Gobletcel-gemedieerde clearance van metaalnanodeeltjes: Een in vivo-pad versneld door Chinese-kruiden-geïnduceerde diarree

Samenvatting

Ondanks het uitgebreide gebruik van metaalnanodeeltjes in de geneeskunde, blijft hun in vivo-clearance slecht begrepen. In deze studie tonen we aan dat darmgobletcellen (GC's) en maagparietale cellen (PC's) actief een reeks metaalnanodeeltjes - driehoekige zilvernanoplaten, magnetische nanodeeltjes, goudnanostaven en goudnanoclusters - naar de darmlumen transporteren, waar ze via de ontlasting worden uitgeplast. Met behulp van een muismodel met ligatuur van de gemeene galgang (GGG) om de hepatobilière route te blokkeren, lieten we zien dat deze nanodeeltjes zich ophopen in GC's door het hele darmtrakt en, voor zilvernanoplaten en goudnanostaven, ook in PC's. Er werden geen pathologische veranderingen waargenomen in darmweefsels. Bovendien werd de secretiesnelheid van nanodeeltjes uit GC's en PC's aanzienlijk verhoogd in een diarree-model geïnduceerd door een Chinese-kruidenextract, wat een moduleringseffect van gastro-intestinale motiliteit op nanodeeltjesuitscheiding suggereert. Deze bevindingen onthullen een eerder onbekend clearance-pad dat kan bijdragen aan een veiliger ontwerp van nanodeeltjes-gebaseerde therapeutica en diagnostica.

Inleiding

Nanotechnologie heeft zich snel uitgebreid naar farmaceutica, diagnostica en industriële toepassingen, maar de gezondheids- en milieurisico's van ingenieursgestructureerde nanostrukturen blijven onvolledig gedefinieerd. Nanotoxicologie, een multidisciplinair vakgebied, zoekt de interacties tussen nanodeeltjes en biologische systemen in kaart te brengen, potentiële gevaren te beoordelen en veiligheidsrichtlijnen op te stellen [1-3]. Metaalnanodeeltjes - zoals goud, zilver, magnetische en quantum-dot varianten - hebben bijzondere aandacht getrokken vanwege hun optische, magnetische en katalytische eigenschappen, wat gerichte imaging, fotothermale therapie en geneesmiddelafgifte mogelijk maakt [4-10]. Echter, de fysicochemische kenmerken die deze materialen functionaliteit geven, hinderen ook hun biologische afbraak en clearance; de meeste deeltjes groter dan ~5 nm ontlopen renale filtraties, terwijl grotere aggregaten in lever, milt of longweefsel worden opgeslagen [11-12]. Het begrijpen van hoe het lichaam deze deeltjes elimineert is daarom cruciaal voor therapeutische veiligheid en risicobeoordeling.

De huidige kennis over in vivo-clearancepaden is gefragmenteerd. Het hepatobiliair systeem (HBS) levert deeltjes die niet door de nieren kunnen worden afgebroken aan de ontlasting, terwijl de nier-urine route sub-5 nm soorten afhandelt [16,21,22]. Beide routes vertonen echter beperkte efficiëntie voor veel metaalnanodeeltjes, wat onderzoek naar alternatieve mechanismen aanmoedigt. Recente studies suggereren dat de darmwand kan dienen als excretieroute: silica-nanodeeltjes bleven in darmmucosa en ontlasting in een muismodel, terwijl grotere deeltjes (tot 500 nm) sneller werden uitgeplast dan kleinere in vissen, wat aangeeft dat het HBS niet het enige pad is [20,23].

Darmgobletcellen (GC's) zijn gepolariseerde, slijm-afscheidende epitheelecellen die de gehele darm bekleden en beschermen tegen mechanische en chemische schade [24-26]. Eerder werk heeft aangetoond dat GC's nanodeeltjes kunnen internaliseren en dat intraveneus geïnjecteerde deeltjes in GC's kunnen worden gevonden, maar de dynamiek en omvang van dit proces blijven onontgonnen [27-28]. Deze studie heeft tot doel de rol van GC's - en in mindere mate van maagparietale cellen (PC's) - in de excretie van een representatieve set metaalnanodeeltjes te verduidelijken, en te beoordelen hoe gastro-intestinale motiliteit, gemoduleerd door een Chinese-kruiden-geïnduceerd diarree-model, dit pad beïnvloedt.

Materialen en Methodes

Synthese en Karakterisatie van Driehoekige Zilvernanoplaten

Driehoekige zilvernanoplaten werden gesynthetiseerd volgens het protocol van Mirkin et al. met kleine aanpassingen [29,30]. Kortom, AgNO₃ (0,1 mM, 100 mL), trisodiumcitraat (30 mM, 6 mL), PVP (30 kDa, 0,7 mM, 6 mL) en 240 µL H₂O₂ (30 gew.% ) werden bij kamertemperatuur gemengd. Na heftig roeren werd 0,8 mL van een vers bereide 0,1 M NaBH₄-oplossing snel toegevoegd, wat een gele oplossing opleverde die binnen 5 uur onder lichtexpositie blauw werd. De uiteindelijke suspensie werd bij 4 °C opgeslagen.

UV-vis spectra werden opgenomen (200-950 nm, 2 nm spleet) met een Shimadzu UV-3600. TEM-beeldvorming (JEOL JEM-200CX) bevestigde monodisperse driehoekige deeltjes met een gemiddelde randlengte van 44,3 nm (Fig. 1b). De karakteristieke plasmonpiek bij 648,5 nm bevestigde de succesvolle synthese van de driehoekige morfologie [36].

Bereiding van Diermodellen met Ligatuur van de Gemeene Galgang

Vrouwelijke Wistar-ratten (180-220 g) en Kunming-muizen (20-22 g) werden verkregen van Shanghai SLAC Laboratory Animal Co. Ltd. Alle procedures werden goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van Shanghai Jiao Tong University (Nr. SYXK2007-0025). De gemeene galgang (GGG) werd geligueerd volgens de methode van Lee met kleine wijzigingen [34]. Muizen werden geanesthetiseerd met pentobarbitaal (25 mg kg⁻¹), een middenbuikincisie werd gemaakt en de GGG werd blootgelegd. Twee 0,2 mm nylonhechtingen werden onder de gang geplaatst, wat een afgedicht segment creëerde dat vervolgens werd doorgesneden. Op dag 14 na ligatuur werden serumbilirubine en AST gemeten om cholestase te bevestigen (Fig. 2e).

Injectie van Nanodeeltjes

Na bevestiging van succesvolle ligatuur werden 12 muizen willekeurig verdeeld in vier testgroepen (driehoekige zilvernanoplaten, magnetische nanodeeltjes, goudnanostaven, goudnanoclusters) en een zoutoplossing-controle. Nanodeeltjes werden opgeschorst in een concentratie van 550 µg mL⁻¹ en 1 min gesonicereerd voor intraveneuze injectie (150 µL, staartvene). Vijf extra muizen zonder ligatuur dienden als tweede controle.

Weefselverwerking en Beeldvorming

Zeven dagen na injectie werden de muizen geofferd en darm- en maagweefsels geoogst. Coupes (5 µm) werden gefixeerd in 10% formaldehyde, in paraffine inbed en gekleurd met hematoxyline-eosine voor histologie. Voor ultrastructuuranalyse werden weefsels gefixeerd in 2,5% glutaraldehyde, gedehydrateerd, in epoxyhars inbed en onderzocht met hoge-resolutie TEM (FEI Tecnai G2 Spirit Biotwin). Twee-fotonenexcitatie (780 nm) werd gebruikt om goudnanostaven in weefselcoupes te visualiseren via een Caliper IVIS-100 systeem.

Metaalkwantificering

Ontlasting werd dagelijks gedurende 7 dagen verzameld, gewogen en in koningswater verteerd. Metaalgehalte werd gekwantificeerd met ICP-MS (Agilent 7500a). Op dezelfde manier werden darmweefsels verteerd en geanalyseerd op goudgehalte om retentie te beoordelen.

Diarree-model Geïnduceerd door Chinese Kruiden

Een mengsel van sennablaad (10 g), rhabarber (2 g) en kannabisvrucht (1 g) werd gekookt in 100 mL water, gefiltreerd en geconcentreerd tot 0,3 g mL⁻¹. Muizen ontvingen 0,1 mL van dit extract of fysiologische zoutoplossing dagelijks gedurende 7 dagen via orale gavage om diarree te induceren.

Gobletcelanalyse

Darmsegmenten werden in OCT inbed, gecoupeerd (8 µm) en gekleurd met Alcian Blauw/Schiff's reagent om gobletceldichtheid en cavitatie te kwantificeren. Beelden werden vastgelegd met een omgekeerde microscopie.

Resultaten en Discussie

Synthese en Karakterisatie van de Nanodeeltjes

Driehoekige zilvernanoplaten vertoonden een sterke SPR-piek bij 648,5 nm en een smalle groottedistributie (gemiddelde rand 44,3 nm), wat de succesvolle synthese bevestigt (Fig. 1a-c). Magnetische nanodeeltjes (20 nm) en goudnanoclusters (5 nm) werden bereid volgens vastgestelde protocollen [31-33]. Goudnanostaven vertoonden de verwachte longitudinale plasmonresonantie in de nabij-infrarood regio.

Validatie van het GGG-ligatuurmodel

GGG-ligatuur produceerde duidelijke gangdilatatie en verhoogde serum TBIL en AST niveaus ten opzichte van schim-controles (Fig. 2d-e), wat effectieve isolatie van de hepatobilière route en inductie van cholestase bevestigt.

Histologische Impact van Nanodeeltjes

Hematoxyline-eosine kleuring onthulde geen significante inflammatie of epitheelschade in enige testgroep vergeleken met controles (Fig. 3). Dit duidt erop dat de toegediende nanodeeltjes de darmbarrièreintegriteit niet aantasten.

Lokalisatie van Nanodeeltjes in Gobletcellen

TEM-beeldvorming toonde aan dat driehoekige zilvernanoplaten aanwezig waren in GC's door het hele dunne darm, ileum en colon, vaak in zowel geaggregeerde als gedispergeerde toestanden (Fig. 4). Vergelijkbare distributies werden waargenomen voor magnetische nanodeeltjes, goudnanoclusters en goudnanostaven (Aanvullend Bestand S4-S6). Aggregatie反映t waarschijnlijke hoge lokale concentraties, terwijl dispersie overeenkomt met lagere belading.

Kwantitatieve ICP-MS van darmweefsels bevestigde dat metaalniveaus hoger waren in GGG-geligueerde muizen dan in controles, terwijl fecaal metaalgehalte significant verminderd was in de geligueerde groep, wat de bijdrage van GC's aan excretie benadrukt (Fig. 8).

Transportmechanisme naar GC's

Nanodeeltjes werden gedetecteerd in circulerende erythrocyten en waargenomen om de vasculaire wand te dwarsen naar de lamina propria, waar ze de GC's binnengingen (Fig. 5). Dit suggereert dat deeltjesgrootte en oppervlaktechemie passieve diffusie door endotheliale membranen naar de mucosa-laag mogelijk maken.

Effect van Diarree op Nanodeeltjesexcretie

Het diarree-model verhoogde de gobletceldichtheid en het aandeel gecaviteerde cellen (Fig. 6), gecorreleerd met versnelde secretie van nanodeeltjes uit GC's. Twee-fotonenbeelden van goudnanostaven onthulden lagere weefselretentie en hoger fecaal goudgehalte bij diarree-muizen vergeleken met geligueerde controles (Fig. 7). Deze bevindingen tonen aan dat gastro-intestinale motiliteit het GC-gemedieerde clearance-pad kan moduleren.

Parietale Cel-gemedieerde Secretie

Goudnanoclusters en zilvernanoplaten werden ook gedetecteerd in maagparietale cellen (PC's) (Fig. 9). Hoewel de omvang van PC-betrokkenheid kleiner lijkt dan die van GC's, suggereren deze gegevens dat PC's een additionele excretieroute kunnen bieden voor bepaalde nanodeeltjestypen.

Conclusies

Onze studie vestigt een eerder onbekend, GC- en PC-gemedieerd pad voor de clearance van een diverse set metaalnanodeeltjes in vivo. Door de GGG te ligeren, isoleerden we deze route van het HBS en toonden we aan dat nanodeeltjes actief vanuit de circulatie naar de darmlumen worden getransporteerd via GC's, met PC's die bijdragen aan maag-excretie. Belangrijk is dat diarree geïnduceerd door een Chinese-kruidenextract dit proces aanzienlijk versnelt, wat de potentiële manipulatie van gastro-intestinale motiliteit om nanodeeltjesclearance te verbeteren benadrukt. Deze inzichten banen de weg voor veiliger ontwerp van nanodeeltjes-gebaseerde therapeutica, verbeterde in vivo-tracking en nauwkeurigere biosafety-beoordelingen.

Afkortingen

GGG

Gemeene galgang

GC's

Gobletcellen

GNRs

Goudnanostaven

HBS

Hepatobiliair systeem

PC's

Parietale cellen

TEM

Transmissie-elektronenmicroscopie

ICP-MS

Inductively coupled plasma mass spectrometrie