Taurine-gefunctionaliseerde grafene-oxide voor 5-fluorouracil-afgifte: Fabricatie, karakterisering & antikankerwirksamheid

Samenvatting

Onlangs zijn nanodrager-systemen voor kankermedicijnen, met name GO-gebaseerde medicijnafgiftesystemen, een zegen geworden voor kankerpatiënten. In deze studie kiezen we Taurine (Tau) om het GO-oppervlak te functionaliseren om de biocompatibiliteit te verbeteren. Allereerst werd nano-schaal GO gesynthetiseerd door de gewijzigde Hummers-methode en ultrasone stripping-methode. De taurine-gemodificeerde grafene-oxide drager (Tau-GO) werd gesynthetiseerd door een chemische methode om Tau-GO te verkrijgen dat een goede disperseerbaarheid en stabiliteit in water heeft, met een zetapotentiaal van -38,8 mV en een deeltjesgrootte van 242 nm. Op basis van de encapsulatie-efficiëntie-evaluatiecriteria werd de optimale formulering bepaald om Tau-GO en 5-FU te combineren door niet-covalente binding. De 5-FU-Tau-GO was stabieler in neutrale omgeving dan in zure omgeving, en met een zekere pH-respons en gecontroleerde afgifte. In vivo vergeleken we orale en intraveneuze toediening van 5-FU en 5-FU-Tau-GO, respectievelijk, met behulp van farmacokinetische tests en gerelateerde parameters en toonden aan dat 5-FU-Tau-GO orale of intraveneuze toediening de werkzame tijd van 5-FU in het lichaam verlengt en de biobeschikbaarheid verbetert. Daarnaast toonde de remming van HepG2-cellen die gemeten werd door de MTT-test, dat de IC₅₀-waarde van 5-FU 196 ± 8,73 µg/mL was, en de IC₅₀-waarde van 5-FU-Tau-GO 65,2 ± 0,7 µg/mL was, wat aangeeft dat 5-FU-Tau-GO krachtiger is tegen HepG2-cellen en een sterkere remmende werking op kankercellen heeft. Het effect op celmorfologie dat gemeten werd met AO/EB-kleuring toonde ook aan dat 5-FU-Tau-GO niet alleen cellen disrupteerde, maar ook significant apoptose induceerde vergeleken met 5-FU. We verifieerden ook door computergestuurd ontwerp dat Tau-GO beter kan binden aan 5-FU dan aan ongemodificeerde GO, en dat het gevormde 5-FU-Tau-GO-systeem stabieler is en bevorderlijk voor de overdracht en afgifte van 5-FU in vivo.

Inleiding

Chemotherapie is nog steeds een veelvoorkomende methode die gebruikt wordt in de behandeling van diverse kankers. Een significante obstakel van de meeste chemotherapeutische middelen is hun onvermogen om tumorweefsels te penetreren op effectieve concentraties, of hun ongewenste bijwerkingen op normale weefsels. Daarom hebben wetenschappers hun inspanningen geconcentreerd op de ontwikkeling van een krachtig medicijnafgiftesysteem dat een gecontroleerde afgiftesnelheid van medicijnen in tumorweefsels kan bereiken om effectieve medicijnafgifte en therapie te waarborgen.

Veel nanoschaal materialen waaronder liposomen, polymeren, nanopartikelen, dendrimeren, micellen en grafene-oxide zijn ontwikkeld voor de afgifte van diverse medicijnen. Onder deze nanomaterialen is grafene-oxide (GO) een nieuw koolstof-nanomateriaal dat chemisch geëxfolieerd wordt van geoxideerd grafiet en diverse fascinerende fysieke en chemische eigenschappen vertoont, zoals overvloedige functionele groepen, grote specifieke oppervlakte, hoge medicijnlading en uitstekende disperseerbaarheid in water. Bovendien toonden de meeste in vitro experimentele resultaten aan dat een lage GO-concentratie als substraat voor celdeling kan dienen en immuuncellen kan activeren. Daarom is GO breed gebruikt in ziekte-diagnostiek, kankercel-imaging en -tracking, kanker-fotothermische therapie, weefseltechniek, gerichte medicijnafgifte en vooral als anti-tumor medicijndrager. Echter, verscheidene onderzoeksgroepen hebben gerapporteerd dat een hoge GO-concentratie duidelijke cytotoxische effecten heeft in preklinische en klinische studies. Het mechanisme waarmee GO toxische effecten in vivo produceert is door oxidatieve stress en de overproductie van intracellulaire reactieve zuurstofsoorten, wat celdood induceert en ernstige ontsteking, longodem en granuloma-vorming veroorzaakt. Daarom is het van kritisch belang om het GO-toxiciteitsprobleem op te lossen.

Gerapporteerd kan de functionalisatie van covalente of niet-covalente bindingen de sterke hydrofobe interactie tussen GO en cellen verminderen. Dit werd gedemonstreerd door verschillende studies die toonden dat GO-functionalizering de biocompatibiliteit verbetert en de toxiciteit in vivo en in vitro bijna elimineert. Yang et al. bestudeerden voor het eerst de langetermijn-biodistributie van covalent geconjugeerd PEG-GO in muizen met een radiolabelmethode, en de resultaten toonden aan dat PEG-GO geleidelijk uit muizen kon worden uitgeplast, waarschijnlijk in urine en feces. Zhang et al. vergeleken DEX-gefunctionaliseerde GO met GO en vonden dat GO-DEX de celtoxiciteit aanzienlijk kon verminderen en voornamelijk binnen een week uit muizen werd gecleard. Daarnaast resulteert GO niet-covalente binding aan pluronic F127 in gunstige oplosbaarheid en stabiliteit in fysiologische condities en een lage toxiciteit. Hoewel verschillende polymeren of moleculen zijn gebruikt om GO te functionaliseren, zijn significante resultaten behaald in dit veld. Echter, inspanningen zijn nog steeds nodig om eenvoudige methoden te ontwikkelen om een goed biocompatibel GO-gebaseerd medicijndrager te construeren.

Taurine (Tau) is een semi-essentiële aminozuur met goede stabiliteit en wateroplosbaarheid. Tau kan hart- en cerebrovasculaire ziekten voorkomen, visuele functie handhaven, cellen beschermen en immuniteit reguleren. Talloze studies hebben voorgesteld dat Tau antitumoreigenschappen heeft door de regulatie van de expressiefactoren die een belangrijke rol spelen in diverse kankers, waaronder long, maag, darm en borstkanker. Dus kan Tau-gefunctionaliseerde GO een superieure rol uitoefenen als anti-tumor medicijndrager. In dit artikel gebruiken we voor het eerst covalente Tau-gefunctionaliseerde GO als nanodrager en evalueerden de cytotoxiciteit in vitro. Verder werd 5-fluorouracil (5-FU) gebruikt als antikankermedicijn dat niet-covalent geladen werd op het oppervlak van Tau-GO om een medicijnafgiftesysteem te bouwen. De 5-FU-Tau-GO kon niet alleen de bijwerkingen op normale weefsels verminderen, maar ook de medicijnbiobeschikbaarheid verbeteren. Gevolgd werd Tau-GO met succes ontwikkeld als een nieuw GO-gebaseerd nanomateriaal dat in de toekomst significante biomedische toepassingen kan hebben.

Experimenten en Methodes

Materialen

Het grafietpoeder, fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en dimethylsulfoxide (DMSO) werden aangeschaft bij Tianjin Laibo Chemical Co., Ltd.; Carbodiimide (EDC), N-hydroxysuccinimide (NHS), zoutzuur (HCl) en waterstofperoxide (H₂O₂ 30%) werden aangeschaft bij Shandong Yuwang Industrial Co., Ltd.; Taurine (Tau), 5-fluorouracil (5-FU), humane hepatoma-cellen (HepG2), penicilline-streptomycine oplossing en foetaal kalfserum (FBS) werden aangeschaft bij Dalian Meilun Biotechnology Co., Ltd.; zwavelzuur (H₂SO₄ 98%) en kaliumpermanganaat (KMnO₄) werden aangeschaft bij Nanjing Chemical Reagent Co., Ltd.; natriumnitraat (NaNO₃) en natriumdodecylsulfate (SDS-Na) werden aangeschaft bij Shanghai Jinjinle Industrial Co., Ltd.; MTT werd aangeschaft bij Sigma-Aldrich, Inc; DMEM werd aangeschaft bij HyClone, Inc; De ratten werden aangeschaft bij het Benxi Changsheng Experimenteel Dierencentrum. Alle overige reagensia en chemicaliën waren analytisch zuiver en commercieel verkrijgbaar.

GO-synthese

De GO werd bereid uit grafietpoeder volgens een gewijzigde Hummers-methode. Allereerst werd 168 mL 98% zwavelzuur toegevoegd langs de fleswand van een driehalsige fles die in een ijsbad met thermometer werd geplaatst, en 5 g grafiet en 4 g natriumnitraat werden toegevoegd toen de temperatuur 5 °C bereikte. Vervolgens werd 22,5 g kaliumpermanganaat langzaam in porties gedurende 1 uur toegevoegd en de temperatuur werd onder 5 °C gehouden. Daarna werd de driehalsige fles overgebracht naar een oliebad en het verkregen mengsel werd 30 minuten gereageerd bij 35 °C, daarna werd de temperatuur verhoogd tot 65 °C en het mengsel 30 minuten geroerd. Volgend deze stap werd de temperatuur verhoogd tot 85 °C en het mengsel verder 1 uur gereageerd om een paarsbruine pasta te verkrijgen. Dit mengsel werd 1 week bij kamertemperatuur laten staan, overgebracht naar een beker met 700 mL heet water, en 30% waterstofperoxide werd druppelgewijs toegevoegd tot het geelbruin werd. Het mengsel werd gecentrifugeerd bij 10.000 omw/min, gewassen met heet water, en dit proces werd herhaald tot de pH van de supernatans 7,0 was. Ten slotte werd het product gedroogd in een vacuümvriesdroger en de nano GO verkregen.

Tau-GO-synthese

Een nauwkeurig afgewogen 50 mg GO werd opgelost in 50 mL gedestilleerd water, en 150 mg EDC en 100 mg NHS werden toegevoegd om de GO te activeren door ultrasone behandeling in een ijswaterbad voor 20 min. Vervolgens werd 10 mL Tau waterige oplossing (0,1 g/mL) langzaam (druppelgewijs) toegevoegd aan de voorbereide GO waterige oplossing, en de pH werd aangepast tot 6-7 door HCl en continu 24 uur bij kamertemperatuur in het donker geroerd. Het product werd verzameld door centrifugatie bij 5000 omw/min voor 10 min en 3 keer gewassen met gedestilleerd water. De Tau-GO werd verzameld na vriesdrogen.

5-FU-lading

Een hoeveelheid van 20 ml Tau-GO-oplossing werd 2 uur geultrasoniceerd. Een nauwkeurig afgewogen hoeveelheid 5-FU werd opgelost in een passende hoeveelheid gedestilleerd water, en langzaam druppelgewijs toegevoegd aan de voorbereide Tau-GO-oplossing onder roeren bij kamertemperatuur, vervolgens 1,5 uur geultrasoniceerd bij 30 °C in het donker. De producten werden gecentrifugeerd bij 5000 omw/min voor 10 min bij 4 °C. De onderlaag werd gewassen met 20 mL gedestilleerd water en gecentrifugeerd (5000 omw/min voor 10 min bij 4 °C), en het proces werd 3 keer herhaald. De onderlaag werd vriedroogd, de supernatans werd in een beker geplaatst, het volume gewogen, de concentratie van 5-FU werd bepaald door een 1200 HPLC (Agilent, VS). De detectiecondities waren als volgt: chromatografische kolom: C18 (4,6 × 250 nm, 5 µm); kolomtemperatuur: 25 °C; mobiele fase: 0,1% KH₂PO₄ oplossing met pH 5,5; flowsnelheid: 1,0 mL/min; injectievolume: 20 µL; en meetgolf lengte: 265 nm. De encapsulatieverhouding (EE) en de medicijnlade-efficiëntie (LE) werden verkregen door de volgende formule:

$$\begin{aligned} {\text{EE}}\left( \% \right) & = \frac{{M_{1} - C_{1} \times L_{1} }}{{M_{1} }} \times 100\% \\ {\text{LE}}\left( \% \right) & = \frac{{M_{1} - C_{1} \times L_{1} }}{{20C_{0} + M_{1} - C_{1} \times L_{1} }} \times 100\% \\ \end{aligned}$$

De totale dosis 5-FU werd vastgelegd als M₁, de vrije 5-FU-concentratie en volume werden vastgelegd als C₁ en L₁, en de dragerconcentratie werd vastgelegd als C₀.

Karakterisering

Om het voorbereide nanocomposiet te karakteriseren, werden Fourier-transformatie-infrarood (FT-IR) spectra gescand van 4000 tot 400 cm⁻¹ op de IRAffinity-1 spectrometer (Shimadzu, Japan) om de interacties te bevestigen. UV-vis absorptiespectra werden vastgelegd op een UV-3600 Scanning Spectrofotometer (Shimadzu, Japan). De monsters werden opgelost in gedestilleerd water en de deeltjesgroottes, zetapotentialen en PDI-waarden werden verkregen op een Nano-ZS 90 Nano instrument (Malvern, VK). De morfologieën van de monsters werden geanalyseerd met een JEM-2100 transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) (JEOL, Japan). Thermogravimetrische analyses (TGA) werden uitgevoerd met een thermogravimetrische analyzer (NETZSCH, Duitsland) bij een verwarmingssnelheid van 10 °C/min van 0 tot 800 °C onder een stikstofatmosfeer. XRD-meting van monsters werd uitgevoerd door röntgendiffractometer (Bruker, Duitsland) met een koperen CuKα straling (λ = 1,5406 Å) in een wiede hoek met 2θ-hoek. XPS-metingen werden uitgevoerd met een Omicron ESCA Probe met een monochromatische Al Karastraling (Thermo, VS).

In vitro medicijnafgifte

In vitro medicijnafgifte werd uitgevoerd bij pH 1,2 (gesimuleerde maagomgeving), pH 6,5 (gesimuleerde leverkankercelomgeving) en pH 7,4 (simuleer fysiologische omgeving) bij 37 °C (gesimuleerde lichaamstemperatuur), respectievelijk. In het kort, 15 mg van 5-FU-Tau-GO werd in een dialysemembraan geplaatst, gedoopt in 50 mL buffertoplossingen bevattend 0,1% SDS-Na met pH van 1,2, 6,5 en 7,4. Alle monsters werden in een continue schudde waterbad geplaatst bij een snelheid van 100 omw/min en een temperatuur van 37 °C. Op vooraf bepaalde tijdstippen (0 min, 5 min, 10 min, 20 min, 30 min, 1 u, 1,5 u, 2 u, 2,5 u, 3 u, 4 u, 8 u, 12 u, 24 u, 48 u en 72 u) werd 1 mL van elk monster genomen en vervangen door 1 mL verse buffertoplossing bevattend 0,1% SDS-Na om hetzelfde volume van afgiftemedium te handhaven. Het vrijgekomen medium werd gecentrifugeerd en geanalyseerd met 1200 HPLC.

In vitro cytotoxiciteitsstudies

MTT-toets

De MTT-toets werd gebruikt om de cytotoxiciteit van 5-FU, Tau-GO en 5-FU-Tau-GO te evalueren. Kortweg, de humane hepatoma HepG2-cellen werden gekweekt in DEME-medium, aangevuld met 10% FBS en 1% antibiotica (penicilline-streptomycine oplossing) bij 37 °C in een vochtige atmosfeer van 5% CO₂. De cellen werden gezaaid in een 96-gatenplaat bij een dichtheid van 5 × 10³ cellen per put met 100 µL DEME-medium, aangevuld met FBS en antibiotica. De plaat werd 24 uur in een 37 °C vochtige kamer met 5% CO₂ geplaatst. Daarna werd het groeimedium verwijderd en opnieuw gevuld met 100 µL vers medium dat verschillende concentraties (5, 10, 20, 40, 60, 80 en 100 µg/ml) van 5-FU, Tau-GO, 5-FU-Tau-GO, respectievelijk bevatte. Na 24 uur incubatie werden de cellen behandeld met 20 µL MTT-oplossing en verder 4 uur geïncubeerd. Vervolgens werd het medium geaspireerd, en de formazankristallen werden opgelost in 150 µL DMSO. Ten slotte werden de putplaten geschud bij 37 °C voor 15 min in een constante temperatuur oscillator. De optische dichtheid (OD) van elk monster werd gemeten bij 570 nm met een microplaatlezer. De experimenten werden in drievoud uitgevoerd. De celremmingsratio werd berekend uit de resultaten met de volgende formule:

$${\text{Cell}}\;{\text{inhibition}}\;{\text{rate}} = \frac{{{\text{OD}}_{{{\text{control}}}} - {\text{OD}}_{{{\text{treated}}}} }}{{{\text{OD}}_{{{\text{control}}}} }} \times 100\%$$

waarbij OD_control de absorbantie is verkregen door onbehandelde controlecellen, OD_treated de absorbantie is verkregen door behandelde cellen.

AO/EB-kleuringstoets

AO/EB-dubbele kleuring werd gebruikt om de morfologische veranderingen van de cellen die behandeld werden met 5-FU, Tau-GO en 5-FU-Tau-GO te evalueren. Kortweg, HepG2-cellen in een logaritmische groeifase werden gezaaid in een 6-gatenplaat bij een dichtheid van 10.000 cellen per put en gekweekt in een incubator bij 37 °C en onder een 5% CO₂ atmosfeer. Na 24 uur werden de cellen behandeld met een vaste concentratie van 5-FU, Tau-GO of 5-FU-Tau-GO, en verder 24 uur geïncubeerd. Het medium in elke put werd verwijderd en de cellen werden tweemaal gewassen met PBS. Vervolgens werd 1 mL PBS aangevuld met 40 µL fluorescerende kleurstoffen (1 mg/mL AO en 1 mg/mL EB werden gemengd in een verhouding van 1:1) aan elke put toegevoegd en 10 minuten geïncubeerd zonder licht. De gekleurde cellen werden waargenomen onder een fluorescentiemicroscoop en willekeurig afbeeldingen genomen.

Farmacokinetische studie

Alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met het beleid en de principes geformuleerd door het Dierbeschermings- en Ethiekcomité. In totaal 24 mannelijke SD-ratten, met een lichaamsgewicht van 230-270 g, werden 12 uur gevaste en willekeurig verdeeld in 4 groepen vóór medicijintoediening. Groepen A en B werden intraveneus geïnjecteerd met 5-FU en 5-FU-Tau-GO oplossingen, en groepen C en D kregen orale 5-FU en 5-FU-Tau-GO oplossingen, respectievelijk. Alle groepen kregen een dosis van 20 mg/kg. Na medicijintoediening werden bloedmonsters (ongeveer 0,5 mL) verzameld in anticoaguatieve buisjes op gegeven tijdstippen (15 min, 1 u, 2 u, 4 u, 6 u, 8 u, 12 u, 16 u, 24 u en 48 u). De plasmamonsters werden gescheiden door centrifugatie bij 7500 omw/min en bij 4 °C voor 10 min. Vervolgens werden 200 µL plasma en 50 mg (NH₄)₂SO₄ gecombineerd in een buisje (10 µL van 40 µg/mL 5-BrU interne standaardoplossing, afgeblaasd met stikstof in een 40 °C waterbad, 5 min geroteerd en gecentrifugeerd bij 10800 omw/min voor 3 min. Vervolgens werd het buisje toegevoegd met 900 µL ethylacetaat/isopropanol oplossing (85:15, v/v), 3 min geroteerd en gecentrifugeerd bij 10800 omw/min voor 15 min. De supernatans werd verwijderd en gedroogd met stikstof, 100 µL van de mobiele fase werd toegevoegd en het buisje werd 1 min geroteerd. Ten slotte werd de resulterende oplossing verzameld uit de supernatans gemeten door 1200 HPLC.

Moleculaire dynamica simulaties

Moleculaire dynamica simulatie wordt voornamelijk gebruikt om de interactiekracht tussen het medicijn en de drager en het diffusiegedrag van het medicijn te analyseren. De chemische structuur van de 5-FU werd geconstrueerd met Chemdraw van chem office 2014, en de structuren van de Tau-GO en GO werden uitgevoerd in de Polymer en Molecule Builders module met behulp van de Materials Studio moleculaire simulatie software (versie 7.0, Accelrys Inc., VS). Alle gebouwde verbindingen werden geometrisch geoptimaliseerd onder het COMPASS II krachtsveld, en de conformatie met de laagste energie werd geselecteerd als de stabiele conformatie. Een 10 ps, NVT evenwicht werd uitgevoerd voor elk systeem. De simulatie werd uitgevoerd met 100 ps MD om een gebalanceerde structuur te verkrijgen bij 298 K en 101,325 kPa met een stapgrootte van 1 fs. Ten slotte werden de gemiddelde kwadratische verplaatsing (MSD) en cohesieve energiedichtheid (CED) verkregen voor elk systeem, en de diffusiecoëfficiënt (D) werd gegeven door de volgende formule:

$$D = \frac{1}{2d}\mathop {\lim }\limits_{\tau \to \infty } \frac{{\text{d}}}{{{\text{d}}\tau }}\left[ {\left. {r\overrightarrow {\left( t \right)} - r\overrightarrow {\left( 0 \right)} } \right]} \right.^{2}$$

waarbij de d de dimensie van het systeem is, \(r\overrightarrow {\left( t \right)}\) en \(r\overrightarrow {\left( 0 \right)}\) de positievector van het medicijnmolecuul op tijd t en 0 zijn, respectievelijk, \(\left[ {\left. {r\overrightarrow {\left( t \right)} - r\overrightarrow {\left( 0 \right)} } \right]} \right.^{2}\) staat voor MSD.

Resultaten en Discussie

Karakterisering

Het Tau-GO-conjugaaat werd gefabriceerd door een amide-binding van GO en Tau. De succesvolle synthese van het nanocomposiet werd gevalideerd door FT-IR-spectra (Fig. 1). De aanwezigheid van de zuurstoffunctionaliteiten op GO werd bevestigd door de absorptiepieken bij -OH (~3405 cm⁻¹), C=O (1723 cm⁻¹), C=C (1628 cm⁻¹) en C-OH (1391 cm⁻¹). Deze resultaten bewijzen de succesvolle bereiding van GO (Fig. 1a) [25]. Naast enkele GO-karakteristieke pieken, corresponderen de nieuwe pieken bij 1638 cm⁻¹ en 3427 cm⁻¹ met de amidegroep, en de 1164 cm⁻¹ en 1085 cm⁻¹ corresponderen met -SO. Het Tau-GO-spectrum geeft duidelijk aan dat Tau op het GO-oppervlak is gefunctionaliseerd (Fig. 1b). In Fig. 2b werd de karakteristieke piek van -SO₃ bij 1164 cm⁻¹ overstroomd door de werking van waterstofbinding en was niet zichtbaar in de FT-IR-spectra. Daarom werd 5-FU met succes op de Tau-GO geladen.

FT-IR-spectra van GO (a) en Tau-GO (b)

FT-IR-spectra van Tau-GO (a) en 5-FU-Tau-GO (b)

De GO UV-vis absorptiespectra zijn getoond in Fig. 3. De duidelijke absorptiepiek bij 234 nm werd toegeschreven aan de π-π* overgang van de grafene C=C-bindingen. Daarnaast werd de 300 nm schouderpiek toegeschreven aan de n-π* overgang van de grafene-oxide C=O-bindingen op de carboxyl- of carbonylgroep. De twee karakteristieke absorptiepieken bewijzen de succesvolle bereiding van GO.

UV-spectra van GO

De grootte van GO, Tau-GO en 5-FU-Tau-GO zijn getoond in Fig. 4. De zetapotentialen van GO, Tau-GO en 5-FU-Tau-GO zijn getoond in Fig. 5. De grootte van de GO-velletjes was ongeveer 221 nm en de PDI-waarde was ongeveer 0,188, wat aangeeft dat de voorbereide GO een uniforme verdeling en goede stabiliteit heeft. Het zetapotentiaal was ongeveer -33,3 mV, wat aangeeft dat de negatieve lading voornamelijk te wijten is aan de aanwezigheid van veel zuurstofbevattende groepen op het oppervlak. Toen de GO gemodificeerd werd met Tau via amide-binding, vervingen de aminogroepen een deel van de carboxylgroepen en had de -SO₃ een sterkere ionisatievermogen in oplossing, het zetapotentiaal daalde en werd -38,8 mV. De grootte en PDI-waarden van Tau-GO waren ongeveer 242 nm en 0,190. Vervolgens werd 5-FU geladen op Tau-GO door een niet-covalente binding. Het zetapotentiaal was ongeveer -26,7 mV en de absolute waarde was groter dan 20 mV. Bovendien waren de grootte en PDI-waarden van 5-FU-Tau-GO ongeveer 264 nm en 0,182, dit geeft aan dat de elektrostatische afstoting tussen deeltjes groot is, wat niet gemakkelijk aggregatie of neerslag veroorzaakt, en dat Tau een goede wateroplosbaarheid heeft, GO heeft ook een goede wateroplosbaarheid omdat het oppervlak gemodificeerd is door zuurstofbevattende functionele groepen. Het gebruik van Tau-GO-drager om 5-FU te laden verbetert de wateroplosbaarheid van 5-FU aanzienlijk, zodat 5-FU-Tau-GO stabiel in waterige oplossing kan worden gedispergeerd.

Deeltjesgrootte van GO (a), Tau-GO (b) en 5-FU-Tau-GO (c)

Zetapotentialen van GO (a), Tau-GO (b) en 5-FU-Tau-GO (c)

De morfologieën van GO, Tau-GO en 5-FU-Tau-GO werden gekarakteriseerd door TEM (Fig. 6). De GO is een vlakke structuur met rimpels op het oppervlak, wat illustreert dat het een planaire tweedimensionale structuur is (Fig. 6a). Vergeleken met GO, was de grootte van Tau-GO licht toegenomen, maar vertoonde nog steeds een gelaagde structuur (Fig. 6b). De 5-FU-Tau-GO-afbeelding toonde aan dat de materialen niet geaggregeerd of veranderd waren met de initiële gelaagde structuur van GO intact gebleven (Fig. 6c). Gevolgd hadden Tau-GO en 5-FU-Tau-GO een goede stabiliteit.

TEM van GO (a), Tau-GO (b) en 5-FU-Tau-GO (c)

Thermogravimetrische analyse werd gebruikt om de samenstelling van de composieten te kwantificeren. De TGA-krommen van GO en Tau-GO zijn getoond in Fig. 7. GO en Tau-GO hebben restmassa van 39,73% en 34,22% in een stikstofatmosfeer van 800 °C. Daarom, bij vergelijking van de gewichtsveranderingwaarden, werd de inhoud van Tau in Tau-GO bepaald op ongeveer 13%.

TGA van GO en Tau-GO

De XRD-patronen van Tau, GO en Tau-GO zijn getoond in Fig. 8. De karakteristieke piek van GO kan waargenomen worden bij 10,7° van de 2θ-waarde, wat de vorming van GO met volledige oxidatie bevestigt voor sterke chemische oxidatie en exfoliatieproces. Na functionalisatie met Tau op GO-oppervlak, daalde het diffractiepatroon van de piek licht bij 2θ-waarde 8,2. Dit betekent dat GO met succes is gefunctionaliseerd door Tau.

XRD-patronen van Tau, Tau-GO en GO

De C1s XPS-spectra van GO en Tau-GO worden getoond in Fig. 9. De C1s XPS-spectra van GO geven aan dat er een aanzienlijke mate van oxidatie is, met de aanwezigheid van vier koolstofatomen die overeenkomen met verschillende functionele groepen. De C1s XPS-spectra van Tau-GO vertonen ook deze dezelfde koolstofatomen. Daarnaast wijst het verschijnen van C-N-bindingsgerelateerde componentpijken op de aminogroepen, amidegroepen. Deze resultaten geven ook aan dat GO met succes is gefunctionaliseerd door Tau.

C1s XPS-patronen van GO en Tau-GO

Medicijnlading en afgiftegedrag

5-FU geadsorbeerd op Tau-GO-nanodrager via niet-covalente interacties. De 5-FU-kalibratiekromme was y = 62,135x + 21,873 (r = 0,9999), en het bereik was van 6,5 ~ 250 µg/mL. De encapsulatieverhouding (EE) en medicijnlade-efficiëntie (LE) werden bepaald door ongebonden medicijnconcentraties om de medicijnladeprestaties te evalueren. De resultaten toonden aan dat EE toevoeg met de toename van medicijnconcentratie, en dat de hoogste waarde van EE 83,2% was. Volgens de formule was de LE 33,7%, dat wil zeggen 508,52 µg van 5-FU kan geadsorbeerd worden op 1 mg van Tau-GO. Daarom is Tau-GO een veelbelovende medicijndrager die een grote medicijnlading kan bereiken. De mogelijke mechanismen van de hoge ladingscapaciteit van 5-FU op de Tau-GO kunnen samengevat worden door de volgende verklaringen: allereerst wordt Tau gebruikt om GO te functionaliseren en actieve functionele groepen (-SO₃) te introduceren. -SO₃ heeft een sterk ionisatievermogen in de oplossing, wat de agglomeratie tussen GO vermindert en de lading van 5-FU in Tau-GO vergemakkelijkt. Ten tweede is het zetapotentiaal van 5-FU-Tau-GO 12,1 mV verschillend van dat van Tau-GO, wat aangeeft dat 5-FU op het oppervlak van Tau-GO geladen is, en de elektrostatische interactie speelt een belangrijke rol in de lading van 5-FU. Ten slotte zijn er veel vormen van waterstofbindingen tussen 5-FU en Tau-GO-drager, waaronder -COOH in Tau-GO en -NH- in 5-FU, -COOH in Tau-GO en -C=O in 5-FU, -OH in Tau-GO en -NH- in 5-FU, -OH in Tau-GO en -C=O in 5-FU, -COOH en 5-FU in Tau-GO -F in Tau-GO, -COOH in Tau-GO en -F in 5-FU, deze waterstofbindingen maken 5-FU-Tau-GO stabiel in oplossing.

De in vitro cumulatieve afgifte van 5-FU uit de 5-FU-Tau-GO, bij de temperatuur van 37 °C in pH 1,2, 6,5 en 7,4 PBS-oplossing (simuleer maagomgeving, leverkankercelomgeving en fysiologische omgeving, respectievelijk) is getoond in Fig. 10. Het blijkt dat het 5-FU-afgiftegedrag beïnvloed werd door de pH-waarde van de omgeving. In een pH 7,4-buffer was de medicijnafgifte langzaam en continu, en het totale vrijgekomen medicijnbedrag was ongeveer 70,84% na 72 u. In tegenstelling, was het vrijgekomen medicijnbedrag bij pH 7,4 significant lager dan bij pH 1,2 en pH 6,5 op hetzelfde tijdstip. De totale medicijnlading die vrijgekomen was uit de 5-FU-Tau-GO kon bereikt worden op ongeveer 90,29% en 85,75% bij pH 1,2 en pH 6,5, respectievelijk. Dit kan worden toegeschreven aan de π-π-interacties en waterstofbindingen tussen 5-FU en Tau-GO. Hoe lager de pH-waarde, hoe hoger de graad van protonatie van de waterstofbinding. Daarom werd de waterstofbindingskracht gecontroleerd door de pH-waarde, wat leidde tot de afgifte van 5-FU. Dit pH-gevoelige medicijnafgiftesysteem speelt een belangrijke rol in anti-tumor medicijnen en kan de medicijnafgifte in de tumorcel bereiken.

In vitro afgiftekrommen van 5-FU-Tau-GO in fosfaatzoutoplossing bij 37 °C

In vitro cytotoxiciteitsstudies

Om de potentiële toxiciteit en de tumortherapie-efficiëntie van de nanodrager te evalueren, werd in vitro cellevensvatbaarheid uitgevoerd in HepG2-cellen met MTT-toetsen (Fig. 11). De Tau-GO vertoonde geen significante cytotoxiciteit bij verschillende concentraties. Na 5-FU-lading vertoonde de 5-FU-Tau-GO een duidelijke remmende werking, en in dosis-afhankelijke manier, daarom had de nanodrager de capaciteit om anti-tumor medicijnen af te geven. De IC₅₀-waarde van 5-FU-Tau-GO was 65,2 ± 0,7 µg/mL, wat giftiger was dan het vrije 5-FU (196 ± 8,73 µg/mL). Dit kan zijn door de capaciteit van taurine om apoptose in tumorcellen te induceren, waardoor indirect de remmende werking van 5-FU op cellen versterkt wordt. Bovendien kon uit het in vitro afgifte-experiment gezien worden dat 5-FU geladen op de Tau-GO geleidelijk in de cellen vrijgekomen kon worden. Daarom was de effectieve tijd van 5-FU-Tau-GO op cellen langer dan die van vrij 5-FU, en produceerde dus een betere remming.

De levensvatbaarheid van verschillende concentraties van 5-FU, Tau-GO en 5-FU-Tau-GO

AO-fluorescentiemiddel kon groene fluorescentie uitzenden wanneer het door intacte celmembranen passeerde en kernen kleurde, terwijl EB alleen de kern van beschadigde cellen markeerde die een rode/oranje fluorescentie uitzonden. De cellen met vroege en late apoptose presenteerden groenachtig gele of oranje kernen met de AO/EB-kleuring, respectievelijk. Daarom werd AO/EB-kleuring uitgevoerd om te onderzoeken of de celdood geassocieerd was met apoptose met behulp van kenmerken van celmorfologische veranderingen. De resultaten verkregen uit de AO/EB-kleuring worden gepresenteerd in Fig. 12. Controlecellen waren in spindelvorm en met groene kernen. In de celfgroep die gekweekt werd met alleen Tau-GO, waren kleine delen van de kernen ingevallen en met donkergroene of oranje-rode kleuring. Significante oranje of rode apoptotische cellen met chromatinefragmenten en apoptotische lichamen werden waargenomen in de groep met alleen 5-FU. Vergeleken met 5-FU, veroorzaakte 5-FU-Tau-GO meer schade aan de HepG2-celmorfologie, wat niet alleen de cellen brak, maar ook een grote hoeveelheid apoptose in kankercellen veroorzaakte. Zoals te zien is op de afbeeldingen, hadden bijna alle cellen die behandeld werden met 5-FU-Tau-GO, morfologische veranderingen, een groot aantal celfragmenten en apoptotische lichamen, wat aangeeft dat het 5-FU-Tau-GO nanomedicijnafgiftesysteem een goede dodelijke werking had op HepG2-cellen.

De AO/EB van controle (a), Tau-GO (b), 5-FU (c) en 5-FU-Tau-GO (d)

Farmacokinetische studies

De farmacokinetische studies van 5-FU en 5-FU-Tau-GO werden uitgevoerd in SD-ratten. De profielen van 5-FU-concentratie in plasma vs. tijd, na orale toediening, worden gepresenteerd in Fig. 13a. We vonden dat de neiging van de twee krommen vergelijkbaar was, maar de 5-FU-plasmaconcentratie van de 5-FU-Tau-GO-nanodrager was hoger dan die van 5-FU alleen en dit werd waargenomen op elk gemeten tijdstip. Figuur 13b toont de 5-FU in vivo afgifteprofielen via staartvene. De 5-FU-Tau-GO kon gedurende 24 uur continue medicijnafgifte bereiken, en de medicijnconcentratie daalde geleidelijk in de eerste paar uren, wat aangeeft dat 5-FU langzaam vrijkwam.

In vivo farmacokinetische standaardkrommen van 5-FU en 5-FU-Tau-GO via orale toediening (a). In vivo farmacokinetische standaardkromme van 5-FU en 5-FU-Tau-GO via intraveneuze injectie (b)

Het twee-compartmentmodel werd gebruikt om de farmacokinetische parameters van orale of intraveneuze toediening in ratten te analyseren. De farmacokinetische parameters worden gepresenteerd in Tabel 1. Vergeleken met 5-FU, toonde 5-FU-Tau-GO hogere T_1/2β waarden die 2,3 keer zo hoog waren bij orale toediening, en 3,0 keer bij intraveneuze injectie, respectievelijk. Bovendien was de oppervlakte onder de concentratie-tijdkromme (AUC_0−t) van 5-FU-Tau-GO-nanocomplexen ruwweg 2,1-voudig hoger via orale toediening, en 2,8-voudig hoger via intraveneuze injectie vergeleken met die van de 5-FU-oplossing, respectievelijk. Daarom concludeerden we dat 5-FU-Tau-GO de retentietijd van 5-FU in vivo aanzienlijk kan verlengen en de biobeschikbaarheid verbeteren. Daarnaast was de T_1/2β van de 5-FU-Tau-GO-nanocomplexen die orale toediend werden (1,67 ± 1,15 u), langer dan die van intraveneuze injectie (1,33 ± 0,64 u); echter, de AUC_0−t van orale toediening (36,02 ± 1,83 mg/L*u) was lager dan die van intraveneuze injectie (96,50 ± 8,70 mg/L*u). Deze resultaten kunnen te wijten zijn aan twee aspecten: enerzijds, bij intraveneuze injectie komt het medicijn direct in het bloedsysteem voor circulatie en zonder door de gastro-intestinale barrière te passeren voor herverdeling; anderzijds, omdat 5-FU gemakkelijk een zekere schade aan het gastro-intestinale systeem kan veroorzaken, kan het ook de effectieve gebruik van medicijnen in het lichaam beïnvloeden.

MD-simulaties

De docking en moleculaire dynamica van ongemodificeerde GO, Tau-GO en 5-FU werden gesimuleerd door moleculaire docking en moleculaire dynamica simulatie. De moleculaire dockingresultaten van GO, Tau-GO en 5-FU zijn getoond in Fig. 14, waaruit te zien is dat de bindingslengtes van 5-FU en GO en Tau-GO 3,66 Å en 2,602 Å zijn, respectievelijk. Bovendien, uit de berekeningsresultaten, waren de bindingsenergieën van 5-FU aan GO en Tau-GO 47,69 kcal/mol en 25,04 kcal/mol, respectievelijk. Deze gaven aan dat de bindingskracht van Tau-GO en 5-FU sterker was dan die van GO en 5-FU. Dit is te wijten aan Tau-polaire atomen, zoals S en N, die een sterkere niet-covalente binding met 5-FU vormen, wat de kracht tussen Tau-GO en 5-FU sterker maakt.

De moleculaire docking van GO-velletjes met 5-FU (a). De moleculaire docking van Tau-GO met 5-FU (b)

De diagrammen van de moleculaire dynamica simulatie van GO, Tau-GO en 5-FU werden getoond in Fig. 15. Volgens de berekeningsresultaten waren de CED van 5-FU-GO en 5-FU-Tau-GO 2,67*10⁸ en 2,83*10⁸, respectievelijk. Deze resultaten toonden een sterkere interactie tussen het medicijn en de Tau-GO. De grafieken tussen MSD en tijd werden geplottet (Fig. 16) om de diffusiecoëfficiënt via MSD te verkrijgen. De medicijndiffusiecoëfficiënten werden verkregen door de helling gedeeld door 6 als volgt: 0,094 m²/s en 0,058 m²/s. Deze tonen aan dat de kracht tussen Tau-GO en 5-FU sterker is, wat consistent is met de resultaten van de moleculaire docking. Daarom maakt de gefunctionaliseerde GO de hele drager rijker in atomen en groepen; daarom maakt de niet-covalente binding met 5-FU sterker, en het hele systeem stabieler.

Momentopnames van de GO en 5-FU aan het einde van de MD (a). Momentopnames van de Tau-GO en 5-FU aan het einde van de MD (b)

De medicijn MSD-profielen van de GO en 5-FU (a), Tau-GO en 5-FU (b)

Conclusies

Samenvattend, hebben we met succes een Tau-GO-nanocomposiet voorbereid door een eenvoudige chemische methode. GO-functionalizatie met Tau heeft een goede stabiliteit en verbetert de biocompatibiliteit. De unieke structuur en schitterende eigenschappen van Tau-GO-nanodragers bieden grote kansen voor de lading en afgifte van 5-FU. De 5-FU-Tau-GO heeft een potentiële anti-tumor capaciteit en een uitstekende circulatie-tijd van medicijnen. Daarom geloven we dat de modificatie van GO door de drager Tau voor 5-FU-lading, een effectief en toepasbaar instrument is voor het construeren van een 5-FU-Tau-GO nanomedicijnafgiftesysteem voor de afgifte van antikankermedicijnen en anti-tumortherapie.

Beschikbaarheid van Data en Materialen

De datasets die gebruikt en/of geanalyseerd zijn tijdens de huidige studie zijn beschikbaar bij de corresponderende auteur op redelijke verzoek.

Afkortingen

GO:

Grafene-oxide

Tau:

Taurine

5-FU:

5-Fluorouracil

5-FU-Tau-GO:

Taurine-gefunctionaliseerde grafene-oxide laden 5-fluorouracil

EE:

Encapsulatieverhouding

LE:

Medicijnlade-efficiëntie

FT-IR:

Fourier-transformatie-infrarood

TEM:

Transmissie-elektronenmicroscopie

TGA:

Thermogravimetrische analyses

MSD:

Gemiddelde kwadratische verplaatsing

CED:

Cohesieve energiedichtheid