gebonden aan GO om foliaatreceptors te targeten.

Over het algemeen was het hoofddoel van deze studie om een nieuw gericht GO-gebaseerd gendeliverysysteem te verkennen om de nut van siRNA-gebaseerde gentherapie voor eierstokkanker te vergroten. De verkregen positief geladen PEG-GO-PEI-FA kon met siRNA worden beladen voor gendelivery. De succesvolle synthese, karakterisering, effectieve cellulair opname en in vitro antikankereffect werden geanalyseerd met diverse technieken. Daarnaast werd de veiligheid van dit systeem in vitro geëvalueerd.

Materialen en methoden

Materialen

Grafeneoxide werd verkregen van Suzhou Carbon Fung Graphene Technology Co. Ltd. (Suzhou, China). Foliumzuur (FA), N-hydroxysuccinimide (NHS) en fluoresceïne-isothiocyanate (FITC) werden aangekocht bij Sigma Aldrich Trading Co. Ltd. (Shanghai, China). Vertakte PEI 25K, PEG (MW = 2000), agarose en 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC·HCL) werden gekocht bij Adama Reagent Co. Ltd. (Shanghai, China). Fosfaatgebufferde oplossing (PBS), Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS) en alle overige chemicaliën werden aangeschaft bij Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd. (Shanghai, China). Alle overige chemicaliën waren van reactieve graad. RPMI-1640-medium (Gibco), fetale bovineserum (FBS) (Gibco), trypsine (Gibco) en 20× TAE-buffer werden verkregen van Thermo Fisher Scientific Co. Ltd. (China). Cel telling kit8 (CCK-8) werd aangekocht bij Shanghai Yisheng Biological Co. Ltd. (Shanghai, China). LysoTrackerRed, 4% paraformaledehyde, 4′-6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) en Lipofectamine 2000 transfectiereagentia werden gekocht bij Invitrogen Co. Ltd. (China). Dil-fluorescentiesonde (Cat. nr.: C1036) werd aangeschaft bij Beyotime Co. Ltd. Anti-PLK1 (PLK1-homo-581) small interfering RNA (siRNA) werd gesynthetiseerd door Shanghai GenePharma Co. Ltd. (Shanghai, China).

Bereiding van PEG-GO-PEI-FA

De synthese van PEG-GO-PEI-FA volgde de strategie getoond in Figuur S2(A). Ten eerste werd 10 mL GO-waterige suspensie (1000 μg/mL) continu 2 uur gebadsoniceerd bij 50 W. Vervolgens werden 1 mL EDC·HCL (5000 μg/mL) en NHS (5000 μg/mL) toegevoegd en 30 minuten intermittierend gesoniceerd bij 100 W, gevolgd door toevoeging van PEG (10 mg) gesoniceerd gedurende 30 minuten en 6 uur geroerd op een magnetische roerapparaat bij 0 °C. Om de ongereageerde reagenten te verwijderen en GO-PEG-oplossing te verkrijgen, werd het mengsel 24 uur gedialyseerd in gedestilleerd water met een dialysemembraan (MWCO, 3500 Da). Vervolgens werd de GO-PEG-oplossing 30 minuten gesoniceerd, 1 mL EDC·HCL (5000 μg/mL) en NHS (5000 μg/mL) toegevoegd en opnieuw 30 minuten gesoniceerd, gevolgd door toevoeging van PEI 25K (5000 μg/mL) 2 mL. Het mengsel werd 30 minuten gesoniceerd en 6 uur geroerd bij 0 °C. Daarna werd het mengsel opnieuw 24 uur gedialyseerd in gedestilleerd water met een dialysemembraan (MWCO, 3500 Da) om PEG-GO-PEI te verkrijgen. De PEG-GO-PEI-oplossing werd 60 minuten gesoniceerd, 1 mL EDC·HCL (5000 μg/mL) en NHS (5000 μg/mL) toegevoegd en 30 minuten gesoniceerd, gevolgd door toevoeging van 10 mg FA aan de oplossing. De oplossing werd 30 minuten gesoniceerd, 12 uur geroerd bij 0 °C en 48 uur gedialyseerd om PEG-GO-PEI-FA te verkrijgen volgens de bovengenoemde procedure. De oplossing van nanocomplexen werd gedroogd met een vacuümvriesdroger (Biosafer-10D).

Karakterisering

De oppervlakte zeta-potentieel en gemiddelde deeltjesgrootte van de nanocomplexen in waterige oplossing werden gemeten met dynamische lichtverstrooiing (DLS, Malvern Zetasizer Nano ZS, UK). De morfologie van de nanocomplexen werd waargenomen met een atoomkrachtmicroscoop in de atmosfeer (AFM, MultiMode Nanoscope IIIa, Duitsland). Fourier-transformatie-infraroodspectroscopie (FTIR) spectra werden verkregen met een Thermo Nicolet 6700 FTIR-spectrograaf, met KBr-tablet in het bereik van 400–4000 cm⁻¹. De UV-Vis-absorptiespectra van de nanocomplexen werden gemeten met een UV-Vis-spectrofotometer (UV, EV300, VS). De Raman-spectra van de nanocomplexen werden gemeten met een dispersieve Raman-microscoop (Senterra R200-L, Duitsland) met een opwekkingsgolfengte van 532 nm.

In vitro bioveiligheidstest

SKOV3 (humane eierstokkankercellen) werd aangeschaft bij Keygen (China). Cellen werden gekweekt in RPMI-1640-medium, aangevuld met 10% FBS, 100 U/mL penicilline, 100 g/mL streptomycine, en gecultiveerd bij 37 °C onder een verzadigde atmosfeer met 5% CO₂. In deze studie werd de cytotoxiciteit van materialen geanalyseerd in SKOV3-cellen met de CCK-8-test. Kortweg, de cellen wurden gezaaid in een 96-putplaat met een dichtheid van 6 × 10³ cellen/put in 100 μL 1640-medium met 10% FBS en vervolgens 12 uur geïncueerd bij 37 °C in een verzadigde atmosfeer met 5% CO₂. Vervolgens werden GO, GO-PEG, PEG-GO-PEI en PEG-GO-PEI-FA toegevoegd bij finale concentraties variërend van 10 tot 1000 μg/mL en 12 uur geïncueerd met de cellen. Een andere reeks, GO, GO-PEG, PEG-GO-PEI en PEG-GO-PEI-FA werden geïncueerd met verschillende tijden van 4 tot 24 uur bij een concentratie van 100 μg/mL. Vervolgens werd 10 μL CCK-8 aan elke put toegevoegd en 3 uur geïncueerd bij 37 °C. Daarna werd de absorbantie bij 450 nm gemeten op een microplaatlezer. Elke groepsproef werd driemaal herhaald. De relatieve cellevendbaarheid (%) ten opzichte van controlecellen gekweekt in medium werd berekend als (absorbantie van monster − absorbantie van blanco) / (absorbantie van controle − absorbantie van blanco) × 100%.

Agarosegelelektroforese

De 20× TAE-bufferoplossing werd verdund met DEPC-behandeld water om 1% agaroseoplossing te maken. Vervolgens werd de oplossing 5 minuten verhit in een magnetron om de agarose volledig op te lossen. Toen de temperatuur van de agaroseoplossing daalde tot 55 °C, werd ethidiumbromide (EB, 0,5 μg/mL) oplossing in een volumeverhouding van 10.000:1 toegevoegd en uniform gemengd, waarna de agaroseoplossing door afkoeling agarosegel vormde. Het PEG-GO-PEI, PEG-GO-PEI-FA en siRNA-mengsel bij verschillende gewichtsverhoudingen werden in de put toegevoegd. Het gel werd uitgevoerd bij 110 V en 40 mA gedurende ongeveer 60 minuten, en vervolgens waargenomen en geanalyseerd met een ultravioletbeelder.

Celopnamestudie van PEG-GO-PEI-FA

Om de celopname te onderzoeken, werden de nanocomplexen gelabeld met FITC volgens een eerder beschreven methode met een kleine aanpassing [28]. Kortweg, de oplossing van nanocomplexen (ongeveer 1 mg/mL, 2,0 mL) werd gemengd met 0,2 mL FITC (26 mM) opgelost in DMSO en daarna over nacht geroerd bij kamertemperatuur. De resulterende mengsels werden gedialyseerd door een 5000 MWCO-membraan om ongelabelde FITC te verwijderen en vervolgens vriesgedroogd. De cellen werden gezaaid in een 6-putplaat (met dekkers) met een dichtheid van 2 × 10⁵ cellen/put in 2 mL 1640-medium met 10% FBS en vervolgens 12 uur geïncueerd bij 37 °C in een celkweekincubator. Vervolgens werd het medium in elke put vervangen door serumvrij 1640-medium. Daarna werden de cellen behandeld met verschillende nanocomplexen/FITC. Cellen zonder nanocomplexen zijn de controlegroep, en cellen behandeld met PEI 25K zijn de parallelle controlegroep. Na incubatie gedurende 4 uur bij 37 °C in een verzadigde atmosfeer met 5% CO₂, werd het vloeistof van de kweekplaat verwijderd, de cellen tweemaal gewassen met koude DPBS (pH = 7,4), daarna werden 20 μL DAPI en 5 μL Dil (cytomembraankleuring) aan elke put toegevoegd en 20 minuten geïncueerd bij 37 °C in het donker. Vervolgens werden de DAPI en Dil van het kweekmedium verwijderd en tweemaal gewassen met koude DPBS (pH = 7,4), en de dekkers van de cellen werden genomen en op een objectglas vastgemaakt met Permount TM Mounting Medium. Hierna werd het fluorescentsignaal van de objectglazen van de cellen waargenomen met een confocale laserscanningmicroscoop (CLSM) en de celopname van nanocomplexen geanalyseerd.

Endosomale ontsnapping en penetratie in de celkern

Om de cellulaire distributie, endosomale ontsnapping en penetratie van nanocomplexen te visualiseren, werden SKOV3-cellen gezaaid in een 12-putplaat (met dekkers) met een dichtheid van 1 × 10⁵ cellen/put in 2 mL 1640-medium met 10% FBS en vervolgens 12 uur geïncueerd (37 °C, 5% CO₂). Vervolgens werd het medium in elke put vervangen door 1 mL/put serumvrij 1640-medium. Daarna werden de verschillende nanocomplexen (100 μg/mL) gelabeld met FITC in de 12-putplaat voor 1 mL/put toegevoegd. Na 6 uur werd het vloeistof verwijderd, cellen tweemaal gewassen met koude DPBS (pH = 7,4), en de 12-putplaat werd LysoTracker Red (5 μg/mL) voor 50 μL/put toegevoegd. Na incubatie gedurende 15 minuten bij 37 °C in een verzadigde atmosfeer met 5% CO₂, werd het vloeistof van de 12-putplaat verwijderd, de cellen tweemaal gewassen met koude DPBS (pH = 7,4), daarna werd 20 μL DAPI aan elke put toegevoegd en 20 minuten geïncueerd bij 4 °C in het donker. Vervolgens werd het DAPI-vloeistof verwijderd en tweemaal gewassen met koude DPBS (pH = 7,4). Na fixatie met 4% paraformaledehyde gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur, werden de dekkers genomen en op een objectglas vastgemaakt met Permount TM Mounting Medium. Het fluorescentsignaal van de objectglazen werd waargenomen met confocale laserscanningmicroscopie en de lysosomale ontsnapping en penetratie in de celkern van nanocomplexen geanalyseerd [29].

Cyto-inhibitieanalyse

We analyseerden het celinhibitie-effect van PEG-GO-PEI/siRNA en PEG-GO-PEI-FA/siRNA met de CCK-8-test. Kortweg, de cellen werden gezaaid in een 96-putplaat met een dichtheid van 6 × 10³ cellen/put in 100 μL 1640-medium met 10% FBS en vervolgens 12 uur geïncueerd bij 37 °C in een verzadigde atmosfeer met 5% CO₂. Vervolgens werden PEG-GO-PEI en PEG-GO-PEI-FA toegevoegd bij finale concentraties variërend van 10 tot 500 μg/mL en 12 en 24 uur extra geïncueerd met de cellen. Daarna werden PEG-GO-PEI/siRNA en PEG-GO-PEI-FA/siRNA geïncueerd met cellen van 4 tot 48 uur bij een concentratie van 100 μg/mL. De siRNA werd getransfecteerd met Lipofectamine 2000 en onbehandeld als controlegroep. Vervolgens werd 10 μL CCK-8 aan elke put toegevoegd en 3 uur geïncueerd bij 37 °C. De absorbantie werd gemeten bij 450 nm. Elke groepsproef werd driemaal herhaald. De inhibitiepercentage (%) werd berekend als 1 − (absorbantie van monster − absorbantie van blanco) / (absorbantie van controle − absorbantie van blanco) × 100%.

Statistiek

Elk experiment werd driemaal herhaald, en de gegevens werden geanalyseerd met SPSS 17.0-software. Een eenzijdige ANOVA-toets voor meervoudige groepsanalyse en een ongepaarde Student's t-toets voor tweegroepsanalyse werden gebruikt voor vergelijking. De gegevens werden uitgedrukt als gemiddelde en standaarddeviatie (SD), en de statistische significantie was ingesteld op p < 0,05.

Resultaten en discussie

Synthese van PEG-GO-PEI-FA

De expressie van FR werd eerst geanalyseerd in verschillende kankercellijnen op basis van de Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE; https://portals.broadinstitute.org/ccle) database [30] en verschillende ovariumweefsels op basis van de Gene Expression Profiling Interactive Analysis (GEPIA2; https://gepia2.cancer-pku.cn) database [31]. De resultaten waren consistent met eerdere onderzoeken (Figuur S1). Daarom kozen we FA als targeteringsligand voor gendelivery.

Grafeneoxide bevat zeker veel zuurstofhoudende groepen waaronder carboxylgroepen aan de rand, hydroxylegroepen en epoxygroepen op het basale vlak geproduceerd door het oxidatieproces [32]. Om nanoschaal GO (NGO) te verkrijgen, werd GO continu gekraakt door badsonicatie bij 50 W gedurende 2 uur en vervolgens covaleent gekoppeld aan PEG/PEI/FA aan GO met behulp van EDC/NHS-chemie, zoals geïllustreerd in Figuur S2(A). Figuur S2(B) toonde de behandelingsroute van PEG-GO-PEI-FA/siRNA. De analyse van de chemische conjugatie werd uitgevoerd met FTIR-differentiespectrotechnologie om de spectrale absorptiepieken te verkrijgen [33]. Zoals getoond in Fig. 1a, werd het bestaan van OH (3425 cm⁻¹), C=O (1719 cm⁻¹) en C=H (1350 cm⁻¹) functionele groepen gevonden in GO en duidde op het bestaan van hydroxyle en carboxyl in het oppervlak van GO. CH (2885 cm⁻¹) rekvibratieband kon worden gevonden toen PEG reageerde met GO via stabiele covalente bindingen; dit duidde erop dat PEG was gegrifteerd aan GO, en de PEG-conjugatie-efficiëntie was ongeveer 6%. Na reactie van PEI en FA met GO, werd de NH (1590 cm⁻¹), C–N (1420 cm⁻¹) rekvibratieband waargenomen, wat aangeeft dat PEI en FA waren gegrifteerd aan GO door esterificatie. Deze resultaten toonden aan dat de conjugatie PEG-GO-PEI-FA succesvol was gesynthetiseerd.

Figuur 1b toonde de UV-Vis-absorptiespectra van GO, FA, GO-PEG, PEG-GO-PEI en PEG-GO-PEI-FA. GO had een absorptiepiek van 223 nm. FA had een absorptiepiek van 275 nm. GO-PEG toonde een gladde curve, wat aangeeft dat PEG geconjugeerd was met GO en de berg van GO gladder maakte. PEG-GO-PEI had een absorptiepiek bij 219 nm, wat illustreert dat PEI was gegrifteerd aan het oppervlak van GO-PEG. PEG-GO-PEI-FA had absorptiepieken bij 219 nm en 275 nm, wat onthulde dat FA was gegrifteerd aan PEG-GO-PEI. Al deze resultaten bevestigden verder de succesvolle synthese van PEG-GO-PEI-FA.

Karakterisering van PEG-GO-PEI-FA

De gegevens in Tabel 1 toonden de deeltjesgrootte en zeta-potentieel van de nanocomplexen. De deeltjesgrootte van nanocomplexen nam geleidelijk toe tot 218,4 nm toen PEG, PEI en FA progressief aan het oppervlak van GO werden gegrifteerd. Het zeta-potentieel veranderde van −16,5 naar +17,5 mV toen PEI aan GO werd gekoppeld, wat de capaciteit vergemakkelijkte om negatief geladen DNA of RNA via elektrostatische interactie en cellulair opname te adsorberen. De zeta-potentialen van PEG-GO-PEI-FA en PEG-GO-PEI-FA/siRNA waren respectievelijk +14,7 mV en +14,5 mV. De zeta-potentialen onthulden dat PEG-GO-PEI-FA of PEG-GO-PEI-FA/siRNA kleiner waren dan PEG-GO-PEI vanwege de negatieve lading van FA en siRNA. Dit duidde erop dat PEG-GO-PEI-FA/siRNA geadsorbeerd kon worden aan het oppervlak van cellen door ladinginteractie en gebruikt kon worden door receptor-gemedieerde endocytose op het cytomembraan [34].

De oppervlaktemorfologie en deeltjesgrootte van de nanodrager werden ook gemeten met AFM en DLS. Zoals getoond in Fig. 2a, vertoonde GO een glad oppervlak en bladstructuur met een deeltjesgrootte van 192,1 nm. Na het griften van PEG, PEI en FA aan het oppervlak van GO, nam de deeltjesgrootte van PEG-GO-PEI-FA toe tot 216,1 nm, en werden veel uitstulpingen waargenomen op het oppervlak van PEG-GO-PEI-FA (Fig. 2b), wat suggereerde dat een groot aantal decoraties geïmmobiliseerd waren op de GO-bladen. Tegelijkertijd was de hoogte van PEG-GO-PEI-FA groter dan die van GO, wat voornamelijk te wijten is aan de hechting van PEG, PEI en FA aan beide vlakken van het GO-blad.

Ramanspectroscopie is een van de meest gebruikte methoden om de karakterisering en structurele eigenschappen van nanokoolstofmaterialen te meten [35]. Zoals getoond in Fig. 2c, toonde het Ramanspectrum van GO de vibratiebanden op 1600 cm⁻¹ (G-band) en 1354 cm⁻¹ (D-band), en de oppervlakteverhouding ID/IG was 1,0385, wat aangeeft dat het deel SP²-hybridisatie van GO gebroken was en hydroxyle en carboxyl was gevormd. GO-PEG en PEG-GO-PEI toonden vibratiebanden op 1595 cm⁻¹ (G-band) en 1352 cm⁻¹ (D-band), en de oppervlakteverhoudingen ID/IG waren respectievelijk 0,7737 en 0,5238. De oppervlakteverhouding ID/IG nam geleidelijk af naarmate PEG en PEI reageerden met GO; dit duidde erop dat PEG en PEI aan het oppervlak van GO waren gegrifteerd.

In vitro bioveiligheidsanalyse van de verschillende functionele NGO

De bioveiligheid van niet-virale genvectoren is een significante uitdaging voor klinische toepassingen gebleven. De hoge positieve ladingen brachten niet alleen een uitstekende capaciteit om genen te condenseren en te beschermen, maar leidden ook tot ernstige cytotoxiciteit [36, 37]. Om de cytotoxiciteit van vrije siRNA-nanocomplexen te testen, werd de CCK-8-test uitgevoerd met SKOV3-cellen die 4, 8, 12 en 24 uur geïncueerd waren met vrije nanocomplexen bij verschillende concentraties (van 10 tot 1000 μg/mL). Zoals getoond in Figuur S3, hadden de nanocomplexen nog steeds een hoge cellevendbaarheid in eierstokkanker bij 1000 μg/mL en 24 uur. De cytotoxiciteit van alle nanocomplexen vertoonde een tijds- en concentratie-afhankelijke manier (levendbaarheid van SKOV3-cellen: groter dan of gelijk aan 84,38% voor alle nanocomplexen bij 1000 μg/mL, en groter dan of gelijk aan 94,21% voor alle nanocomplexen bij 24 uur met SKOV3-cellen). Deze resultaten suggereerden dat de nanocomplexen verwaarloosbare cytotoxiciteit vertoonden en kunnen dienen als biocompatibele genvector.

Analyse van nanocomplexen gecombineerd met siRNA

Cellulaire opname van vrije RNA-moleculen is meestal lastig door de substantiële negatieve ladingen die ze dragen [38]. Het laden van negatief geladen biomoleculen door kationische polymeren wordt breed toegepast om het probleem op te lossen [39]. In dit artikel werd het laden van siRNA op de PEG-GO-PEI-FA-vector bereikt door siRNA en PEG-GO-PEI-FA in waterige oplossing te mengen. Zoals getoond in Tabel 1, was het zeta-potentieel van PEG-GO-PEI-FA +14,7 mV, wat aangeeft dat siRNA geadsorbeerd kan worden aan het oppervlak van PEG-GO-PEI-FA door elektrostatische interactie. In deze studie werd de gencondensatiecapaciteit van de nanocomplexen beoordeeld met agarosegelelektroforese [40]. Figuur 3a toonde aan dat PEG-GO-PEI duidelijke condensatiecapaciteit had ten aanzien van siRNA bij een gewichtsverhouding van 10, terwijl de volledige remming van siRNA-migratie door PEG-GO-PEI-FA werd waargenomen toen de gewichtsverhouding 20 bereikte (Fig. 3b). Dus, PEG-GO-PEI-FA kon siRNA beschermen tegen degradatie, maar had tegelijkertijd iets meer nanocomplex nodig om goede bindingscapaciteit te demonstreren. Dit is misschien geassocieerd met de zeta-potentialen van PEG-GO-PEI-FA die niet zo hoog waren. Deze resultaten gaven aan dat PEG-GO-PEI en PEG-GO-PEI-FA voldoende delivercapaciteit hadden, met name PEG-GO-PEI-FA, wat verder zijn potentieel als geldige vector voor efficiënte en veilige gendelivery toonde.

Cellulaire opnameanalyse

Het is cruciaal of dragers specifiek tumoren kunnen targeten voor gendelivery. Om te bevestigen of de PEG-GO-PEI-FA-drager gemakkelijk cellen kon binnendringen, gebruikten we FITC als fluorescente sonde voor intracellulaire imaging. Tegelijkertijd werden de kernen gekleurd met DAPI en het cytomembraan met Dil. Zoals getoond in Fig. 4, toonden de controlegroep en PEG-GO-PEI-groep geen groene fluorescentsignalen rond de kernen en het cytomembraan. Dit impliceerde dat PEG-GO-PEI de cellen niet binnenging. PEI 25K en PEG-GO-PEI-FA/siRNA verschenen als groene fluorescentsignaal rond de kern, wat duidelijk aangaf dat PEG-GO-PEI-FA celmembranen kon doordringen en cellen kon binnengaan. De PEG-GO-PEI-FA-nanocomplexen toonden de meest actieve celopname, waarschijnlijk te wijten aan het feit dat FA specifiek FR kan binden die overexprimeerd is op het oppervlak van SKOV3-cellen. Deze resultaten suggereerden dat FA een cruciale rol speelde bij het medieren van de efficiënte celopname van PEG-GO-PEI-FA en PEG-GO-PEI-FA/siRNA-nanocomplexen. Belangrijker nog, de capaciteit van FA om zijn receptor te binden, werd niet beïnvloed door de covalente amidebinding, en de receptor-gemedieerde endocytose was ongehinderd.

Lysosomale ontsnappingsanalyse

Voor het siRNA-deliverysysteem moeten ze uit het endosoom of gevormde lysosom ontsnappen. Als niet, zal het siRNA afbreken of uit de cel worden uitgeplast [41-43]. We evalueerden de endosomale ontsnappingscapaciteit door intracellulaire localisatie van de nanocomplexen met CLSM. Aangezien veel rapporten hebben aangetoond dat PEI 25K endosomale of lysosomale ontsnapping kan bevorderen door het "proton-spons-effect" [44], werd PEI 25K als controle gebruikt. In deze studie werden de nanocomplexen gelabeld met FITC. Ten eerste schatten we de nanocomplexen in het lysosom in door het gele signaal dat het groene fluorescente signaal van FITC overlapt met het rode fluorescente signaal van LysoTracker Red. PEI 25K verschenen als het gele signaal na 4 uur incubatie met cellen en andere materialen verschenen als het gele signaal na 2 uur incubatie met cellen, wat impliceerde dat de materialen de cellen waren binnengedrongen (Fig. 5). Of de nanocomplexen uit het lysosom ontsnapten, werd bepaald door het heldere cyaansignaal, het groene fluorescente signaal van FITC gecombineerd met het blauwe fluorescente signaal van DAPI. Zoals getoond in Fig. 5a, werd het groene signaal waargenopd in de accumulatie in de kernen, en er was een helder cyaansignaal na PEI/siRNA-incubatie gedurende 8 uur met cellen, wat aangeeft dat PEI/siRNA uit het lysosom was ontsnapt. Echter, PEG-GO-PEI-FA en PEG-GO-PEI-FA/siRNA hadden al na 2 uur een zwak groen signaal dat de kernen binnendraagde, en meer groen signaal accumuleerde in de kernen naarmate de incubatietijd toenam. En er was een helder cyaansignaal toen PEG-GO-PEI-FA en PEG-GO-PEI-FA/siRNA 4 uur met cellen geïncueerd waren (Fig. 5b, c). Dit duidde erop dat de materialen zo vroeg uit het lysosom waren ontsnapt. Samengevat toonden deze resultaten aan dat PEG-GO-PEI-FA en PEG-GO-PEI-FA/siRNA een uitstekende endosomale of lysosomale ontsnappingscapaciteit behielden en efficiënt lysosomale ontsnapping en gentransfectie in vitro kunnen faciliteren.

Cel-inhibitie-evaluatie van PEG-GO-PEI-FA/siRNA

In het huidige geval werd het therapeutische effect van PEG-GO-PEI-FA/siRNA onderzocht met de CCK-8-test op SKOV3-cellen in vitro. Zoals getoond in Fig. 6a, vonden we geen significante invloed op de overlevingscijfer van tumorcellen bij verschillende concentraties (10–100 μg/mL) en verschillende tijdstippen (12 en 24 uur) in de PEG-GO-PEI-FA-groep. Zelfs als de concentratie boven 100 μg/mL was, was het overlevingscijfer van tumorcellen nog steeds meer dan 80%. Dus kozen we 100 μg/mL voor de volgende cellulair inhibitie-studie. Zwakkere cytotoxiciteit werd vertoond in de PEG-GO-PEI/siRNA- en Lipo2000/siRNA-groep (de inhibitiepercentage van minder dan 20%). Vergeleken met PEG-GO-PEI/siRNA en Lipo2000/siRNA, had PEG-GO-PEI-FA/siRNA een significante inhibitieve effect op de groei van SKOV3-tumorcellen. PEG-GO-PEI-FA/siRNA remde SKOV3-cellen op een tijdsafhankelijke manier (Fig. 6b). Deze resultaten gaven aan dat PEG-GO-PEI-FA/siRNA het beste inhibitie-effect had voor de toename van tumorcellen en we PEG-GO-PEI-FA kunnen gebruiken als een ideale nanodrager voor gendelivery.

Conclusies

In deze studie synthetiseerden we succesvol een nieuw gendeliverysysteem, PEG-GO-PEI-FA. De niet-cytotoxische natuur en uitstekende biologische compatibiliteit van PEG-GO-PEI-FA garandeerden zijn vooruitzichten als veilige en effectieve gendeliveryvector. PEG-GO-PEI-FA/siRNA-nanocomplexen vertoonden uitstekende fysicochemische eigenschappen voor gerichte gendelivery. Bovendien konden PEG-GO-PEI-FA/siRNA gemakkelijk SKOV3-eierstokkankercellen binnengaan en uit de lysosomen ontsnappen. Cytotoxiciteitstesten toonden aan dat PEG-GO-PEI-FA/siRNA een goede inhibitie-effect had op eierstokkankercellen op een tijdsafhankelijke manier, en een hogere cytotoxiciteit vertoonde vergeleken met andere groepen. Op basis van de bovengenoemde resultaten kan PEG-GO-PEI-FA goede verwachting bieden als genvector voor gerichte gendelivery en meer effectieve strategie in eierstokcarcinoombehandelingen.