Verminderen van Cytotoxiciteit van Zilver Nanodeeltje Coatings met Grafene Oxide: Verbeterde Antibacteriële Prestaties en Biocompatibiliteit van een Ag–GO Nanocomposiet

Samenvatting

Met zilver nanodeeltjes (AgNPs) gecoate oppervlakken worden wijd beschouwd als een veelbelovende alternatief voor conventionele antibiotica. Toch brengt hun hoge oppervlaktereactiviteit veiligheidsbezorging in biomedische contexten. Hier rapporteren we dat het integreren van grafene oxide (GO) in AgNP coatings de cytotoxiciteit naar humane fibroblasten, endotheelecellen, en het kip embryo chorioallantoïde membraan aanzienlijk verlaagt, terwijl de antibacteriële activiteit tegen Salmonella enteritidis tegelijkertijd verbetert. Het Ag–GO composiet demonstreerde superieure bacteriële inhibitie en aanzienlijk verminderde inflammatoire cytokinerelease, wat een veiliger nanoplatform aangeeft geschikt voor medische toepassingen.

Inleiding

Antimicrobiële oppervlakken die nanomaterialen incorporeren – met name zilver nanodeeltjes – komen op als effectieve alternatieven voor traditionele antibiotica en chemische desinfectanten. Echter, de eigenschappen die antibacteriële kracht geven, dragen ook bij aan potentiële cytotoxiciteit en immunogeniciteit, wat klinische vertaling beperkt. Een sleutelstrategie om toxiciteit te verlagen is om nanodeeltjes stevig op het substraat te immobiliseren, hun vrijgave te beperken terwijl antimicrobiële functie behouden blijft. Ultrasonische depositietechnieken hebben zich als effectief bewezen voor coating en het vormen van stabiele nanocomposieten, zoals AgNPs op grafene oxide (GO). GO's overvloed aan zuurstof-bevattende functionele groepen bevorderen sterke electrostatische of covalente binding met metaalionen, wat adhesie verbetert en deeltjeslossing vermindert. In deze studie veronderstelden we dat polyurethaan folies gecoate met een Ag–GO composiet lagere toxiciteit zouden vertonen vergeleken met AgNP-enkel coatings, zonder antibacteriële effectiviteit in te boeten.

Resultaten

AgNPs en GO Vormden een Stabel Nanocomposiet

Transmissie elektronenmicroscopie (TEM) onthulde sferische AgNPs (~55 nm) stevig gehecht aan GO vellen (Fig. 1a–e). Zetapotentiaalmetingen toonden aan dat de Ag–GO hydrocolloïde na 24 uur stabiliseerde (−15,68 mV tot −27,7 mV), terwijl AgNPs alleen onstabiel bleven (−31,11 mV). Dynamische lichtverstrooiing (DLS) gaf een Z-gemiddelde grootte van 1157 nm voor het composiet, intermediair tussen AgNPs (93 nm) en GO (1485 nm), wat succesvolle hybridisatie bevestigt (Fig. 1b,d,f). Raman spectroscopie bevestigde de karakteristieke D (1347 cm⁻¹) en G (1578 cm⁻¹) banden van GO, met een I_D/I_G ratio van 1,34, wat een hoog ongestructureerd maar functioneel structuur aangeeft (Fig. 2a). FT-IR spectrogrammen verifieerden verder de aanwezigheid van hydroxyl, carboxyl, en epoxy groepen (Fig. 2b).

Nanodeeltjemorfologie en groottedistributie. Transmissie elektronenmicroscopie beelden van a zilver nanodeeltjes, c grafene oxide en e zilver nanodeeltjes en grafene oxide composiet. Groottedistributie van b zilver nanodeeltjes, d grafene oxide en f zilver nanodeeltjes en grafene oxide composiet

Structurele kenmerk analyse van grafene oxide. a Raman spectrum van grafene oxide met voorgestelde deconvolutie van de D, G en D'. b Fourier transformatie infrarood spectroscopie (ATR, gedempte totale reflectie) spectrum van grafene oxide met toewijzing van functionele groepen

Antibacteriële Effectiviteit Tegen Salmonella enteritidis

Na 24 uur incubatie bij 37 °C, verminderden alle nanoplatformen – AgNP, GO, en Ag–GO – bacteriële groei ten opzichte van ongecoate folies. Het Ag–GO composiet bereikte de meest uitgesproken inhibitie, met een >90% reductie in kolonie-vormende eenheden zoals gekwantificeerd door PrestoBlue assay (Fig. 3c). Scanning elektronenmicroscopie (SEM) onthulde zeldzame bacteriële koloniën en membraanschade op Ag–GO oppervlakken, wat fysieke contact-gemedieerde doodting bevestigt (Fig. 3b).

Nanoplatformen gecoate met zilver nanodeeltjes en grafene oxide verminderden de vitaliteit van S. enteritidis. Scanning elektronenmicroscoop beelden van a controle S. enteritidis bacteriën en b S. enteritidis geïnculeerd op een zilver nanodeeltjes- en grafene oxide-gecoat nanoplatform, na incubatie bij 37 °C gedurende 24 uur. c Vitaliteit van S. enteritidis na incubatie op het nanoplatform gedurende 24 uur beoordeeld met een PrestoBlue assay. Waarden zijn uitgedrukt als gemiddelde ± standaardeviatie (n = 3, elk experiment in drievoud). Statistische significantie wordt aangegeven door verschillende superscripten (één-manier ANOVA; P < 0,05). Afkortingen: C, controle groep (folie zonder nanodeeltjes); AgNPs, nanoplatform gecoate met zilver nanodeeltjes; GO, nanoplatform gecoate met grafene oxide; Ag-GO, nanoplatform gecoate met composiet van grafene oxide en zilver nanodeeltjes; RU, relatieve eenheden

Verminderde Cytotoxiciteit in Humane Cellen

Humane fibroblasten en HUVECs werden direct op elk nanoplatform gekweekt gedurende 24 uur. Vitaliteitsassays toonden een 40–50% afname op AgNP-enkel folies, terwijl GO en Ag–GO oppervlakken vitaliteit behielden vergelijkbaar met ongecoate controles (Fig. 4e,f). Morfologische beoordeling onthulde dat AgNP coatings duidelijke celfagregatie induceerden, terwijl GO en Ag–GO normale uitspreiding en morfologie bevorderden (Fig. 4a–d). Deze bevindingen benadrukken het beschermende effect van GO in het composiet.

Nanoplatformen gecoate met grafene oxide verminderden de cytotoxiciteit van zilver nanodeeltjes. Morfologie van fibroblasten gekweekt op a niet-gecoate nanoplatformen, b zilver nanodeeltjes-gecoate nanoplatformen, c grafene oxide-gecoate nanoplatformen, d zilver nanodeeltjes en grafene oxide composiet-gecoate nanoplatformen. Morfologie beoordeeld door lichtmicroscopie met fasencontrast met × 200 vergroting. Fibroblast (e) en HUVEC (f) vitaliteit na 24 uur incubatie op de nanoplatformen bepaald met een PrestoBlue assay. Waarden uitgedrukt als gemiddelde ± standaardeviatie (n = 3, elk experiment in drievoud). Statistische significantie aangegeven door verschillende superscripten (één-manier ANOVA; P < 0,05). Afkortingen: HUVECs, humane navelstreng veneuze endotheelecellen; C, controle groep (folie zonder nanodeeltjes); AgNPs, nanoplatform gecoate met zilver nanodeeltjes; GO, nanoplatform gecoate met grafene oxide; Ag-GO, nanoplatform gecoate met een composiet van grafene oxide en zilver nanodeeltjes; RU, relatieve eenheden

Chorioallantoïde Membraan Compatibiliteit

Direct contact van de nanoplatformen met het kip embryo chorioallantoïde membraan gedurende 48 uur onthulde dat AgNP-enkel coatings capillaire verlies en oppervlakteruwing veroorzaakten, terwijl GO en Ag–GO een gladde, gevaseerde morfologie behielden vergelijkbaar met controles (Fig. 5b). Dit in-vivo-achtige model bevestigt de verminderde endotheele toxiciteit waargenomen in vitro.

Grafene oxide verminderde de morfologische veranderingen van het chorioallantoïde membraan veroorzaakt door zilver nanodeeltjes. De morfologie van het kip embryo chorioallantoïde membraan na 48 uur incubatie met de nanoplatformen. a Controle groep (folie zonder nanodeeltjes), b nanoplatform gecoate met zilver nanodeeltjes, c nanoplatform gecoate met grafene oxide, d nanoplatform gecoate met composiet van grafene oxide en zilver nanodeeltjes

Modulatie van Inflammatoire Cytokine Vrijgave

Antistof array profiling van fibroblastoverloop onthulde dat zowel AgNP als Ag–GO coatings de IL-8 secretie aanzienlijk onderdrukten, terwijl GO alleen geen effect had (Fig. 6a). Alle nanoplatformen verminderden IL-6 vrijgave, en GO/Ag–GO verhoogden TNF-β productie, wat een gebalanceerde inflammatoire respons suggereert. Overige cytokinas bleven onveranderd, wat lage immunogeniciteit van het composiet aangeeft.

Antistof array analyse van de inflammatoire cytokine vrijgave van fibroblasten na 24 uur incubatie. a Controle groep (folie zonder nanodeeltjes), b nanoplatform gecoate met zilver nanodeeltjes, c nanoplatform gecoate met grafene oxide, d Ag-GO nanoplatform gecoate met composiet van grafene oxide en zilver nanodeeltjes. De AgNP en Ag-GO nanoplatformen verlaagden het vrijgaveniveau van IL-8 (stippels: E5, F5). Zowel de GO als Ag-GO nanoplatformen verlaagden de synthese van GM-CSF (stippels: G5, H5). Daarnaast leidden de GO en Ag-GO nanoplatformen tot verhoogde synthese van TNF-β (stippels: A9, B9). De AgNP, GO en Ag-GO nanoplatformen verlaagden het vrijgaveniveau van IL-6 (stippels: E8, F8). Een volledige array kaart is beschikbaar in Additioneel bestand 1

Discussie

Onze data bevestigen dat het integreren van GO in AgNP coatings niet alleen bacteriëradicatie verbetert, maar ook cytotoxische en inflammatoire responsen in humane cellen en een vertebraatmodel verlaagt. De verbeterde stabiliteit van AgNPs binnen de GO matrix beperkt waarschijnlijk ionvrijgave en deeltjesloslating, wat cellulair opname en oxidatieve stress vermindert. Bovendien verlaagt de grotere composietgrootte (~1150 nm) endocytosesnelheden, zoals waargenomen voor andere nanostrukturen, wat de toxiciteit verder verlaagt. Belangrijk is dat het composiet geen significante cytokinestormen oproept, een neutraal immunologisch profiel behoudend dat essentieel is voor klinische vertaling.

Deze bevindingen sluiten aan bij eerdere rapporten over GO's vermogen om metalen nanodeeltjes te stabiliseren en hun lossing te verminderen, terwijl antimicrobiële kracht behouden of zelfs versterkt blijft. Het huidige werk breidt dit concept uit naar een realistisch polymere substraat (polyurethaan folies) en valideert biocompatibiliteit over meerdere celtypen en een in-vivo-achtig model.

Conclusies

Het Ag–GO nanocomposiet presteerde beter dan zowel AgNP-enkel als GO-enkel coatings in antibacteriële effectiviteit tegen Salmonella enteritidis en in het verminderen van cytotoxiciteit naar fibroblasten, HUVECs, en het chorioallantoïde membraan. Het composiet's gebalanceerde cytokinprofiel ondersteunt verder de geschiktheid voor biomedische apparaten, zoals wondverbanden en implantaatcoatings. Toekomstig werk zal langetermijnstabiliteit, vrijgevingskinetiek, en in-vivo infectiemodellen verkennen om klinische implementatie vooruit te helpen.

Materialen en Methodes

Bereiding en Karakterisering van Nanoplatformen

Polyurethaan folies (15 × 15 mm, 0,05 mm) werden dip-gecoate in waterige suspensies van AgNPs (100 mg l⁻¹), GO (200 mg l⁻¹), of Ag–GO (200 mg l⁻¹) bereid via ultrasonicatie (20 kHz, 60% efficiëntie, 30 °C). Gecoate monsters werden gespoeld in gedemineraliseerd water en gedroogd onder steriele omstandigheden. TEM, Raman, FT-IR, zetapotentiaal, en DLS metingen bevestigden de morfologie en stabiliteit van elke formulering (details in Supplementair Materiaal).

Bacteriële Kweek en Vitaliteitsassay

Salmonella enteritidis (ATCC 13076) werd gekweekt op tryptische soja agar, geoogst, en gekwantificeerd door OD₆₀₀ om 5 × 10³ CFU ml⁻¹ in MH bouillon te bereiken. Folies werden geïnculeerd met bacteriën gedurende 24 uur bij 37 °C. Na incubatie werd bacteriële vitaliteit gemeten met PrestoBlue, en CFU tellingen verkregen door seriële verdunning en platen.

Scanning Elektronenmicroscopie

Bacteriële en cellulaire monsters werden fixated in 2,5% glutaraldehyde, gecontrasterd met osmiumtetroxide, gedeshydrateerd, kritisch-punt gedroogd, en gesputter-gecoate met goud voor SEM imaging bij 15 kV.

Humane Celkweek

HUVECs en fibroblasten werden gekweekt in laag-serum media met supplementen (details bovenaan). Cellen werden direct gezaaid op folies (1 × 10⁴ cellen ml⁻¹) en geïnculeerd gedurende 24 uur. Vitaliteit beoordeeld door PrestoBlue fluorescentie (λ_ex = 560 nm, λ_em = 590 nm). Morfologie onderzocht door fasencontrastmicroscopie.

Chorioallantoïde Membraan Assay

Embryo's (Dag 8) werden blootgesteld aan folies geplaatst op het chorioallantoïde membraan gedurende 48 uur. Membranen werden geoogst, stereoscopisch geïmageerd, en geëvalueerd op vasculaire integriteit.

Antistof Array Analyse

Fibroblastoverloop (80 µl per monster) werden gepoold, verdund, en geprobed op een antistof array (Abcam, catalogus ab134003) om 40 inflammatoire cytokinas te kwantificeren. Signalen gedetecteerd met HRP-geconjugeerde streptavidine en geïmageerd op een ChemiDoc systeem.

Statistische Analyse

Data geanalyseerd met één-manier ANOVA en Tukey's HSD post-hoc toets (GraphPad Prism 8). Significantie ingesteld op *p* < 0,05.

Beschikbaarheid van Data en Materialen

De datasets gegenereerd tijdens deze studie zijn beschikbaar van de corresponderende auteur op redelijk verzoek.

Afkortingen

Ag-GO

Composiet van zilver nanodeeltjes en grafene oxide

AgNPs

Zilver nanodeeltjes

CFU

Kolonie-vormende eenheden

DLS

Dynamische lichtverstrooiing

FT-IR

Fourier transformatie infrarood spectroscopie

GM-CSF

Granulocyt-macrofage kolonie-stimulerende factor

GO

Grafene oxide

HUVECs

Humane navelstreng veneuze endotheelecellen

IL-6

Interleukine 6

IL-8

Interleukine 8

SEM

Scanning elektronenmicroscoop

TEM

Transmissie elektronenmicroscoop

TNF-α

Tumornecrosefactor alpha

TNF-β

Tumornecrosefactor beta