Gerichte Co-levering van 5-Fluorouracil en LY294002 via PEG-Lipide Nanopartikelen Verbetert Antitumorale Effectiviteit bij Plaveiselcelcarcinoom van de Slokdarm

Samenvatting

We ontwierpen een PEG-gecode liposome co-encapsulerend het chemotherapeutisch middel 5-fluorouracil (5-FU) en de autofagie-remmer LY294002 (LY) om plaveiselcelcarcinoom van de slokdarm (ESCC) te behandelen. Uitgebreide fysico-chemische en biologische karakterisaties toonden succesvolle dubbele-medicijnlading en een gecontroleerd vrijgiftprofiel, met LY iets sneller vrijgekomen dan 5-FU. De liposomes vertoonden receptor-gemedieerde opname, bevestigd door confocale microscopie en FACS, en leverden hogere intracellulaire concentraties van beide middelen. In vitro induceerde de nanoliposom (FLNP) grotere cytotoxiciteit en apoptose (~48%) dan elk medicijn apart of hun vrije combinatie, zoals bewijs door MTT, annexine V/PI, en Hoechst-kleuring. Western blotting onthulde up-regulatie van caspase-3 en PARP en down-regulatie van Bcl-2, wat apoptose-inductie bevestigt. In een xenotransplantatiemodel bereikte FLNP superieure tumorgroei-remming, met reductie van tumorvolume tot ~500 mm³ versus ~1.400 mm³ in controles (p < 0,0001). Deze bevindingen ondersteunen de belofte van geprogrammeerde co-levering van autofagie-remming en chemotherapie via een enkele nanodrager om multidrug-resistentie in ESCC te overwinnen.

Achtergrond

Plaveiselcelcarcinoom van de slokdarm (ESCC) blijft een grote gezondheidslast in Oost-Azië, met een 5-jaar-overlevingscijfer van slechts ~25% (1,2). Terwijl chirurgie de hoeksteen is van behandeling, kan adjuvante chemotherapie de uitkomsten aanzienlijk verbeteren (3,4). Echter, monotherapie faalt vaak door tumorheterogeniteit en intrinsieke resistentie (5). Combinatieregimes die afzonderlijke cellulaire paden aanpakken, zijn daarom essentieel voor synergistische effectiviteit (6,7).

Autofagie, een lysosomaal afbraakproces, wordt vaak up-gereguleerd in kankercellen onder stress en kan ze beschermen tegen chemotherapeutica (8). Remming van autofagie heeft getoond tumorcellen te gevoelig te maken voor cytotoxische geneesmiddelen, waardoor multidrug-resistentie (MDR) wordt overwonnen (9). LY294002 (LY) is een goed bestudeerde PI3K-remmer die effectief autofagie blokkeert (9). 5-Fluorouracil (5-FU), een gefluoreerde pyrimidine-analogoon, wordt breed gebruikt in plaveiselcelkankers; de cytotoxiciteit ervan ontstaat door incorporatie in RNA en remming van thymidylate-synthase (10–12). Zowel 5-FU als LY lijden onder slechte wateroplosbaarheid en snelle systemische clearings, wat hun therapeutisch venster beperkt (6,7).

Nanodragers, met name PEG-gecode liposomes, zijn uitgegroeid tot klinisch gevalideerde voertuigen voor medicijnlevering, die verbeterde oplosbaarheid, verlengde circulatie en passive tumoraccumulator via het enhanced permeation and retention (EPR) effect bieden (13–18). Door zowel 5-FU als LY in een enkele PEG-liposom te encapsuleren, hypotheseerden we dat vroege vrijgave van LY autofagische overlevingspaden zal verstoren, wat tumorcellen gevoeliger maakt voor 5-FU en een synergistische antitumorale reactie produceert.

Methoden

Materialen

5-FU (Sigma-Aldrich, China) en LY294002 (Beijing Huafeng United Technology Corporation, China) werden gebruikt zoals ontvangen. Lipiden – eier fosfatidylcholine (EPC), DSPE-PEG2000, en cholesterol – werden bezorgd door Avanti Polar Lipids, China.

Voorbereiding van Dubbel-medicijn-geladen Nanoliposomes

Fosfolipiden en cholesterol werden opgelost in een methanol-chloroform-mengsel (10:4:1 molaire verhouding, 10 mg totaal). 5-FU en LY (1,5 mg elk) werden toegevoegd, en het oplosmiddel werd verdampt bij 60 °C onder verminderde druk om een dunne film te vormen. Hydratatie met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) gedurende 1 uur gevolgd door extrusie door een 200 nm polycarbonaat-membraan leverde de FLNP. Ongeencapsuleerd medicijn werd gekwantificeerd door HPLC. Medicijnlading (DL) en encapsulatie-efficiëntie (EE) werden als volgt berekend: DL (%) = (Gewicht van geencapsuleerd medicijn / Gewicht van liposom) × 100; EE (%) = (Gewicht van geencapsuleerd medicijn / Initiële medicijng gewicht) × 100.

Deeltjesgrootte Analyse

Dynamische lichtverstrooiing (DLS) met een Malvern Zetasizer Nano ZS meet deeltjesgrootte en polydispersiteitsindex (PDI) bij 25 °C.

Morfologie-analyse

Transmissie elektronenmicroscopie (TEM, Hitachi H-7600) en atoomkrachtmicroscopie (AFM) karakteriseerden morfologie.

In Vitro Vrijgave Studie

Medicijnvrijgave van FLNP werd geëvalueerd in PBS (pH 7,4) bij 37 °C met een dialysemembraan (MW ≈ 3.500). Monsters werden op vooraf bepaalde intervallen onttrokken en geanalyseerd door HPLC (Hitachi L-2200 autosampler, L-2420 UV-Vis detector; Inertsil C18 kolom, 150 × 4,6 mm, 5 µm). Lineaire calibratie liep van 0,025–2 µg/mL (r² ≈ 0,9995).

Celkweek

Humane ESCC-cellijnen EC 9706 werden onderhouden in RPMI 1640 aangevuld met 10% FBS, 100 U/mL penicilline, en 100 µg/mL streptomycine in een 5% CO₂ gevochtigde incubator.

Cellulaire Opname Analyse

Fluorescerende rhodamine B-geladen FLNP werden geïncueerd met EC 9706-cellen (10 µg/mL) gedurende 2 uur. Confocale laserscanning-microscopie (CLSM, Nikon TE2000-E) visualiseerde intracellulaire distributie. Stroomcytometrie (BD FACSCalibur) kwantificeerde opname op 1 uur en 2 uur tijdstippen.

Cytotoxiciteitsassay

MTT-leefbaarheidsassays werden uitgevoerd op 1 × 10⁴ cellen/put (96-puttenplaat). Cellen werden behandeld met vrije 5-FU, LY, 5-FU + LY, of FLNP gedurende 24 uur. Absorptie bij 570 nm werd gemeten met een Synergy HTX-lezer.

Apoptose-assay

Annexine-V/PI-kleuring (BD Biosciences) gevolgd door stroomcytometrie kwantificeerde vroege en late apoptose na 24 uur behandeling (1 µg equivalent medicijn).

Hoechst 33342 Assay

Hoechst 33342 (1 µg/mL) kleuring van gefixeerde cellen visualiseerde kerncondensatie onder een fluorescentiemicroscoop.

Western Blotting

Eiwitextracten werden gescheiden door SDS-PAGE en overgebracht naar PVDF-membraan. Blots werden geproefd op gespleten caspase-3, PARP, Bcl-2, en p53 (AbClon). Detectie gebruikte ECL en Kodak M35-A verwerking.

In Vivo Tumor Groei Remming

Vrouwelijke athymische naakmuizen (6 weken) ontvingen subcutane injecties van 1 × 10⁶ OE-19-cellen (100 µL). Toen tumoren ~80 mm³ bereikten (dag 10), ontvingen muizen (n = 6 per groep) 5 mg/kg FLNP, vrije medicijncombinaties, of controles via intraperitoneale injectie driemaal over 10 dagen. Tumorvolume (V = ½ × lengte × breedte²) werd gemeten met schuifmaat gedurende 20 dagen.

Statistische Analyse

Gegevens werden uitgedrukt als gemiddelde ± SD. Significantie werd beoordeeld door t-toets of ANOVA (p < 0,05).

Resultaten en Discussie

Co-levering van 5-FU en LY binnen PEG-liposomes bereikte een synergistische antitumorale effect die de effectiviteit van elk middel apart of hun vrije combinatie overstijgt. Deze synergie wordt toegeschreven aan de sequentiële vrijgave van LY, wat autofagie verstoort en cellen gevoelig maakt voor 5-FU-geïnduceerde DNA-schade.

Voorbereiding en Karakterisatie van 5-FU en LY-geladen Nanoliposomes

Lege liposomes vertoonden een gemiddelde diameter van ~110 nm (PDI ≈ 0,15). Dubbele-medicijnlading verhoogde de grootte tot ~150 nm (PDI ≈ 0,18), een dimensie die EPR-gemedieerde tumoraccumulator begunstigt (17,18). De oppervlaktelading was +25 mV, wat coloidale stabiliteit verleen en aspecifieke eiwitadsorptie minimaliseert.

Medicijnlading en In Vitro Vrijgave

Encapsulatie-efficiënties waren 92,5% voor 5-FU en 86% voor LY, met een ladingscapaciteit van ~16% w/w. Vrijgiftprofielen in PBS (pH 7,4) onthulden een bifasisch patroon: ~30% 5-FU en ~40% LY vrijgegeven binnen 24 uur, gevolgd door een geleidelijke vrijgave tot ~60% 5-FU en ~75% LY bij 90 uur (Fig. 3). LY's snellere vrijgave bevordert vroege autofagie-remming, wat cellen voorbereidt op daaropvolgende 5-FU-cytotoxiciteit.

Cellulaire Internaliseringsstudie

CLSM onthulde intense rode fluorescentie in de perikern-cytoplasma na 2 uur, wat receptor-gemedieerde endocytose aangeeft. Stroomcytometrie bevestigde tijds-afhankelijke opname, met een duidelijke toename tussen 1 uur en 2 uur (Fig. 4).

In Vitro Antikanker Effect

MTT-assays toonden dosis-afhankelijke cytotoxiciteit voor alle formuleringen. FLNP bereikte een IC₅₀ van 0,58 µg/mL, aanzienlijk lager dan vrije 5-FU (2,68 µg/mL), LY (5,98 µg/mL), en de vrije combinatie (1,54 µg/mL). Verbeterde effectiviteit wordt toegeschreven aan verbeterde medicijnlevering en sequentiële vrijgave (Fig. 5).

Apoptose-evaluatie

Annexine-V/PI-kleuring onthulde 48% apoptose in FLNP-behandelde cellen, vergeleken met 20% voor 5-FU alleen en 30% voor de vrije combinatie (Fig. 6). Hoechst-kleuring bevestigde kerncondensatie in FLNP-behandelde cellen.

Western Blot Analyse

FLNP verhoogde gespleten caspase-3 en PARP aanzienlijk terwijl Bcl-2 en p53-expressie verminderde, wat activatie van de intrinsieke apoptotische weg bevestigt (Fig. 7).

In Vivo Tumor Groei Remming Analyse

FLNP onderdrukte consistent tumorprogressie over 20 dagen, met een >60% reductie in eind-tumorvolume ten opzichte van vrije medicijngroepen. Het verbeterde therapeutische resultaat wordt toegeschreven aan tumor-selectieve accumulatie (EPR) en sustained medicijnvrijgave.

Conclusies

Ons PEG-liposomale platform levert 5-FU en LY succesvol co, bereikt gecontroleerde, sequentiële vrijgave die cytotoxiciteit en apoptose in ESCC versterkt. FLNP presteerde beter dan vrije medicijncombinaties in vitro en in vivo, wat het potentieel van autofagie-remming benadrukt om chemoresistentie te overwinnen. Toekomstige studies zullen deze strategie uitbreiden naar andere plaveiselcelmalignanties en orthotopische en patiënt-gefundeerde xenotransplantatiemodellen evalueren.

Afkortingen

5-FU:

5-Fluorouracil

EPR:

Enhanced permeation and retention effect

ESCC:

Plaveiselcelcarcinoom van de slokdarm

FLNP:

5-FU en LY-geladen lipide nanopartikelen