Verbeterde genlevering met goud nanopartikels gefunctionaliseerd met chitosaan, N-geacyleerd chitosaan en chitosaan oligosaacharide

Samenvatting

Goud nanopartikels (AuNPs) worden toenemend gebruikt in biomedisch onderzoek door hun unieke optische eigenschappen, hoge dichtheid en gemakkelijke oppervlaktemodificatie. Hier presenteren we een non-viraal genleveringsplatform dat AuNPs combineert met drie chitosaan-afgeleide polymeren: native chitosaan (CO), N-geacyleerd chitosaan (Acyl-CO) en chitosaan oligosaacharide (COS). Twee synthetische routes werden verkend: een conventionele chemische reductie met natrium borohydride en een groene één-pot synthese waar COS simultaan reduceert en stabiliseert AuNPs. De resulterende nanocomposieten werden volledig gekarakteriseerd door UV-Vis spectroscopie, ζ-potentiaal, FTIR en transmissie elektronenmicroscopie (TEM). Agarose gel elektroforese bevestigde robuuste plasmid DNA (pDNA) complexatie, en transfactie-efficiëntie in HEK-293 cellen werd geëvalueerd via β-galactosidase activiteit en EGFP fluorescentie. Transfactiesnelheden van 27%, 33% en 60% werden bereikt met CO-AuNPs, Acyl-CO-AuNPs en COS-AuNPs respectievelijk, wat aantoont dat de groene, COS-gebaseerde formulering superieure genleveringsprestaties biedt terwijl giftige reductiemiddelen vermeden worden.

Achtergrond

Gentherapie berust op de levering van therapeutisch genetisch materiaal in doelcellen. Terwijl virale vectoren hoge transfactie-efficiënties bieden, lijden ze onder immunogeniciteit, beperkte payload capaciteit en productiecomplexiteit. Non-viraale dragers zijn daarentegen veiliger, makkelijker te produceren en stabieler tijdens opslag. Chitosaan, een natuurlijk voorkomend polysacharide afgeleid van chitine, is uitgegroeid tot een veelbelovende non-viraale vector vanwege zijn positieve lading, lage toxiciteit en vermogen om DNA te beschermen tegen enzymatische degradatie. Echter, native chitosaan is slecht oplosbaar bij fysiologische pH en hoog viskeus in gedilueerde zuuroplossingen, wat biomedische toepassing beperkt. Chemische modificaties zoals N-acylatie verhogen hydrofobiciteit en stellen de graad van deacetylering in, terwijl oligomerisatie (COS) viscositeit verlaagt en cellulaire opname verbetert door kortere ketens.

Goud nanopartikels, met hun afstelbare grootte, oppervlakte plasmon resonantie en sterke affiniteit voor amine, thiol en cyanide groepen, zijn ideale kandidaten voor het bouwen van multifunctionele nanodragers. Kationische polymeren zoals chitosaan kunnen op AuNPs gegrft worden om positief geladen oppervlakken te creëren die elektrostatisch plasmid DNA binden, wat cellulaire internalisatie vergemakkelijkt. Bovendien bevordert de hoge dichtheid van AuNPs snelle cellulaire opname, en hun optische eigenschappen maken real-time monitoring van levering mogelijk.

Eerdere studies hebben aangetoond dat chitosaan-AuNP conjugaten hogere transfactie-efficiënties kunnen bereiken dan liposomen of polymere nanopartikels. Toch vertrouwen meeste synthesen op giftige reductiemiddelen zoals natrium borohydride of cetyltrimethylammonium bromide (CTAB). In dit werk introduceren we een groene synthese route die COS als zowel reducerend als stabiliserend middel gebruikt, gevaarlijke chemicaliën eliminerend terwijl de gunstige fysicochemische eigenschappen van de nanocomplexen behouden blijven.

Methoden

Nanocomposiet Synthese

Drie distincte AuNP formuleringen werden bereid (Figuur 2). CO-AuNPs en Acyl-CO-AuNPs werden gesynthetiseerd via chemische reductie met NaBH₄, terwijl COS-AuNPs geproduceerd werden door een groene één-pot methode waar COS simultaan Au³⁺ reduceert en de nanopartikels kapst.

Materialen

Goud(III) chloride trihydraat (HAuCl₄·3H₂O), natrium borohydride (NaBH₄), laag-moleculair chitosaan (50-190 kDa, 75% deacetylering) en COS (5 kDa) werden gekocht van Sigma-Aldrich. Alle glaswerk werd 24 uur gereinigd met aqua regia en gespoeld met Milli-Q water om metaalsporen te verwijderen.

CO-AuNPs

CO (2 mg mL⁻¹) werd opgelost in 1% azijnzuur en overnachten opgeslagen. De oplossing werd gefiltreerd (0,22 µm) en gemengd met 10 mM HAuCl₄ (1 mL) onder hevig roeren voor 30 min. NaBH₄ (100 mM, 0,4 mL) werd druppelgewijs toegevoegd; de kleur veranderde van geel naar wijnrood, wat nanopartikelvorming aangeeft. Roeren werd 2 uur voortgezet.

Acyl-CO-AuNPs

Acylatie van laag-moleculair chitosaan werd uitgevoerd met caproyl chloride volgens een gemodificeerd protocol. De resulterende gel werd geprecipiteerd met aceton, gewassen met methanol en gedroogd. De gel (0,33% in 0,1 M HCl) werd gemengd met 10 mM HAuCl₄ (1 mL) en 1 uur geroerd. NaBH₄ (100 mM, 0,4 mL) werd vervolgens toegevoegd, wat een roze-rode oplossing opleverde die binnen 2 uur roeren volledig gekleurd werd.

COS-AuNPs

Voor de groene synthese werd COS (100-200 mg) toegevoegd aan HAuCl₄ (0,003-0,017 wt%) en geroerd bij 80°C voor 60 min. Vier varianten werden bereid, verschillend in COS hoeveelheid en goudconcentratie (Tabel 1). Nanopartikels werden gezuiverd door centrifugatie (12.000 g, 30 min).

Karakterisering

FTIR

FTIR spectra (Perkin Elmer Spectrum One) bevestigden de aanwezigheid van amide banden en de succesvolle acylatie van Acyl-CO. De graad van substitutie (DS) werd berekend als 75% met de verhouding van absorbanties bij 1651 cm⁻¹ en 3350 cm⁻¹.

ζ-Potentiaal

Zeta potentiaal metingen (Malvern Nano Z) onthulden positieve oppervlakteladingen (43-55 mV) voor alle composieten, wat hun geschiktheid voor DNA binding bevestigt. Na complexatie daalden waarden, wat succesvolle plasmid adsorptie aangeeft.

UV-Vis

UV-Vis spectra (400-700 nm) toonden gelokaliseerde oppervlakte plasmon resonantie (LSPR) pieken bij 534 nm (CO-AuNPs), 507 nm (Acyl-CO-AuNPs) en 533-536 nm (COS-AuNPs). Spectra bleven onveranderd na 150 dagen, wat colloidale stabiliteit bewijst.

TEM

TEM beelden (JEOL JEM-1010) onthulden sferische nanopartikels met diameters variërend van 3 tot 15 nm. Groottedistributies waren nauwer voor COS-AuNPs, wat superieure monodispersiteit reflecteert.

Complex Vorming en DNA Binding

Plasmiden pSV-β-Gal (6,82 kb) en pIRES2-EGFP (5,3 kb) werden gezuiverd via alkalische lyse. DNA (200-400 ng) werd gemengd met elk nanocomposiet in DMEM, en agarose gel elektroforese (0,8% agarose, 90 V, 60 min) demonstreerde complete DNA retentie in de putjes, wat elektrostatische complexatie bevestigt.

Cel Transfectie

Cel Cultuur

HEK-293 cellen werden gezaaid bij 12.000 cellen per put in 96-put platen, bereikend ~90% confluence na 24 uur.

EGFP Transfectie

Complexen (15 µL, 200 ng DNA) werden aan cellen toegevoegd voor 2 uur, gevolgd door 48 uur incubatie in complete DMEM. GFP expressie werd gekwantificeerd door fluorescentiemicroscopie (Carl Zeiss Axio Vert.A1).

β-Galactosidase Transfectie

Na 24 uur incubatie werden cellen gefixeerd en geïncubeerd met X-gal oplossing. Blauwe kleuring, indicatief voor β-galactosidase activiteit, werd waargenomen door helder-veld microscopie (Motic AE2000). LipofectAMINE™ 2000 diende als positieve controle.

Cel Levensvatbaarheid

Trypan blauw uitsluiting (0,2%) beoordeelde levensvatbaarheid 2 uur post-transfectie. Concentratiebereiken waren 0,1-3 mM voor CO-AuNPs en Acyl-CO-AuNPs, 0,5 mM voor COS@3-AuNPs en COS@4-AuNPs, en 0,1 mM voor COS@1-AuNPs en COS@2-AuNPs.

Resultaten en Discussies

Nanocomposiet Synthese en Karakterisering

De groene COS-AuNPs werden geproduceerd zonder gevaarlijke reagentia, wat de haalbaarheid van een volledig biocompatibele synthese route aantoont. UV-Vis spectra (Figuur 3) bevestigden de vorming van AuNPs, met LSPR pieken consistent over alle formuleringen. Stabiliteitstesten na 150 dagen toonden geen spectrale verschuiving, wat uitstekende colloidale robuustheid aangeeft.

Stabiliteit

UV-Vis spectra na 150 dagen: CO-AuNPs (a), Acyl-CO-AuNPs (b), COS-AuNPs (c).

FTIR

FT-IR spectra van chitosaan, Acyl-chitosaan en COS. Sleutelbanden: 1651 cm⁻¹ (amide I), 1591 cm⁻¹ (amide II).

ζ-Potentiaal

Tabel 2 lijst de ζ-potentiaal waarden: CO-AuNPs 43,3 mV, Acyl-CO-AuNPs 40,2 mV, COS-AuNPs 46,3-55,3 mV. Alle waarden bleven positief na DNA binding, wat complexatie bevestigt.

TEM

TEM micrografieken: (a) Acyl-CO-AuNPs 4,7 nm, (b) CO-AuNPs 3,5 nm, (c-f) COS-AuNPs 7,4-15,6 nm.

DNA Complexatie

Agarose gel (Figuur 7) toonde complete DNA retentie in alle nanocomplexen, terwijl vrij plasmid naar de bodem migreerde. COS-AuNPs vertoonden de sterkste binding, met retentie tot 350 ng plasmid voor verzadiging.

Transfectie Efficiëntie

In HEK-293 cellen bereikten COS-AuNPs de hoogste transfactiesnelheden: 60% met β-galactosidase en 48% met EGFP. Acyl-CO-AuNPs en CO-AuNPs bereikten 33% en 27% respectievelijk. De superieure prestaties van COS-AuNPs wordt toegeschreven aan hun hogere chitosaan/goud verhouding en optimale deeltjesgrootte.

Cel Levensvatbaarheid

Trypan blauw uitsluiting onthulde hoge levensvatbaarheid (>90%) voor COS-AuNPs, terwijl LipofectAMINE™ 2000 en CO-AuNPs lagere overlevingssnelheden toonden (61% en 78%). COS-AuNPs combineren dus hoge transfactie-efficiëntie met minimale cytotoxiciteit.

Conclusies

We hebben met succes goud nanopartikel-chitosaan conjugaten gefabriceerd via zowel conventionele als groene routes. De COS-AuNPs, gesynthetiseerd zonder giftige reagentia, vertoonden superieure transfactie-efficiëntie (tot 60%) en uitstekende cytocompatibiliteit (>93%). Hun nauwe groottedistributie en positieve oppervlaktelading maken robuuste plasmid binding en efficiënte cellulaire opname mogelijk. Deze bevindingen positioneren COS-AuNPs als een veelbelovend, milieuvriendelijk genleveringsplatform geschikt voor verdere preklinische ontwikkeling.

Beschikbaarheid van Data en Materialen

Alle datasets die de conclusies van deze studie ondersteunen, zijn opgenomen in de hoofdtekst.

Afkortingen

Acyl-CO:

Geacyleerd chitosaan

AuNPs:

Goud nanopartikels

CO:

Chitosaan

COS:

Chitosaan oligosaacharide

DMEM:

Dulbecco's modified Eagle's medium

FTIR:

Fourier-transformatie infrarood

PBS:

Fosfaat-gebufferde zoutoplossing

pDNA:

Plasmid desoxyribonucleinezuur

TEM:

Transmissie elektronenmicroscopie