Optimalisatie van Glycyrrhetinezuur Liposomes via Lyofilisatie Monofase Oplossing: Preformulatie, Ontwerp en In-vitro Evaluatie

Samenvatting

In deze studie werden glycyrrhetinezuur (GA) liposomes met succes geformuleerd met behulp van de lyofilisatie monofase oplossing-methode. Preformulatiewerk onderzocht de oplosbaarheid van soja-fosfatidylcholine (SPC), cholesterol en GA in tert-butanol/water (TBA/water) co-oplostoffen. We onderzochten hoe TBA-volumepercentage de sublimatiesnelheid beïnvloedt, en karakteriseerden de gelyofiliseerde GA door DSC, XRD en FTIR. XRD wees een amorfe toestand voor GA aan, terwijl FTIR bevestigde dat geen chemische veranderingen plaatsvonden. Oplosbaarheidstests onthulden een duidelijke toename in waterige GA-oplosbaarheid. Met behulp van een Box-Behnken-ontwerp en lyoprotectant-selectie, identificeerden we de optimale formulering – 508 mg SPC, 151 mg cholesterol, 55% TBA, en een 4:1 trehalose/SPC gewichtsverhouding. Onder deze voorwaarden vertoonden gereconstitueerde liposomes een encapsulatie-efficiëntie van 74,87% en een gemiddelde diameter van 191 nm. In-vitro vrijgave-studies toonden sustained release in twee media, en cellulaire opname-assays toonden een tijds-afhankelijke opname door Hep G2-cellen.

Achtergrond

Glycyrrhetinezuur (GA), een triterpeen-sapogenine geëxtraheerd uit Glycyrrhiza-wortels, vertoont antimicrobiële, antivirale en antikanker-activiteit en wordt klinisch gebruikt voor chronische hepatitis en leverkanker. Volgens het Biopharmaceutische Classificatiesysteem is GA een klasse II-medicijn; de lage polariteit, hoge hydrofobiciteit en slechte oplosbaarheid beperken de orale biobeschikbaarheid en kunnen dosis-afhankelijke natriumretentie en kaliumverlies veroorzaken, wat leidt tot hypertensie. Het verbeteren van absorptie en het handhaven van therapeutische concentraties door gerichte formulering is daarom essentieel.

Liposomes zijn breed erkend voor hun bio-compatibiliteit, vermogen om lymfeknooppunten en tumorplaatsen te targeten via het enhanced permeability and retention effect, en veelzijdigheid in het dragen van zowel hydrofobe als hydrofiele geneesmiddelen. Echter, conventionele waterige liposom-suspensies zijn onstabiel, geneigd tot lekkage, fusie en fosfolipide-hydrolyse, wat langdurige opslag belemmert. Proliposomes – droge, vloeibare poeders die bij hydratatie liposomes vormen – bieden een oplossing. Traditionele proliposome-productie door spray-drogen of vriesdrogen heeft nadelen: spray-drogen kan thermogevoelige geneesmiddelen beschadigen, en vriesdrogen is tijdrovend en kostbaar door langdurige waterverwijdering.

Een recente innovatie, de lyofilisatie monofase oplossing-methode, lost lipiden, medicijn en een water-oplosbaar lyoprotectant op in een tert-butanol/water co-oplostof, waarna vriesdrogen een droog poeder produceert dat spontaan liposomes vormt wanneer water wordt toegevoegd. Voordelen omvatten snelle sublimatie, één-staps verwerking geschikt voor grootschalige productie, laag residueel oplosmiddel-risico (TBA is klasse 3), steriel poeder-output, en compatibiliteit met slecht water-oplosbare of onstabiele geneesmiddelen.

Ondanks deze voordelen, blijven kennisgaten: de impact van TBA/water-concentratie op sublimatiesnelheid, vastestofttoestandsveranderingen van het medicijn na lyofilisatie, en het hydratatie-assemblageproces van het poeder. Deze studie gebruikt GA als model om deze vragen aan te pakken, optimaliserend formulering en procesvariabelen via Box-Behnken-ontwerp, evaluerend lyoprotectant-effecten, en beoordelend in-vitro vrijgave en cellulaire opname.

Methoden / Experimenteel

Materialen

Glycyrrhetinezuur (≥ 98% zuiverheid) werd bezorgd door Dalian Meilun Biology Technology Co., Ltd. Soja-fosfatidylcholine (Lipoid S100) en cholesterol werden verkregen van Lipoid GmbH en J&K Scientific Ltd., respectievelijk. FITC-PEG-DSPE (MG 2000) was van Shanghai Ponsure Biotech, Inc. Tert-butanol (≥ 98%) en alle overige reagentia werden aangeschaft bij Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. Gedeioniseerd water werd geproduceerd door een Milli-Q-systeem.

Oplosbaarheidstudies

Verzadigde oplossingen van GA, SPC en cholesterol werden bereid in TBA/water-mengsels bij temperaturen variërend van 25 °C tot 45 °C. GA-oplosbaarheid werd gekwantificeerd door HPLC met een C18-kolom (4,6 × 250 mm, 5 µm) en een methanol/water (90:10 v/v) mobiele fase bij 1,0 ml min⁻¹, detecterend bij 250 nm. SPC- en cholesterol-oplosbaarheid werd geschat via een turbidimetrische methode, monitorend absorbantie bij 655 nm.

Lyofilisatie Monofase Oplossing Voorbereiding

GA, SPC en cholesterol werden opgelost in TBA bij 45 °C; een geselecteerde lyoprotectant (mannitol, lactose, sucrose of trehalose) werd opgelost in water bij 45 °C. De twee oplossingen werden gemengd om een isotrope monofase oplossing (60 ml) te geven. Na filtratie (0,22 µm), werden 2,0 ml aliquoten in 10 ml vriesdroogflesjes geplaatst, voor-gefrosten bij −40 °C gedurende 12 uur, en gelyofiliseerd bij −50 °C gedurende 24 uur (kamerdruk 1–20 Pa).

Deeltjesgrootte en Encapsulatie-efficiëntie

Gereconstitueerde liposomes werden bereid door 5 mg van proliposome-poeder in 5 ml zuiver water te disperseren, 1 min te vortexen, te herhalen na 15 min. Grootte werd gemeten door dynamische lichtverstrooiing (Nano ZS90, Malvern). Encapsulatie-efficiëntie (EE) werd bepaald door ultrafiltratie-centrifugatie: 1 ml van dispersie werd gefiltreerd door een 50 kDa MWCO-filter, het filtraat gekwantificeerd door HPLC, en EE berekend via EE = (1 − W_vrij/W_totaal) × 100%.

Sublimatiesnelheid en Dampdruk

TBA/water-mengsels met varierende TBA-volumepercentages (10–90%) werden voor-gefrosten en gelyofiliseerd; de tijd tot complete sublimatie werd vastgelegd om de snelheid te berekenen (µl min⁻¹). Dampdruk werd gemeten met een statische ebulliometer en de Antoine-vergelijking.

Fysico-chemische Karakterisatie

DSC (HSC-1, 25–350 °C, 10 °C min⁻¹, N₂-atmosfeer) beoordeelde thermische overgangen. XRD (D8 Focus, Cu-Kα, 5°–60°, 5° min⁻¹) evalueerde kristalliniteit. FTIR (Nicolet 6700, 4000–400 cm⁻¹, 4 cm⁻¹ resolutie) verifieerde chemische integriteit.

Stabiliteit

Proliposome-poeders werden opgeslagen bij 25 °C, stikstof-gevuld, in het donker. Na 6 maanden werden EE en deeltjesgrootte van gereconstitueerde liposomes herbeoordeeld.

In-vitro Vrijgave

Vrijgave werd bestudeerd door dialyse (MWCO 8000–14000 Da) in PBS (pH 7,4) of 0,1% Tween 80 zoutoplossing bij 37 °C, roerend bij 300 rpm. Monsters werden onttrokken tot 12 uur, vervangen met vers medium, en GA gekwantificeerd door HPLC.

Cellulaire Opname

FITC-gelabelde GA-liposomes werden geïncueerd met HepG2-cellen (1 × 10⁴ cellen mL⁻¹) gedurende 0,5, 1, 2 en 4 uur. Na wassen en trypanblauw-quenching, werden cellen gelyst met Triton X-100. Fluorescentie (excitatie 495 nm, emissie 520 nm) werd gemeten en genormaliseerd op eiwitinhoud (BCA-assay).

Resultaten en Discussie

Oplosbaarheid en Sublimatie

GA-oplosbaarheid in TBA/water steeg progressief met zowel TBA-volumepercentage als temperatuur; oplosbaarheid overschreed 0,5 mg mL⁻¹ wanneer TBA > 40%. SPC en cholesterol vereisten afnemende TBA-volumes naarmate de temperatuur boven 35 °C steeg, wat het gunstige oplossingseffect van TBA bevestigt.

Sublimatiesnelheid steeg van 4 µl min⁻¹ bij 10% TBA tot meer dan 10 µl min⁻¹ boven 60% TBA, toegeschreven aan hogere verzadigde dampdruk en fijner naaldvormige ijkristallen waargenomen in optische microscopie.

Fysico-chemische Veranderingen Na Lyofilisatie

DSC toonde een verschuiving van de GA-smeltpiek naar lagere temperaturen naarmate TBA-inhoud afnam, terwijl XRD volledige verlies van kristallijne pieken bevestigde, wat een amorfe toestand aanduidt. FTIR-spectra bleven onveranderd, wat chemische stabiliteit bewijst. Amorfisering verbeterde waterige oplosbaarheid van 6,36 µg mL⁻¹ (rauw) tot 19–64 µg mL⁻¹ afhankelijk van TBA-verhouding.

Enkele-factor Screening

Optimale SPC (480 mg), cholesterol (120 mg) en TBA (50%) werden geïdentificeerd op basis van de hoogste gecombineerde score van EE en gemiddelde diameter.

Box-Behnken Optimalisatie

Met SPC, cholesterol en TBA als onafhankelijke variabelen, voorspelde het model optimale condities: 508 mg SPC, 151 mg cholesterol, 55% TBA, wat EE = 68,55% en gemiddelde diameter = 220 nm opleverde. Interactieplots bevestigten synergistische effecten.

Lyoprotectant Selectie

Trehalose presteerde beter dan lactose, sucrose en mannitol. Een trehalose/SPC-verhouding van 4:1 maximaliseerde EE (74,87%) en minimaliseerde deeltjesgrootte (191 nm), met superieure bescherming tijdens vries-dooi-cycli.

Transmissie Elektronenmicroscopie

Beelden toonden initiële hydratatie met gedispergeerde GA- en lipide-fragmenten, die evolueerden naar uniforme, ~200 nm sferische liposomes met een dubbellaag-envelop en ingebed medicijn.

Stabiliteit

Na 6 maanden bij 25 °C bleef EE 72,82% en diameter 198 nm, wat robuuste fysieke stabiliteit aangeeft.

In-vitro Vrijgave

Zowel PBS als zoutoplossing-media vertoonden sustained release: 65,25% en 69,46% van GA vrijgegeven in 12 uur, met een snelle initiële fase gevolgd door een plateau, wat sustained-release-gedrag bevestigt.

Cellulaire Opname

HepG2-opname steeg van 1.480 ng mL⁻¹ eiwit bij 30 min tot 2.030 ng mL⁻¹ bij 240 min, met fluorescentiemicroscopie die tijds-afhankelijke internalisatie bevestigde.

Conclusies

Dit werk demonstreert dat de lyofilisatie monofase oplossing-methode, gekoppeld aan Box-Behnken-ontwerp en trehalose-lyoprotectant, GA-geladen liposomes produceert met hoge encapsulatie-efficiëntie (74,87%), kleine deeltjesgrootte (191 nm) en sustained release over 12 uur. De methode levert een stabiel droog poeder geschikt voor grootschalige productie en biedt een veelbelovend platform voor het leveren van hydrofobe therapeutica.

Afkortingen

BBD

Box-Behnken-ontwerp

DSC

Differentiele scanning calorimetrie

EE

Encapsulatie-efficiëntie

FTIR

Fourier-transformatie infrarood-spectroscopie

GA

Glycyrrhetinezuur

MD

Gemiddelde diameter

SPC

Soja-fosfatidylcholine

TBA

Tert-butanol

TEM

Transmissie elektronenmicroscopie

XRD

Röntgendiffractie