Maagpariëtale cel- en darmslijmbekercelsecretie:een nieuwe celgemedieerde in vivo metalen nanodeeltjes metabolische route verbeterd met diarree via Chinese kruiden

Abstract

Tot op heden is de manier waarop metalen nanodeeltjes in vivo worden geklaard, nog niet goed opgehelderd. Hierin rapporteren we een nieuwe intestinale slijmbekercel-gemedieerde in vivo klaringsroute om metalen nanodeeltjes te verwijderen. Typische metalen nanodeeltjes zoals driehoekige zilveren nanoplaten, magnetische nanodeeltjes, gouden nanostaafjes en gouden nanoclusters werden geselecteerd als representatieve voorbeelden. Deze metalen nanodeeltjes werden bereid, gekarakteriseerd en via een staartader geïnjecteerd in een muizenmodel met ligatie van de galwegen (CBD). De uitwerpselen en urine werden gedurende 7 dagen verzameld, gevolgd door het offeren van de muizen en het verzamelen van de darm- en maagweefsels voor verdere analyse. De resultaten toonden aan dat alle vier geselecteerde metalen nanodeeltjes zich in de slijmbekercellen (GC's) van het hele darmweefsel bevonden en via de afscheiding van darm-GC in het darmlumen werden uitgescheiden. Bovendien bevonden zich driehoekige zilveren nanoplaten en gouden nanostaafjes in de maag-pariëtale cellen (PC's). Belangrijk is dat nanodeeltjes geen duidelijke pathologische veranderingen in darmweefsels veroorzaakten. In deze studie hebben we bevestigd dat de bloedlichaampjes betrokken zijn bij de GC-secretieroute. Verder vonden we dat de afscheiding van nanodeeltjes uit intestinale GC's en PC's wordt versneld door diarree veroorzaakt door Chinese kruiden. Concluderend kunnen metalen nanodeeltjes zoals driehoekige zilveren nanoplaten, magnetische nanodeeltjes, gouden nanostaafjes en gouden nanoclusters worden verwijderd door intestinale GC's en pc's. Deze nieuwe route van in vivo klaring van metalen nanodeeltjes heeft een groot potentieel voor toekomstige toepassingen zoals het ontwerpen en ontwikkelen van nieuwe geneesmiddelen, op nanodeeltjes gebaseerde labeling en in vivo tracking, en bioveiligheidsevaluatie van in vivo nanodeeltjes.

Inleiding

Met de snelle ontwikkeling van nanotechnologie en de toepassingen ervan, wordt nu een grote verscheidenheid aan kunstmatige nanostructuurmaterialen gebruikt in de farmaceutische industrie, biomedische producten en andere industrieën. De opkomende nanotechnologieproducten hebben een enorm potentieel voor toekomstige economische groei en ontwikkeling, maar de risico's van nanotechnologie voor het milieu en voor de menselijke gezondheid worden nog steeds niet volledig begrepen. Om de impact van nanodeeltjes op het menselijk lichaam, hun interacties met biologische systemen en hun potentiële risicobeoordelingen te onderzoeken, is nanotoxicologie beschouwd als een nieuw multidisciplinair onderwerp, dat steeds meer de aandacht trekt van regeringen en wetenschappers, en de bioveiligheid van nanomaterialen als een sleutelfactor heeft vastgesteld. wetenschappelijk probleem. Tot op heden houden veel rapporten nauw verband met de interactie tussen nanodeeltjes en menselijke cellen. Sommige nanodeeltjes zoals grafeenoxiden, gouden nanoclusters en koolstofstippen kunnen bijvoorbeeld het cytoplasma of de celkern binnendringen, waardoor de celcyclus wordt stopgezet of celapoptose, de vorming van longgranuloom wordt veroorzaakt en de immunologische celsecretie van sommige cytokinen wordt gestimuleerd [1,2, 3].

Met de ontwikkeling van nieuwe moleculaire beeldvormingstechnieken zijn metalen nanodeeltjes zoals gouden nanodeeltjes, zilveren nanodeeltjes, magnetische nanodeeltjes en kwantumdots actief onderzocht als multifunctionele theranostische reagentia, en worden ze gebruikt voor in vivo gerichte beeldvorming, magnetisch-geïnduceerde verwarming, fotothermische of fotodynamische therapie, of als zeer efficiënte medicijnafgiftesystemen, naast andere toepassingen. Er is waargenomen dat deze op metalen nanodeeltjes gebaseerde multifunctionele nanosondes zich op tumorplaatsen bevinden, en een deel ervan bevindt zich ook in de lever- en miltweefsels en kan zich verspreiden door de nier-, long- en hersenweefsels [4,5,6, 7,8,9,10]. Omdat de nieren alleen de nanodeeltjes met een diameter van minder dan 5 nm opruimen, zijn de meeste nanodeeltjes erg moeilijk op deze manier te verwijderen [11, 12]. Daarom is het reinigen van in vivo metalen nanodeeltjes een uitdagend belangrijk wetenschappelijk probleem geworden. Tot op de dag van vandaag zijn er echter geen overtuigende alternatieve routes en gedetailleerde mechanismen om metalen nanodeeltjes uit het menselijk lichaam te verwijderen. Dus hoe we metalen nanodeeltjes in vivo kunnen reinigen, is onze zorg geworden.

Tot op heden worden metalen nanodeeltjes voornamelijk via drie routes in het organisme gebracht, zoals intraveneuze, orale en intraperitoneale routes, waarvan de intraveneuze injectie de meest gebruikelijke methode is vanwege de snelle verspreiding door het hele lichaam [4, 13, 14] . De afbraak van de metalen kernen van dit soort nanodeeltjes door het organisme is echter zo mogelijk uiterst moeilijk, wat leidt tot het primaire probleem, namelijk de effecten van de ophoping van resterende nanodeeltjes. Opgemerkt moet worden dat de kwaliteit van in vivo metalen nanodeeltjes wordt bepaald door de balans tussen door nanodeeltjes geïnduceerde bioactiviteit en ongewenste toxiciteit. Vanuit toxicologisch perspectief wordt een toxisch effect alleen uitgelokt als zich voldoende hoeveelheden nanodeeltjes op een doellocatie bevinden en de uitscheiding uit het organisme de beste manier is om de effecten van een overmatige hoeveelheid nanodeeltjes in de cellen en weefsels te stoppen. Daarom is een goed begrip van hun klaringsroutes cruciaal voor elke medische toepassing en voor een uitgebreide risicobeoordeling.

Er zijn enkele onderzoeken die verband houden met de klaring van nanodeeltjes uit in vivo weefsels of organen zoals de nier, lever en long [15,16,17]. Deze experimenten geven echter alleen informatie over het klaringsmechanisme om deeltjes uit het enkele orgaan te verwijderen in plaats van uit het hele lichaam [18]. Wat betreft de systemische in vivo klaring zijn er twee belangrijke uitscheidingsroutes van intraveneus geïnjecteerde nanodeeltjes gerapporteerd, namelijk de hepato-biliaire systeem (HBS)-feces route voor grotere nanostructuren die niet biologisch kunnen worden afgebroken door het organisme zoals sommige soorten magnetische nanodeeltjes [19, 20], en de nier-urineroute voor kleine nanodeeltjes, zoals kwantumdots, fullerenen, gouden nanoclusters en andere soorten gouden nanodeeltjes met een diameter van minder dan 5 nm [16, 21, 22]. Deze twee routes vertonen echter een beperkte klaringssnelheid voor in vivo metalen nanodeeltjes.

Souris et al. toonde aan dat nanodeeltjes van silica zich in hoge concentratie in de darmwand ophopen en dat de concentratie van intraveneus geïnjecteerde 50-100 nm silica nanodeeltjes in de lever veel lager was dan die in de darmwand en uitwerpselen [20]. Een andere studie toonde aan dat nanodeeltjes zo groot als 500 nm, ongeacht modificaties, uit het lichaam van de vissen kunnen worden geëlimineerd en dat de eliminatiesnelheid van deeltjes van 500 m sneller en efficiënter was dan die van deeltjes van 50 m, ondanks het feit dat de grotere nanodeeltjes ver buiten het vermogen liggen van HBS [23]. Deze gegevens laten zien dat de HBS-route mogelijk niet de belangrijkste uitscheidingsroute van in vivo nanodeeltjes is en dat er mogelijk andere uitscheidingsroutes zijn voor in vivo nanodeeltjes.

Intestinale slijmbekercellen (GC's) zijn sterk gepolariseerde uitscheidingscellen die overal in het darmkanaal aanwezig zijn. Van deze gespecialiseerde epitheelcellen wordt gedacht dat ze een belangrijke beschermende rol spelen in de darm door verschillende mediatoren te synthetiseren en uit te scheiden [24,25,26]. Wang et al. meldde dat slijmbekercellen (GC's) nanodeeltjes kunnen opnemen [27], en Sun et al. vond dat intraveneus geïnjecteerde nanodeeltjes verdeeld in de intestinale GC's [28]. Desalniettemin is tot op heden de interactie tussen de nanodeeltjes en de darm-GC's nog steeds niet in detail onderzocht. Specifiek, geen enkel rapport verduidelijkt volledig hoe die nanodeeltjes in de GC's-cellen kunnen komen en of die nanodeeltjes zich verspreiden in de GC's van het hele darmweefsel. Om de uitscheidingsroute van metalen nanodeeltjes in de darmweefsels te verduidelijken, is het cruciaal om op te helderen welke rol intestinale GC's spelen in deze nieuwe uitscheidingsroute van nanodeeltjes. Omdat metalen nanodeeltjes via HBS kunnen worden uitgescheiden en in de darmen terecht kunnen komen, hebben we ons daarom gericht op het onderscheiden van HBS-gemedieerde excretie van die gemedieerd door intestinale GC's (Schema 1).

De intestinale GC-uitscheidingsroute van nanodeeltjes

In deze studie hebben we vier soorten gewone metalen nanodeeltjes geselecteerd, zoals magnetische nanodeeltjes, zilveren driehoek nanodeeltjes, gouden nanoclusters en gouden nanostaafjes als onderzoeksdoelen. Dankzij de karakteristieke optische eigenschappen van gouden nanostaafjes, dienden ze als een hulpmiddel om de darmdistributie van nanodeeltjes te observeren door twee-fotonexcitatie, terwijl de andere drie soorten deeltjes dienden als representatieve voorbeelden van verschillende andere metalen nanomaterialen. Muizenmodellen werden bereid met ligatie van het gemeenschappelijke galkanaal om de verbinding tussen HBS en het darmkanaal te voorkomen. De metalen nanodeeltjes werden via de staartader in muizen geïnjecteerd, vervolgens werden naakte muizen grootgebracht en werden de feces verzameld gedurende 7 dagen, en de dieren werden uiteindelijk opgeofferd, en de darmkanaalweefsels en maagweefsels werden verzameld, in plakjes bereid en uiteindelijk geanalyseerd met behulp van hoge resolutie transmissie-electroscoop en ICP-MS om de distributie van metalen nanodeeltjes in de darmweefsels te onderzoeken. Daarnaast werd de aanwezigheid van metalen nanodeeltjes gemeten in de ontlasting van de muizen met CBD-ligatie. Bovendien hebben we in deze studie, om het secretiemechanisme van nanodeeltjes van GC's en pc's verder bloot te leggen, een recent ontwikkeld muizendiarreemodel gebruikt dat wordt geïnduceerd via Chinese kruiden.

Materialen en methoden

Synthese en karakterisering van driehoekige zilveren nanoplaten

De driehoekige zilveren nanoplaten werden gesynthetiseerd via procedures die eerder zijn beschreven door Mirkin [29] en collega's met enkele modificaties [30]. In een typisch experiment bij kamertemperatuur met lucht, AgNO₃ (0,1 mM, 100 mL), trinatriumcitraat (30 mM, 6 mL), PVP (30 kDa molecuulgewicht, 0,7 mM, 6 mL) en 240 μL H₂ O₂ (30 gew.%) werden ordelijk toegevoegd aan een kolf van 250 ml. Na krachtig schudden van de gecombineerde oplossingen in de kolf, 0,8 mL van een vers bereide oplossing van 0,1 M NaBH₄ werd snel geïnjecteerd. Binnen een paar seconden werd de kleur van de oplossing geel, wat wijst op de vorming van zilveren nanobolletjes. In de volgende uren werd de kolf onder zonlicht of een fluorescentielamp geplaatst totdat de oplossing een blauwe kleur kreeg, zonder verdere kleurveranderingen (maximaal 5 h). En de uiteindelijke oplossing werd bewaard in een koelkast van 4 °C voor verder gebruik.

Het absorptiespectrum van de bereide oplossing werd gemeten met een UV-vis-NIR-spectrometer (UV-3600, Shimadzu, Japan) met behulp van een optische padcuvette van 1 cm. De spectra werden verzameld binnen een bereik van 200 tot 950 nm met een spleet van 2 nm. De analyse met transmissie-elektronenmicroscopie werd uitgevoerd op JEM-200CX (JEOL, Japan) door het met koolstof beklede koperen TEM-rooster in de verzamelende nanodeeltjes in 1 mL gedeïoniseerd water te dompelen na in totaal 10 mL van de oplossing in microcentrifugebuizen van 1,5 mL te centrifugeren bij 6000 rpm gedurende 30 min bij 25°C. Een totaal aantal van 200 driehoekige zilveren nanoplaten werd geselecteerd uit de TEM-afbeeldingen om de verdeling van hun randafmetingen statistisch te berekenen.

Superparamagnetisch magnetiet (Fe₃ O₄ ) nanodeeltjes, gouden nanoclusters en gouden nanostaafjes werden gesynthetiseerd en gekarakteriseerd volgens onze eerdere rapporten [31,32,33] en bewaard bij kamertemperatuur.

Voorbereiding van diermodellen met ligatie van gemeenschappelijke galwegen

Gezonde, vrouwelijke Wistar-ratten (180-220 g) en vrouwelijke onbeschofte muizen (20-22 g) werden verkregen van Shanghai Slac Laboratory Animal Co. Ltd. (Shanghai, China). Alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de relevante wetten en institutionele richtlijnen. Alle dierproeven zijn goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van de Shanghai Jiao Tong University (NO.SYXK2007-0025). Het gemeenschappelijke galkanaal werd geligeerd volgens een methode die oorspronkelijk door Lee werd beschreven met enkele aanpassingen [34]. In het kort, deze muizen werden verdoofd met pentobarbital (25 mg/kg) en gefixeerd op een houten chirurgische plaat. Er werd een incisie in het midden van de buik gemaakt en de buikweefsels werden zorgvuldig gescheiden om de CBD duidelijk bloot te leggen. Twee steriele nylon medische chirurgische hechtingen (Shanghai Jinhuan Industry CO., Ltd., Shanghai, China), met een diameter van 0,2 mm, werden onder de CBD doorgevoerd en er werden drie knopen gemaakt aan beide uiteinden van een segment van de CBD (Fig. 1b, c). Ten slotte werd de CBD vervolgens tussen de twee uiteinden afgesneden, gevolgd door de definitieve sluiting van de buik. Op de 14e dag na ligatie van de galweg werden bloedmonsters verzameld van elke muis om de belangrijkste leverfunctie te testen.

Karakterisering van de driehoekige zilveren nanoplaten. een UV-vis spectrum van de bereide oplossing. b TEM-beeld van de verzamelde zilveren nanodeeltjes na centrifugeren. c Grootteverdeling van de geselecteerde driehoekige zilveren nanoplaten (200 nanodeeltjes van TEM-afbeelding)

Injectie van nanodeeltjes in de muizen

Na het voltooien van de CBD-ligatie werden 12 muizen willekeurig verdeeld in vier groepen:controlegroep 1, testgroep met zilveren nanoplaten, testgroep met magnetische nanodeeltjes en testgroep met gouden nanoclusters. Een extra controlegroep bestond uit vijf muizen zonder CBD-ligatie. De muizen in controlegroepen werden behandeld met een intraveneuze injectie van 0,9% NaCl-waterige oplossing, terwijl de testgroepen werden geïnjecteerd met een suspensie van nanodeeltjes zoals driehoekige zilveren nanoplaten, magnetische nanodeeltjes, gouden nanostaafjes en gouden nanoclusters in een dosis van 150 μL ( 550 g/ml). Alle vier de suspensies van nanodeeltjes werden vóór gebruik vers gedispergeerd door sonicatie gedurende 1 min. De muizen werden verdoofd door inademing van 5% isofluraan totdat de spiertonus ontspande, waarna vier soorten suspensies van nanodeeltjes intraveneus werden geïnjecteerd met respectievelijk een injectiespuit van 1 ml.

Verspreiding van nanodeeltjes in de weefsels

Op de zevende dag na injectie van de suspensie van metalen nanodeeltjes werden de muizen verdoofd en werden hun darmweefsels eruit gehaald, gedurende 24 uur gefixeerd in 10% formaldehyde en vervolgens ingebed in paraffine. Een Leica RM2135 Rotary Microtome werd gebruikt om 5 μm dikke secties van de vaste monsters te bereiden. Ten slotte werden de coupes gedehydrateerd met alcohol en gekleurd in hematoxyline en eosine. De secties van de monsters werden waargenomen onder een fasecontrastmicroscoop (Olympus, RX-71, Japan).

Op de zevende dag na injectie van de metalen nanodeeltjessuspensie werden de darmweefsels en maagweefsels onmiddellijk na het verticuteren van de muizen verzameld en gefixeerd in 2,5% glutaaraldehyde-oplossing. De vaste monsters werden serieel gedehydrogeneerd in ethanol en ingebed in epoxyhars. Daarna werd een ultradun darmmonster gemaakt en geobserveerd met TEM met hoge resolutie (FEI, Tecnai G2 Spirit Biotwin, VS).

Op diezelfde dag werden hun darmweefsels onmiddellijk na het offer verzameld en in beeld gebracht met behulp van een in vivo beeldvormingssysteem (IVIS-100-beeldvormingssysteem, Caliper) in combinatie met een coole charge-coupled device (CCD) camera en een rood fluorescerend eiwit (DsRed) filter (Caliper Life Sciences). Afbeeldingen en metingen van fluorescerende signalen werden verkregen en geanalyseerd door Living Image 3.2-software (Caliper Life Sciences).

Metaalgehalte van de ontlasting

Bovendien werd alle uitwerpselen van de muizen binnen 7 dagen na de injectie verzameld en werden de ontlasting gewogen en verteerd met aqua regia onder verwarming. Ten slotte werd het mentale metaalgehalte in de oplossing bepaald door een ICP-MS (Agilent 7500a, VS).

Bereiding van Chinese kruidenextracten

Sennablad 10 g, rabarber 2 g en fructus-cannabisextracten 1 g werden toegevoegd aan 100 mL water, gedurende 10 min verwarmd tot 100 °C en vervolgens gefilterd door twee lagen gaas [35]. Ten slotte werden de filtraten verzameld en onder verminderde druk geconcentreerd tot 0,3 g/ml. De extracten van sennablad werden zoals hieronder bereid en bewaard bij 4 ° C voordat de tests werden uitgevoerd.

Bekercelanalyse

Ten eerste werden zes mannelijke Kunming-muizen willekeurig verdeeld in twee groepen:de controlegroep en de diarreegroep; beide werden gedurende 7 dagen dagelijks behandeld met zoutoplossing en Chinese kruidenextracten via orale sondevoeding (0,1 ml), respectievelijk. De zevende dag na toediening van de sonde werden de muizen opgeofferd, werden de darmweefsels verzameld en werden de darm- en maagweefsels ingevroren in Tissue Tek OCT en in plakjes gesneden op een Leica CM 1510 S-cryostaat (Sakura Funetek, VS). De secties van 8 m werden gedurende 5 min gekleurd in Alcian Blue (1% Alcain Blue 8GX in 3% ijsazijn) en werden uiteindelijk gespoeld in gedestilleerd water. Dit monster werd vóór het wassen geoxideerd in 1% perjoodzuur en vervolgens gedurende 15 min behandeld in Schiff's reagens. Beelden van de weefselsecties werden opgenomen met behulp van een omgekeerde microscoop. De maagweefsels werden verzameld op positief geladen objectglaasjes voor beeldvorming met twee fotonenluminescentie.

Goudgehalte van de darmweefsels en ontlasting

In het kort werden 9 mannelijke Kunming-muizen verdeeld in elk van de drie groepen volgens de verschillende behandeling:controlegroep, ligatiegroepen en ligatie-+-diarreegroepen. Vervolgens werden deze muizen intraveneus geïnjecteerd met 100 L GNR's (1 mg/mL). De tweede dag na injectie in de staartader werden de controle- en ligatiegroepen behandeld met zoutoplossing, terwijl tegelijkertijd de ligatie- + diarreegroepen werden behandeld met Chinese kruidenextracten. De dosis van de behandeling werd constant gehouden en dagelijks toegediend gedurende de volgende 7 dagen via orale sondevoeding (0,1 ml). Op de zevende dag werden de muizen opgeofferd en werden de darmweefsels ingevroren in Tissue Tek OCT en in plakjes gesneden op een Leica CM 1510 S-cryostaat (Sakura Funetek, VS). Secties (8 m) werden verzameld op positief geladen dia's voor beeldvorming met twee fotonenluminescentie. Alle uitwerpselen van muizen werden verzameld na injectie. De feces werden gewogen en verteerd met aqua regia onder verwarming. Ten slotte werd het mentale goudgehalte in de oplossing bepaald door een ICP-MS (Agilent 7500a, VS).

Statistische analyse

Elk experiment werd drie keer in duplo herhaald. De resultaten werden gepresenteerd als gemiddelde ± SD. Statistische verschillen werden geëvalueerd met behulp van de t getest en overwogen bij P < 0.05.

Resultaten en discussie

Synthese en karakterisering van de nanodeeltjes

Driehoekige zilveren nanoplaten werden gesynthetiseerd door een snelle thermische synthesemethode, die een goede oplosbaarheid in water vertoonde. Belangrijker is dat de bijzondere driehoekige vorm van deze nanodeeltjes het gemakkelijk maakt om ze met elektronenmicroscopie te identificeren. Zoals weergegeven in Fig. 1 vertoonden geprepareerde zilveren nanodeeltjes in het UV-vis-spectrum een sterke piek bij 648,5 nm, wat overeenkomt met de in-plane dipooloppervlakte plasmonband en twee bescheiden pieken bij lagere golflengten, overeenkomend met de in-plane (482 nm) en out-of-plane (333 nm) quadrupoolresonanties, wat wijst op de vorming van driehoeksarchitectuur [36], wat verder wordt geverifieerd door het TEM-beeld van de zilveren nanodeeltjes verzameld na centrifugatie. TEM-afbeelding (Fig. 1b) onthulde dat de voorbereide batches een subpopulatie van zilveren nanosferen bevatten, mogelijk bijdragend aan de SPR-piek bij 389 nm [36]. De randlengte van de verzamelde driehoekige zilveren nanoplaten was 44,3 nm met een goede monodisperse distributie.

Magnetische nanodeeltjes met een diameter van 20 nm en Au-nanoclusters met een diameter van 5 nm werden bereid en hun karakterisering wordt weergegeven in aanvullend bestand 1:respectievelijk figuur S1 en S2. De TEM-afbeeldingen en UV/vis-spectra van Au-nanostaafjes worden weergegeven in Aanvullend bestand 1:Afbeelding S3.

Voorbereiding van de CBD-ligatiemuizenmodellen

Ligatie van de gemeenschappelijke galwegen (CBD) is een bekend experimenteel model dat wordt gebruikt om cholestatische fibrose van de lever te induceren [37, 38]. Hier hebben we experimenten uitgevoerd bij muizen met CBD-ligatie om de verbinding tussen HBS en het darmkanaal volledig te blokkeren (Fig. 2a, b), en ervoor te zorgen dat metalen nanoplaten alleen door de bloedbaan naar de darmweefsels werden getransporteerd na intraveneuze injectie. Vergeleken met normale controles vertoonden de behandelde groepen een sterke toename in de diameter en dikte van de wand van het gemeenschappelijke galkanaal 14 dagen na CBD-ligatie als gevolg van galstasis (figuur 2d). Bovendien waren, zoals weergegeven in figuur 2e, de niveaus van TBIL en AST in de ligatiegroep significant hoger dan in de contrastgroep. Deze resultaten suggereerden dat na het succesvol bouwen van het CBD-ligatie-muizenmodel, het gemeenschappelijke galkanaal absoluut werd geblokkeerd en dat de verbinding tussen HBS en het darmkanaal volledig was afgesneden, waardoor cholestase en cholestatische leverfibrose [39] werd veroorzaakt.

een Een schematische illustratie van de relaties van HBS met het darmkanaal. b, c Ligatie van CBD (witte pijlen). d CBD-zwelling op de 14e dag na CBD-ligatie (witte pijl). e Onderzoek van de belangrijkste leverfunctie. *P < 0.05

Het effect van vier soorten nanodeeltjes op de darmweefsels

Normaal gesproken vormt het darmepitheel een semi-permeabele barrière waardoor kleine hoeveelheden moleculen van verschillende groottes en kenmerken het intacte epitheel kunnen passeren via zowel actieve als passieve mechanismen. Over het algemeen geldt:hoe groter het molecuul, hoe kleiner de kans dat het deze barrière passeert. Als de darmwand echter ontstoken of beschadigd raakt, wordt het moeilijker voor het darmepitheel om vreemde en grote deeltjes buiten te houden naarmate de ruimten tussen de cellen opengaan [40, 41]. Aangezien nanodeeltjes de oorzaak kunnen zijn van pathologische veranderingen van darmweefsel en de daaruit voortvloeiende toename van de permeabiliteit van de darmwand, waardoor de nanodeeltjes de darmwand passeren, hebben we een histopathologisch onderzoek van de darmweefsels uitgevoerd na blootstelling aan vier verschillende soorten nanodeeltjes:magnetische nanodeeltjes, zilveren driehoek nanodeeltjes, gouden nanostaafjes en gouden nanoclusters. Zoals getoond in Fig. 3, werden er geen significante verschillen waargenomen tussen controlegroepen en testgroepen, noch waren er andere histologische veranderingen zoals ontstekingsinfiltraat [42]. De resultaten tonen aan dat deze metalen nanodeeltjes geen pathologische verandering van darmweefsel veroorzaakten, waardoor de mogelijkheid dat nanodeeltjes uit de ruimten tussen cellen lekken, werd geëlimineerd.

Histopathologische microsectie van verschillende darmweefselmonsters van muizen met CBD-ligatie. een Controlegroepen:muizen behandeld met injectie met zoutoplossing via staartaders (bovenste panelen). b Testgroepen:muizen behandeld met driehoekige zilveren nanoplaatsuspensie geïnjecteerd via staartaderen (onderste panelen)

Verspreiding van metalen nanodeeltjes in intestinale GC's

GC's zijn een type van de vier belangrijkste celtypen die in het hele darmkanaal aanwezig zijn en zijn verantwoordelijk voor de productie en het behoud van een beschermende slijmdeken door het synthetiseren en afscheiden van hoogmoleculaire glycoproteïnen, bekend als mucinen, die de eliminatie van darminhoud bevorderen en bieden de eerste verdedigingslinie tegen fysiek en chemisch letsel veroorzaakt door ingenomen voedsel, microben en het microbiële product [43, 44]. De GC's waren gemakkelijk te identificeren dankzij hun hoge slijmgehalte. Zoals getoond in Fig. 6, bevonden de driehoekige zilveren nanoplaten zich in de darm-GC's door het hele darmkanaal en konden de verschillende fasen van hun afscheiding uit GC's worden verkregen. Figuur 4d laat zien hoe enkele driehoekige zilveren nanoplaten door een GC naar buiten en in de darm werden uitgescheiden. Figuur 4e laat zien dat sommige driehoekige zilveren nanoplaten ingekapseld in de slijminhoud van de intestinale GC's klaar waren om te worden uitgescheiden. In figuur 4f wordt getoond hoe sommige driehoekige zilveren nanoplaten uit een GC waren verdreven, terwijl andere er nog in zaten. Uit de TEM-afbeeldingen ontdekten we dat sommige driehoekige zilveren nanoplaten werden getoond in een aggregatiemodus (Fig. 4 (a2, d en e), groene pijlen), terwijl andere zich in een dispersiemodus bevonden (Fig. 4 (a1, b1, b2, c1, c2 en f), witte pijlen). Aggregatie is een veelvoorkomend fenomeen van nanodeeltjes en wordt over het algemeen waargenomen wanneer hun concentratie in cellen sterk wordt verhoogd [45]. Integendeel, een afname van de concentratie van nanodeeltjes verhindert hun aggregatie.

Verdeling van driehoekige zilveren nanoplaten in intestinale GC's van muizen met CBD-ligatie. De CBD-ligatiemuizengroep werd 7 dagen na ligatie behandeld met driehoekige zilveren nanoplaten die via de staartader werden geïnjecteerd. Intestinale GC's van verschillende darmweefsels. A Duodenum, driehoekige zilveren nanoplaten werden getoond in een aggregatiemodus (groene pijl), terwijl sommige driehoekige splinternanoplaten zich in een dispersiemodus bevonden (witte pijlen). B Jejunum, driehoekige zilveren nanoplaten die zich bij de intestinale GC bevinden (witte pijlen). C Ileum en enkele driehoekige zilveren nanoplaten werden uitgescheiden, terwijl sommige er nog in zaten. D Colon, enkele driehoekige zilveren nanoplaten werden uitgescheiden en in de darmen. E , V Rectum, sommige driehoekige zilveren nanoplaten waren klaar om te worden uitgescheiden (dispersiemodus, witte pijlen), terwijl andere nog binnen waren (aggregatiemodus, witte pijl)

Vergelijkbare resultaten werden waargenomen voor gouden nanoclusters, magnetische nanodeeltjes en gouden nanostaafjes, zoals weergegeven in Aanvullend bestand 1:Afbeelding S4, S5 en S6. Deze resultaten toonden duidelijk aan dat deze drie soorten metalen nanodeeltjes zich in GC's van het darmkanaal bevinden, wat indirect ondersteunt dat deze metalen nanodeeltjes kunnen worden verwijderd door de GC's-route.

Hoewel GC's over de hele lijn van het darmkanaal zijn verdeeld, is hun bijdrage aan het totale epitheelvolume niet identiek. In de dunne darm van muizen neemt de volumedichtheid van GC's geleidelijk toe van de twaalfvingerige darm naar ileum. Deze trend zet zich voort in het dikke darmkanaal, waarbij de dichtheid van GC's in het colonepitheel ook proximaal tot distaal toeneemt, van het colon tot het rectum [43]. Op basis van het feit dat driehoekige zilveren nanoplaten, magnetische nanodeeltjes en gouden nanoclusters in de darm-GC's door het hele darmkanaal bestonden, en dat de bijdrage van GC's aan het totale epitheelvolume totaal anders is, geloven we dat de dikke darm mogelijk de belangrijkste excretieplaats voor de intestinale GC-uitscheidingsroute.

Vanwege hun karakteristieke vorm konden driehoekige zilveren nanoplaten gemakkelijk worden onderscheiden door TEM-beeldvorming op de locaties die zijn beschreven in de voorgestelde route om de GC's te bereiken. Hoewel magnetische nanodeeltjes en gouden nanoclusters met deze techniek niet van andere structuren konden worden onderscheiden, onthult aanvullend bestand 1:figuur S4 dat het darmkanaal van de CBD-ligatiegroep nog steeds een bepaalde hoeveelheid gouden nanoclusters heeft, wat ons naar de conclusie dat het bovengenoemde mechanisme van GC-excretie ook wordt toegepast voor andere soorten metalen nanodeeltjes.

Bovendien laten de ICP-MS-resultaten duidelijk zien dat deze nanodeeltjes nog steeds kunnen worden uitgescheiden door het lichaam van de ligatiemuizen, zoals weergegeven in Aanvullend bestand 1:Afbeelding S7. Deze resultaten toonden aan dat de slijmbekercellen van darmweefsels betrokken zijn bij een belangrijke route voor de uitscheiding van nanodeeltjes.

Potentieel transportmechanisme van metalen nanodeeltjes in het darmbloedvat

De hierboven genoemde resultaten tonen aan dat deze vier soorten metalen nanodeeltjes (magnetische nanodeeltjes, zilveren driehoek nanodeeltjes, gouden nanostaafjes en gouden nanoclusters) in de GC's door het darmkanaal waren verdeeld, maar de manier waarop de nanodeeltjes de GC's binnenkomen was nog steeds niet opgehelderd. Omdat de muismodellen met CBD-ligatie werden behandeld met een suspensie van metalen nanodeeltjes via staartaderinjectie, konden deze nanodeeltjes alleen door de bloedstroom naar de darmvaten worden getransporteerd. Zoals onthuld door TEM-beeldvorming, bevonden zich inderdaad enkele driehoekige zilveren nanoplaten in het bloedlichaampje (figuur 5a, witte pijlen). Bovendien hebben eerdere studies aangetoond dat nanodeeltjes met een kleine omvang door het bloedlichaampje over de hele bloedsomloop kunnen worden afgegeven [46]. In figuur 5b is te zien dat sommige driehoekige zilveren nanoplaten door het membraan van de bloedvaten gaan (groene pijlen), terwijl sommige driehoekige zilveren nanoplaten zich in het bloedlichaampje bevonden (rode pijlen). Daarom concluderen we, zoals figuur 8 laat zien, dat driehoekige zilveren nanoplaten werden getransporteerd door de bloedlichaampjes en vervolgens werden vrijgegeven in het plasma, gevolgd door het membraan van de vaatwand van de darmvaten en uiteindelijk bij de GC's aankwamen.

Distribution of triangular silver nanoplates in the intestinal vessels of mice with CBD ligation. een Triangular silver nanoplates located in the blood corpuscle (white arrows). b Triangular silver nanoplates penetrated into the vascular wall (green arrows), while some located in the blood corpuscle (red arrows)

Goblet Cell Analysis Assay

Goblet cells play a key role in the excretion pathway of nanoparticles. In this study, we found that metal nanoparticles can be secreted from these goblet cells. Following this statement, if the secretion process of the goblet cells is accelerated, it would theoretically be possible that the excretion of nanoparticles will also increase. To address this, we established a diarrhea model induced by a Chinese herb used in traditional medicine. In order to explore how diarrheic processes influence the secretion of GCs, a histological analysis of the intestinal GCs was conducted. It must be acknowledged that an increased number of intestinal tissue goblet cells increases the mucin production [47]. As shown in Fig. 6, in the diarrhea groups, the total number of goblet cells in the small intestinal and the large intestinal were significantly higher compared to the controls. In addition, the percentage and number of cavitated goblet cells in the intestinal tissues were significantly higher in the diarrhea groups compared to the controls. These observations let us assert that the amount of intestinal tissue cells increases in response to diarrhea, suggesting an increased excretion by the GCs. These results are consistent with data reported previously [47].

Photomicrographs of intestinal tissue stained with Alcian Blue/Schiff’s reagent to visualize goblet cells. Images are representative of mice treated with saline (Ligation groups) and senna leaf (ligation + diarrhea groups) with arrows indicating non-cavitated goblet cell (green arrow) and cavitated goblet cell (red arrow) secreting mucin. All bars are 100 μm

Gold Contents of the Intestinal Tissues and the Feces

It has been reported that the two-photon action cross-section (TPACS) of a nanorod can reach 2320 GM, which is much higher than that of organic fluorophores and within the range of that of quantum dots, providing a promising approach to detect the distribution of the gold nanorods in biological tissues using two-photon excitation [48, 49]. In this part of the study, in order to observe the intestinal distribution of nanoparticles in the ligation groups and the ligation + diarrhea groups, two-photon luminescence of the AuNRs core was measured. As shown in Fig. 7, the gold contents of small and large intestinal were significantly higher for the ligation groups compared with those observed in ligation + diarrhea groups. The gold elemental contents in intestinal tissues were quantified by ICP-MS 7 days after tail vein injection. The gold contents of intestinal tissues were significantly higher in the ligation groups compared to that in the ligation + diarrhea groups (P < 0.001) throughout the study (Fig. 7). These results indicate that the level of excreted nanoparticles by the goblet cells of the diarrhea groups is higher than that of any of the other groups.

Two-photon-laser scanning confocal microscopy images of intestinal tissue sections at 7 days after tail vein injection of GNRs (excitation 780 nm, emission 601–657 nm)

In the next experiment, we analyzed the gold contents in the feces of mice. As shown in Fig. 8a, the gold contents of feces were significantly higher in the control group compared to that in the ligation groups or the ligation + diarrhea groups (P < 0,001). Moreover, in the ligation + diarrhea groups, the gold contents were significantly higher than in the ligation groups (Fig. 8a). These results suggest that diarrhea accelerates the process of nanoparticles being secreted by the intestinal goblets cells. Combined with quantitative analysis of gold elements in feces, we further proved that the goblet cells of intestinal tissues are involved in an important pathway for the excretion of nanoparticles.

Content of GNRs at the intestinal tissues 7 days after injection (a ), and gold element content of feces (b ) based on ICP-MS analysis. ***P < 0.01, showing a significant difference between ligation groups and ligation + diarrhea groups

Effects of Parietal Cells on Gastric Secretion of Metal Nanoparticles

Parietal cells are mainly distributed in the bottom of the stomach and the gastric body, which secrete hydrochloric acid and internal factor. Furthermore, we found that gold nanoclusters distributed in the gastric tissues of mice with CBD ligation (Additional file 1:Figure S4B). Therefore, we hypothesized that parietal cells may be involved in the excretion of nanoparticles. As expected, from two-photon luminescence images, it was found that gold nanorods are distributed in the gastric tissues (Fig. 9a, b). In addition, as Fig. 9c, d shows, we observed that triangular silver nanoplates are distributed in the parietal cells of gastric tissue. Combined with the previous research results, we speculate that the parietal cells are involved in the secretion of nanoparticles.

Distribution of nanoparticles in the gastric tissue. (een ) en (b ):Two-photo-laser scanning confocal microscopy images of intestinal tissue sections 7 days after tail vein injection of GNRs (Excitation:780 nm, Emission:601-657 nm). (c ) TEM image of the gastric parietal cells; (d ) Triangular silver nanoplates located in the gastric parietal cells (white arrows)

Conclusions

In summary, we successfully prepared and applied triangular silver nanoplates, magnetic nanoparticles, gold nanorods, and gold nanoclusters as tracking agents. Mice with CBD ligation were treated with the previously prepared nanoparticles via tail vein injection to study the gastric-intestinal tissue distribution and excretion of these nanoparticles. We also analyzed the excretion pathways of gold nanoclusters and magnetic nanoparticles. It must be stated that gold nanoclusters are mainly cleaned away via kidney urinary pathway, whereas magnetic nanoparticles are mainly removed from the organism via HBS pathway. As the excretory capabilities of kidney and HBS for in vivo applications of metal nanoparticles are very limited, the GCs and PCs excretion pathway may provide another important alternative way for the excretion of these nanoparticles. Concerning this issue, we also found that the process of nanoparticles secreted from GCs and PCs is accelerated by diarrhea, further proving that the GCs and PCs represent an important pathway for the excretion of metal nanoparticles. Admittedly, our knowledge is still limited with respect to the in vivo clearance of nanoparticles as, for example, the concrete mechanism underlying the GCs and PCs secretion pathways, and the clearance efficiency of nanoparticles in intestinal GCs, thus further investigations are urgently needed. To sum up, this novel pathway of in vivo clearance of metal nanoparticles has great potential in short-term applications such as new drug design and development, nanoparticle-based labeling and in vivo tracking, and biosafety evaluation of in vivo nanoparticles.

Afkortingen

CBD:: Common bile duct
CCD:: Charge-coupled device
GCs:: Goblet cells
GNRs:: Gold nanorods
HBS:: Hepato-biliary
PCs:: Parietal cells
System Fe₃ O₄ :: Superparamagnetic magnetite
TEM:: Transmissie-elektronenmicroscopie
TPACS:: Two-photon action cross-section

Onderzoek van direct inkjet-geprint versus spin-coated ZrO2 voor sputter IGZO dunne-filmtransistor Eenvoudige voorbereiding van koolstofnanobuisjes-Cu2O-nanocomposieten als nieuwe katalysatormaterialen voor reductie van P-nitrofenol

Nanomaterialen

Metaal

Hars

vezel

Samengesteld materiaal