Met kankercelmembraan versierd nanodeeltje van silica geladen met miR495 en doxorubicine om resistentie tegen geneesmiddelen te overwinnen voor effectieve longkankertherapie

Resultaten en discussie

Voorbereiding van CCM/SLI/R-D

Om een ​​goede medicijnlaadcapaciteit en biocompatibiliteit in één DDS te bereiken, werd synchrone hydrolyse van TEOS en AEAPS in de water-in-olie micro-emulsie gebruikt voor de fabricage van SLI. DOX werd tijdens de fabricage vooraf ingesloten in de matrix van SLI. Zoals getoond in Fig. 1a, toonde het resultaat van dynamische lichtverstrooiing (DLS) aan dat de met DOX beladen amine SLI een diameter had van ~ - 100 nm. TEM-afbeelding onthulde verder dat de nanodeeltjes bolvormig waren met een smalle distributie, wat in overeenstemming was met de resultaten verkregen door DLS.

een Grootte en zeta potentiële veranderingen van SLI/R-D bij verschillende w/w-verhoudingen. b De miRNA-bindingstest van SLI/R-D binaire complexen bij verschillende w/w-verhoudingen. Gegevens werden weergegeven als gemiddelde ± SD (n = 3)

De met DOX beladen amine-SLI had een oppervlaktepotentiaal van 26,83 mV, wat gunstig was om als miR495-drager te dienen. Volgens eerder rapport [31] werd de assemblage van miR495 en SLI om binaire complexen te vormen aangedreven door elektrostatische interactie. De w/w SLI tot miR495 in de binaire complexen heeft een significante invloed op de uiteindelijke transfectie-efficiëntie. Zoals weergegeven in Fig. 1a, hebben de binaire complexen, vanwege het feit dat miR495 een negatief geladen macromolecuul is, bij een lage w/w-verhouding van SLI tot miR495, een negatieve oppervlaktelading getoond met een aanzienlijk grotere deeltjesgrootte, wat mogelijk te wijten is aan de hechting van naburige nanodeeltjes. Met de toename van de w/w-verhouding werd de oppervlaktelading van binaire complexen echter geleidelijk positief met een stabiele deeltjesgrootte die werd waargenomen bij ongeveer 100 nm. Er werd aangetoond dat wanneer de w/w-verhouding 20 bereikte, zowel de deeltjesgrootte als het oppervlaktepotentieel van de binaire complexen stabiel bleven zonder significante verandering met de toename van de w/w-verhouding.

De bindings- en beschermingscapaciteiten van de nanodragers voor miR495 zijn van vitaal belang voor genafgifte. Het miR495-bindende vermogen van SLI werd beoordeeld door middel van een gelvertragingstest. Zoals getoond in Fig. 1b, vertoonde naakte miR495 geen vertraging, terwijl het toevoegen van SLI het gedrag van miR495 significant veranderde. Er werd waargenomen dat SLI een groeiende miR495-bindingscapaciteit vertoonde met de toename van de w/w-verhouding, wat een volledige vertraging van miR495 bereikte bij de w/w-ratio van 5.

Samenvattend werd geconcludeerd dat binaire complexen met de w/w-verhouding van 20 met de juiste deeltjesgrootte en gewenste oppervlaktelading, evenals effectieve miR495-binding en beschermingseigenschap, de optimale formulering waren die werd geselecteerd als het model om te presteren de volgende experimenten.

Vervolgens hebben we de optimale CCM-eiwitverhouding tot de binaire complexen onderzocht door CCM te mengen met binaire complexen in verschillende massaverhoudingen (SLI tot CCM-eiwit, w/w). De optimale verhouding werd bepaald door de resulterende deeltjesgrootte en oppervlaktelading onder verschillende omstandigheden. Zoals getoond in Fig. 2a resulteerde de toevoeging van CCM (negatieve lading) in een significante fluctuatie in de grootte van het product, maar een continue afname van de oppervlaktelading. De resultaten gaven aan dat CCM met succes was verankerd op het oppervlak van binaire complexen. Het belangrijkste was dat zowel de deeltjesgrootte als de oppervlaktelading van CCM/SLI/R-D een plateau bereikten bij de massaverhouding van 7,5 en dat de extra CCM een onbeduidende invloed op de oppervlakteladingen vertoonde en slechts een lichte toename in grootte vertoonde. Om specifiek te zijn, de diameter van het nanodeeltje bereikte 121,28 ± 3,36 nm en de zeta-potentiaal veranderde in − 28,04 ± 2,64 mV, wat vergelijkbaar was met de oppervlaktelading van vrije CCM (− 27,95 ± 3,06 mV), wat suggereert dat het decoreren van CCM onder deze voorwaarde verzadiging bereikt. Als resultaat werd de CCM/SLI/R-D met een massaverhouding van 7,5 geselecteerd als de modelformulering om de volgende experimenten uit te voeren.

een Grootte en zeta potentiële veranderingen van CCM SLC/R-D bij verschillende w/w-verhoudingen. Ingevoegde afbeelding was een westerse boutanalyse van de drie representatieve eiwitten in CCM en CCM/SLI/R-D. b De grootteverdeling en TEM van CCM/SLI/R-D. Gegevens werden weergegeven als gemiddelde ± SD (n = 3). Schaalbalken 100 nm

Karakterisering van CCM/SLI/R-D

Eerdere rapporten hebben aangetoond dat eiwitten in CCM in staat zijn om de homologe tumorcellen te homing wanneer ze worden gebruikt om nanodeeltjes te modificeren [35, 36]. Daarom werden drie membraaneiwitten (Na-K ATPase, AT1R en CXCR4) geselecteerd en hun expressieniveaus in CCM vergeleken met CCM/SLI/R-D. Zoals getoond in de ingevoegde afbeelding van Fig. 2a, vertoonde de hoeveelheid van alle drie de eiwitten in CCM een vergelijkbare intensiteit als die van CCM/SLI/RD, wat aantoonde dat geïntegreerde eiwitten in CCM na het coaten werden overgeërfd naar CCM/SLI/RD en de verloren of degradatie was verwaarloosbaar tijdens dit proces. Dit resultaat leverde ook solide bewijs om de succesvolle constructie van CCM/SLI/R-D te bevestigen, wat gunstig was voor een verhoogde tumor-homing van CCM/SLI/R-D.

De grootteverdeling en morfologie van CCM/SLI/R-D werden ook bestudeerd met behulp van DLS en TEM. Zoals getoond in Fig. 2b, onthulde DLS dat CCM/SLI/RD nauw verdeeld was rond 120 nm, terwijl TEM aantoonde dat CCM/SLI/RD werd gekenmerkt als een bolvormige kernschaalstructuur en een lipidedubbellaag duidelijk kon worden waargenomen op de oppervlakkige laag.

De DLC van DOX in CM/SLI/R-D (bepaald door HPLC) zou zo hoog kunnen zijn als 17,96%, en de miR495-lading (bepaald door UV-spectrofotometer) zou zo hoog kunnen zijn als 1,64%.

Eerdere studies hebben verschillende voorlopige vereisten voor een veilige afgifte van geneesmiddelmoleculen geconcludeerd. Allereerst moet de aangenomen DDS stabiel worden gehouden zonder dramatische variaties in grootte onder fysiologische omgevingen, aangezien de deeltjesgrootte van cruciaal belang was voor het in vivo lot van het systeem [10, 37]. Als resultaat werd de tijdsafhankelijke stabiliteit van CCM/SLI/R-D onderzocht. Om de colloïdale stabiliteit van CCM/SLI/R-D in fysiologische omgevingen te bepalen, werden de grootteveranderingen van DDS in PBS (pH 7.4) en muisplasma geregistreerd tot 48 h. Zoals weergegeven in figuur 3a, zou CM / SLN / Ce6 effectief zijn grootte kunnen behouden gedurende het hele testbereik zonder significante variaties. Daarom werd geconcludeerd dat CCM/SLI/R-D in staat was om stabiel te blijven in fysiologische toestand. Zoals getoond in Fig. 3b, zou de CCM/SLI/RD de stabiliteit kunnen behouden bij extracellulaire toestand (32,76% van de geneesmiddelen wordt afgegeven na 120  h incubatie), wat aangeeft dat de CCM/SLI/RD tijdens het leveringsproces de beladen medicijnmolecuul zonder mogelijke nadelige effecten te veroorzaken. Het belangrijkste is dat bij het binnendringen van cellen en worden blootgesteld aan de zure omgeving van kankercellen, de medicijnen gemakkelijk werden vrijgegeven (75,93%), wat zou kunnen worden toegeschreven aan de hoge waterstofconcentratie die de combinatie van medicijn en dragers verzwakt [6, 38].

een Colloïdale stabiliteit van LCC/RA in PBS (pH 7.4) en muisplasma bij 37 °C gedurende maximaal 48 h. b Geneesmiddelafgifteprofielen van DOX uit de LCC/RA in afgiftemedia onder extracellulaire en intracellulaire toestand van pH's (7,4 en 5,5). Gegevens werden weergegeven als gemiddelde ± SD (n = 3)

Intracellulaire transfectie

Om de relatie tussen de transfectie van miR495 en de expressie van P-gp te onthullen, werden de A549/DOX-cellen getransfecteerd met verschillende concentraties van miR495. Daarna werd het P-gp-expressieniveau in deze cellen bepaald met behulp van een western-blot-assay. Zoals getoond in Fig. 4a, vertoonde de expressie van P-gp een negatieve relatie met de miR495-concentratie, wat suggereert dat de CCM/SLI kan worden toegepast als een nuttig hulpmiddel voor de levering van miR495, wat gunstig is voor CCM/SLI/RD om de MDR in A549/DOX-cellen. Als proof of concept werd het effect van miR495-transfectie op de variatie van intracellulaire DOX-accumulatie verder bestudeerd. Na te zijn behandeld met CCM / SLC / siRNA gedurende 48 of 72 h (figuur 4b), werden de A549 / DOX-cellen behandeld met DOX gedurende verschillende tijdsintervallen. Zoals getoond in Fig. 5d, met CCM / SLC / siRNA-voorbehandeling gedurende 48 h, nam de cellulaire fluorescentie van DOX in A549 / DOX-cellen 1,49-voudig (4 h na incubatie) en 1,47-voudig toe (8  h na incubatie) , respectievelijk. Met CCM / SLC / siRNA-voorbehandeling gedurende 72 h, nam de intracellulaire DOX-fluorescentie in A549 / DOX-cellen 1,63-voudig (4 h na incubatie) en 1,85-voudig (8  h na incubatie) toe. Als resultaat werd geconcludeerd dat CCM/SLC/siRNA de MDR in A549/DOX zou kunnen overwinnen door de intracellulaire DOX-accumulatie te verhogen in vergelijking met onbehandelde cellen.

een De relatie tussen miR495-concentratie en de expressie van P-gp-eiwitten in A549 / DOX-cellen na 48  h te zijn behandeld met CCM / SLI / miR495. b De intracellulaire DOX-accumulatie in A549/DOX-cellen na behandeling met LCC/miR495 gedurende verschillende tijdsintervallen. Gegevens werden weergegeven als gemiddelde ± SD (n = 3)

Levensvatbaarheid van A549/DOX-cellen behandeld met geneesmiddelvrije drager (a ) of drugsbevattende (b ) verschillende formuleringen bij verschillende nanodeeltjes/geneesmiddelconcentraties gedurende 48 h. c Western-blot-assays van de expressie van caspase-3-, cytochroom C- en bcl-2-eiwitten na verschillende behandelingen. Gegevens werden weergegeven als gemiddelde ± SD (n = 3). ^** P < 0.01

In vitro antikankerassay

De cytotoxiciteit van een geneesmiddelvrije drager (CCM/SLI) werd bestudeerd om de biocompatibiliteit van de DDS verder te onthullen. Zoals getoond in Fig. 5a, vertoonde de A549/DOX na 48 u incuberen met CCM/SLI bij de hoogste concentratie van 200  μg/ml nog steeds meer dan 90% levensvatbaarheid, wat suggereerde dat CCM/SLI biocompatibel was met onbeduidende giftige stoffen. naar cellen.

Daarna werd de in vitro antikankertest geëvalueerd. Zoals getoond in Fig. 5b, waren de antikankereffecten van alle formuleringen positief gerelateerd aan geneesmiddelconcentraties. In detail was de levensvatbaarheid van A549/DOX-cellen nog steeds 72,6% bij de hoogste DOX-concentratie (50 M). De CCM/SLI/DOX en CCM/SLI/miR495 bereikten onder dezelfde omstandigheden een vergelijkbare levensvatbaarheid van de cellen waarvan respectievelijk 59,4% en 63,3% was, wat hoger was dan die van DOX. Er werd echter opgemerkt dat de levensvatbaarheid van de cellen voor CCM/SLI/R-D-behandeling significant was afgenomen tot 38,5%. Bovendien werd de CI-index in CCM/SLI/R-D bepaald op 0,84, wat wijst op een sterk synergetisch effect van miR495 en DOX op het doden van A549/DOX-cellen.

Om de conclusie opnieuw te verifiëren, werden de algemeen aangenomen apoptose-regulatie-eiwitten (caspase-3, bcl-2 en cytochroom-3) beoordeeld in verschillende formuleringen. Zoals aangetoond in Fig. 5c, was de hoeveelheid gesplitst caspase-3 het hoogste in met CCM/SLI/RD behandelde cellen en was het bcl-2-niveau (apoptose-onderdrukker) het laagst van alle testgroepen, wat de voorkeursantikanker verder bevestigt werkzaamheid van CCM/SLI/RD. Bovendien vertoonde de CCM/SLI/R-D een veel verhoogde expressie van cytochroom-3, wat suggereerde dat de apoptose in deze groep verband hield met mitochondriënschade.

De MCTS werd aangenomen om een ​​solide tumor na te bootsen en om het antikankereffect van verschillende formuleringen te beoordelen. Zoals getoond in Fig. 6a, groeit het MCTS-volume in de vrije DOX-groep aanhoudend in de hele experimentperiode, wat suggereert dat de MDR in A549 / DOX de cytotoxiciteit van DOX aanzienlijk zou kunnen verminderen. Enkelvoudige toedieningssystemen (SLI/DOX en SLI/miR495) vertoonden een zeker onderdrukkend effect met een licht verminderde groei. Het belangrijkste was dat de combinatie van miR495 en DOX in CCM/SLI/R-D een sterk verhoogde werkzaamheid vertoonde met een negatieve volumegroei die werd waargenomen aan het einde van de test. Het optische beeld in Fig. 6b kwam ook tot vergelijkbare conclusies.

Het volume verandert (a ) en bijbehorende optische afbeeldingen (b ) van MCTS na verschillende behandelingen. Gegevens werden weergegeven als gemiddelde ± SD (n = 3). ^** P < 0.01

In vitro en in vivo targeting

Om de mogelijke redenen voor het onderscheidende antitumoreffect van verschillende formuleringen te onthullen, werd de cellulaire opname beoordeeld om te onderzoeken of CCM-modificatie de internalisatiecapaciteit van nanodeeltjes in A549 / DOX-cellen positief zou kunnen verhogen, aangezien veel onderzoeken hebben aangetoond dat oppervlaktemodificatie van CCM de tumor kan verbeteren -targetingcapaciteit van nanodragers [39, 40]. Zoals weergegeven in Fig. 7a, nam de intracellulaire fluorescentie-intensiteit toe in de CCM / SLI / miR49- en SLI / miR495-groep als een functie van tijd, wat de positieve relatie tussen tijd en cellulaire opname in beide nanodeeltjes suggereert. Bovendien werd opgemerkt dat hogere fluorescentiesignalen werden waargenomen in de CCM/SLI/miR495-groep, die 1,58 maal hoger was dan die in de SLI/miR495-groep op het tijdstip van 6 h. Om te verifiëren of de opname van CCM/SLI/miR495 via de CCM-gemedieerde endocytose was, werden de cellen geïncubeerd met overmaat CCM vóór de toevoeging van nanodragers. Er werd waargenomen dat de fluorescentie-intensiteit in de CCM/SLI/miR495-groep bleef afnemen, terwijl de fluorescentie-intensiteit in de SLI/miR495-groep vrijwel gelijk bleef. Deze resultaten toonden aan dat CCM/SLI/miR495 door cellen werd opgenomen via CCM-gerelateerde endocytose.

een Kwantitatieve analyse van intracellulaire tijdsafhankelijke opname van verschillende formuleringen in A549/DOX-cellen (voorbehandeld met/zonder CCM). b Gemiddelde fluorescentie-intensiteit van ontlede tumoren en belangrijke organen van muizen behandeld met SLI/RA en CCM/SLI/RA 48 h na injectie. Gegevens werden uitgedrukt als gemiddelde ± SD (n = 3). ^** P < 0.01

Verwacht werd dat de CCM van A549/DOX de tumortargetingcapaciteit van CCM/SLI/R-D naar isogene A549/DOX-cellen zou versterken om de accumulatie van nanodragers in de tumor te vergroten. Om ons concept te verifiëren, werd de distributie van SLI/R-D en CCM/SLI/R-D gevolgd door een realtime beeldvormingssysteem. Zoals getoond in Fig. 7b vertoonde CCM/SLI/R-D, zoals verwacht, meer accumulatie in de tumor in vergelijking met SLI/R-D. Bovendien werd geconcludeerd dat SLI/R-D werd verspreid in bijna alle organen (behalve het hart) met focus in de lever en milt, wat mogelijk te wijten is aan hun slechte tumor-homing-vermogen. Integendeel, CCM-modificatie zou de leveropname aanzienlijk kunnen verminderen om de verbeterde homing van geladen lading naar tumorweefsel te helpen.

In vivo antitumoreffectiviteit

In vivo antitumor werkzaamheid van CCM/SLI/R-D werd uitgevoerd. Na behandeling met DOX of SLI/DOX werd de tumorgroei van muizen afgeremd. CCM/SLI/R-D had echter de beste antitumorwerking en resulteerde in een duidelijk verminderd tumorvolume van 303 ± 25 mm ³ . Bovendien vertoonde het resultaat van de variatie in lichaamsgewicht van muizen in verschillende groepen ook interessante resultaten (Fig. 8). Het toonde aan dat er geen duidelijke afname van het lichaamsgewicht was bij muizen die werden behandeld met CCM/SLI/R-D, wat suggereert dat het tumorgerichte vermogen van CCM/SLI/R-D de antitumorwerking zou kunnen verbeteren met verminderde bijwerkingen. Daarentegen veroorzaakte de ongerichte distributie van vrij DOX systematische toxiciteit bij muizen, wat werd weerspiegeld door het geleidelijk afnemende lichaamsgewicht als functie van de tijd. Samenvattend was de CCM/SLI/R-D een superieure tumor-homing DDS voor longtumortherapie.

The tumor volume (a ) and body weight (b ) of tumor tissue analysis of A549/DOX tumor-bearing Balb/c nude mice after intratumoral administration of different formulations. Data were expressed as mean ± SD (n = 6). ^** P < 0.01