Targeting van miR‑301 onderdrukt angiogenese en tumorgroei in plaveiselcelcarcinoom van de slokdarm via PTEN-activatie

Samenvatting

Doelstelling

Plaveiselcelcarcinoom van de slokdarm (ESCC) wordt gekenmerkt door vroege metastasering en late diagnose. MicroRNA-301 (miR-301) is bekend om betrokken te zijn bij diverse kankers. Toch blijven de effecten van miR-301 op ESCC onverkend. Daarom willen we de rol van miR-301 in ESCC-progressie verkennen.

Methoden

Expressie van miR-301 en fosfatase en tensin homoloog (PTEN) in ESCC-weefsels en cellijnen werd beoordeeld. Vervolgens werden de geselecteerde cellen behandeld met gewijzigde miR-301 of PTEN oligonucleotide en plasmaat, en daarna werden de kolonievormingsvaardigheid, celvitaliteit, migratie, invasie, celdelingsverdeling en apoptose van ESCC-cellen beoordeeld. Bovendien werden tumorgroei en microvaatdichtheid (MVD) ook beoordeeld, en de targetrelatie tussen miR-301 en PTEN bevestigd.

Resultaten

MiR-301 was verhoogd, en PTEN was verlaagd in ESCC-weefsels en cellen. KYSE30 cellen en Eca109 cellen werden geselecteerd voor functionele assays. In KYSE30 cellen onderdrukte geïnhibeerde miR-301 of overexpressie van PTEN celmaligne gedragingen, en gedempte PTEN elimineerde de impact van miR-301 inhibitie op ESCC-progressie. In Eca109 cellen bevorderde miR-301 overexpressie of PTEN-inhibitie celmaligne gedragingen, en PTEN overexpressie keerde de effecten van miR-301 verhooging op ESCC-progressie om. De in vivo assay onthulde dat miR-301 inhibitie of PTEN overexpressie ESCC tumorgroei en MVD onderdrukte, en miR-301 verhooging of PTEN reductie had tegengestelde effecten. Bovendien werd PTEN getarget door miR-301.

Conclusie

Samengevat onthulden de resultaten in onze studie dat miR-301 celdeling, metastasering en angiogenese beïnvloedt via het reguleren van PTEN-expressie in ESCC.

Inleiding

Slokdarmkanker (EC), de 8e meest voorkomende kanker over de hele wereld, is een kritieke maligniteit met hoge sterfte en slechte prognose. Plaveiselcelcarcinoom van de slokdarm (ESCC) vormt ongeveer 90% van de totale EC-gevallen en is de hoofdvorm van EC in China. Meerdere oorzaken waaronder lage sociaaleconomische status, roken, alcoholconsumptie, slechte voedingsinname, nitrosamine-rijke of mycotoxine-gecontamineerde voeding leiden tot het ontstaan van ESCC. Ondanks de verbeterde klinische uitkomsten en behandeling, is er nog steeds een slechte prognose onder ESCC-patiënten, met een 5-jaar overlevingscijfer van 15-25%. Het is daarom cruciaal om oncogenen of tumorremmende genen te bevestigen die kunnen functioneren als biomarkers in de ontwikkeling van ESCC om meer effectieve therapeutische methoden voor ESCC-patiënten te bieden.

MicroRNAs (miRNAs) zijn kleine niet-coderende RNA's die een essentiële rol spelen in het moduleren van genexpressie en zijn gekenmerkt door de capaciteit om tumorprogressie te beïnvloeden door de stabiliteit van mRNA en de capaciteit van mRNA's te reguleren. Een aantal miRNAs zoals miR-4324, miR-889-3p en miR-9 zijn gevonden die geassocieerd zijn met het proces van ESCC. MiR-301 is een lid van de miRNAs gevormd door de fam33a transcriptie-eenheid gelegen op 17q22-23 in het menselijk genoom. De overexpressie van miR-301 is eerder geïdentificeerd, wat weerspiegelt dat het betrokken is bij humane ziekten. Echter, de functionele mechanismen van miR-301 zijn niet ontrafeld in ESCC. Bovendien is fosfatase en tensin homoloog (PTEN) bevestigd als frequent gestoord in tumoren en getarget door germinale mutaties in kankerpatiënten, wat een inhibitieve rol van tumoren speelt. Het is gevalideerd dat de dysregulatie van PTEN gecorreleerd is met ESCC-ontwikkeling. Interessant onthulde een recent onderzoek dat miR-301 PTEN target in niet-kleincel longkanker. Echter, deze targetrelatie tussen miR-301 en PTEN in ESCC-ontwikkeling blijft onthuld. Ons onderzoek richtte zich op de effecten van miR-301 en PTEN op ESCC-progressie, die grotendeels onbekend zijn en nieuwsgierig zijn. We concludeerden dat miR-301 angiogenese en celdeling in ESCC kan beïnvloeden door PTEN-expressie te moduleren.

Materialen en Methoden

Ethiekverklaring

Schriftelijke toestemmingen werden verkregen van alle patiënten vóór de studie. De protocollen van deze studie werden goedgekeurd door de Ethiekcommissie van het Tweede Ziekenhuis van Jilin Universiteit en gebaseerd op de ethische principes voor medisch onderzoek met menselijke proefpersonen van de Verklaring van Helsinki. Dierproeven waren strikt consistent met de Leidraad voor het Beheer en Gebruik van Laboratoriumdieren uitgegeven door de National Institutes of Health. Het protocol van dierproeven werd goedgekeurd door de Institutionele Commissie voor Dierenzorg en -gebruik van het Tweede Ziekenhuis van Jilin Universiteit.

Studieonderwerpen

Honderd en tien monsters van ESCC-weefsels en angrenzende normale weefsels (> 5 cm van de tumor) werden verzameld van ESCC-patiënten (78 mannen en 32 vrouwen) die een slokdarmresectie ondergingen in de thoraxchirurgie-afdeling van het Tweede Ziekenhuis van Jilin Universiteit van januari 2015 tot december 2017. Onder de 110 patiënten waren er 84 gevallen > 60 jaar en 26 gevallen ≤ 60 jaar; tumoromvang: 65 gevallen ≥ 5 cm en 45 gevallen < 5 cm; 71 gevallen zonder lymfekliermetastasen (LNM) en 39 gevallen met LNM; tumor, lymfeklier en metastase (TNM) stadium: 60 gevallen waren in stadium I + II, en 50 gevallen in stadium III; tumorlocatie: 13 gevallen waren bovengedeelte ESCC, en 97 gevallen waren midden-onder ESCC. De patiënten werden alle gediagnosticeerd met ESCC en hadden geen radiotherapie of chemotherapie ondergaan vóór de operatie. De tumoren werden volledig geëxcideerd, en de negatieve chirurgische marge is bevestigd door pathologie. Volgens de stadiëringcriteria van ESCC voorgesteld door de Union for International Cancer Control (UICC) in 2009, werd de postoperatieve pathologische stadiëring van de patiënten geïdentificeerd als de pT1-4N1-2(I-IIIb) stadium. Er was geen significante complicatie in patiënten na de operatie, en perioperatieve overlijdens werden uitgesloten.

Reverse Transcriptie Kwantitatieve Polymerase Kettingreactie (RT-qPCR)

Totale RNA's in weefsels en cellen werden geëxtraheerd met Trizol kits (Invitrogen Inc., Carlsbad, CA, VS). De RNA-concentratie en -kwaliteit werden gemeten. RNA primers (Tabel 1) werden ontworpen en gesynthetiseerd door TaKaRa Biotechnology Co., Ltd. (Liaoning China). De RNA omgekeerd getranscribeerd in cDNA op basis van de instructies van Takara PrimeScript™ RT reagent Kit met g DNA Eraser (Takara). We voerden qPCR uit op de Light Cycler 480II (Roche) met de Power PCR SYBR groene PCR master mix (Takara). U6 werd gebruikt als laadcontrole van miR-301, en β-actine werd gebruikt als interne referentie van PTEN. Data werden geanalyseerd met de 2^−ΔΔCt methode.

Western Blot Analyse

RIPA lyseringsbuffer (Beyotime Instituut voor Biotechnologie, Shanghai, China) werd gebruikt om totaal eiwit in cellen en weefsels te extraheren, en het eiwit werd gekwantificeerd door een BCA Eiwit Assay kit (Beyotime). De eiwitconcentratie van elk monster werd gemeten, en 10% natrium dodecyl sulfaat-polyacrylamidgelektroforese werd uitgevoerd. De monsters werden overgebracht op nitrocellulose membranen, die vervolgens geblokkeerd werden met 5% magere melkpoeder bij 4 °C overnacht. Daarna werden de membranen aangevuld met primaire antilichamen PTEN en β-actine (beide 1:500 en van Santa Cruz Biotechnology Inc, CA, VS) voor overnacht incubatie, vervolgens toegevoegd met de respectieve secundaire antilichamen en geïncubeerd gedurende 1 uur. Na 1 minuut onderdompeling in de versterkte chemiluminescente reagent (Pierce Chemical Inc., Dallas, TX, VS), werden de membranen in donkere omgeving blootgesteld en ontwikkeld met LAS4000 mini chemiluminescentie imager. De grijze waarden werden geëvalueerd door een imaging systeem software met β-actine als controle; daarom werd de finale relatieve eiwitexpressie verkregen. De eiwitbanden werden geanalyseerd door ImageJ2x software.

Dubbele Luciferase Reporter Gen Assay

De 3'-onverteerde regio (UTR) sequentie van PTEN werd voorspeld om te interacteren met miR-301, of een gemuteerde sequentie binnen de voorspelde target sites werd gesynthetiseerd en in de XbaI en FseI sites van de pGL3 controle luciferase reporter vector (Promega, WI, VS) geïnsereerd. Vervolgens werden pGL3-PTEN-wt en pGL3-PTEN-mut vectoren geproduceerd. De correct geïdentificeerde wt en mut luciferase reporter plasmiden met miR-301 mimic en mimic NC werden gecotransfecteerd in KYSE30 en Eca109 cellen gedurende 48 uur. Vervolgens werden de cellen gelyseerd, en de luciferase activiteiten werden respectievelijk bepaald door luciferase detectie kits (Promega).

Celkweek, Groepering en Transfectie

ESCC cellijnen (KYSE-150, KYSE-30, Eca109 en KYSE-70) werden verkregen van het Shanghai Instituut voor Biochemie en Celbiologie, Chinese Academie van Wetenschappen (Shanghai, China), en de humane slokdarmepitheele cellen (HEECs) werden verkregen van Mingzhou Biotechnology Co., Ltd. (Zhejiang, China). Cellen werden gekweekt in RPMI 1640 medium (Invitrogen) aangevuld met 10% foetale kalfserum (FBS, Life Technologies, VS), 100 eenheden/ml penicilline G natrium (Sigma) en 100 μg/ml streptomycinesulfaat (Sigma). MiR-301 expressie en de mRNA expressie van PTEN in elke cellijn werden gemeten door RT-qPCR, en de cellijn met de hoogste en laagste relatieve expressie werd gekozen voor de daaropvolgende cellulaire experimenten.

KYSE-30 cellen werden verdeeld in 7 groepen en respectievelijk behandeld met miR-301 inhibitor, inhibitor negatieve controle (NC), pcDNA-PTEN (genaamd overexpressie (oe)-PTEN), pcDNA-NC (genaamd oe-NC), miR-301 inhibitor + small interfererende RNA (si)-PTEN of miR-301 inhibitor + si-NC. Eca109 cellen werden ook in 7 groepen verdeeld en respectievelijk behandeld met miR-301 mimic, mimic NC, si-PTEN, si-NC, miR-301 mimic + oe-PTEN, miR-301 mimic + oe-NC. inhibitor NC, miR-301 inhibitor, miR-301 mimic, mimic NC, si-NC en si-PTEN werden gekocht bij GenePharma Ltd., Bedrijf (Shanghai, China); pcDNA-PTEN NC en pcDNA-PTEN werden verkregen van (Shanghai Sangon Biotechnologie Corporatie (Shanghai, China)). De cellen werden tijdelijk getransfecteerd in ESCC cellen door lipofectamine 2000 (Invitrogen) toen de celconfluens 60% bereikte.

Cel Telling Kit (CCK-8) Assay

Cellen werden gezaaid in een 96-puttenplaat (1 × 10³ cellen/put) en geïncubeerd voor verschillende tijdsperiodes. Na incubatie van 24 uur, 48 uur, 72 uur en 96 uur, werd elke put aangevuld met 10 μL CCK-8 oplossing (5 mg/mL), en vervolgens werden de cellen van elke groep geïncubeerd bij 37 °C zonder lichtblootstelling gedurende 2 uur. De optische dichtheid (OD) waarden bij 450 nm werden geanalyseerd door een microplaatlezer (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, VS).

Kolonievormingsassay

Cellen werden gezaaid met 500 cellen/put in 6-puttenplaten na transfectie en 14 dagen gekweekt. Koloniën werden gefixeerd met methanol, gekleurd met 0,5% kristalviolet en geteld onder de omgekeerde microscoop.

Transwell Assay

Cellen (5 × 10³) geïncubeerd in RPMI 1640 medium werden gezaaid in apicale kamers van Transwell apparaten met niet-beklede of matrigel-beklede membraan (Corning, NY, VS). Na 24 uur werden cellen op apicale kamers verwijderd, terwijl cellen die op de onderzijde bleven, gefixeerd en vervolgens gekleurd met 0,1% kristalviolet. Een microscoop (Olympus Corporation, Tokyo, Japan) werd gebruikt voor het tellen op 3 willekeurige velden om het aantal cellen te berekenen.

Stroomcytometrie

Celdeling en apoptose werden geëvalueerd door stroomcytometrie. Annexin V-fluoresceïne isothiocyaan (10 μL) en propidium iodide (PI; 5 μL, Sigma) werden geïncubeerd met de cellen (5 × 10⁵ cellen/put) in het donker bij 4 °C gedurende 30 min. Het percentage apoptotische cellen werd berekend met een stroomcytometer (BD Biosciences, CA, VS) met FlowJo versie 10 software (FlowJo LLC, OR, VS).

Om de celdeling te beoordelen, werden cellen (5 × 10⁵ cellen/put) gefixeerd met 75% ethanol overnacht bij 4 °C en gekleurd met 5 μl PI/ribonucleïne A (Sigma) bij 4 °C gedurende 30 min in het donker. Data werden geanalyseerd met een stroomcytometer (BD Biosciences). Fluorescentiesignalen (14.000) van elk monster werden verzameld en berekend met ModFit LT versie 3.2 software (Verity Software House, Inc., ME, VS).

Subcutane Tumorigenese in Kaal Muis

Tweeënveertig vrouwelijke BALB/c-nu kaalmhuizen (leeftijd 4 w, gewicht 16-24 g) werden verkregen van Experimenteel Dierencentrum Jilin Universiteit (Changchun, China). De kaalmhuizen werden verdeeld in 14 groepen (n = 3). Kaalmhuizen van zeven groepen werden respectievelijk geïnjecteerd met KYSE-30 cellen volgens de celgroepering, en kaalmhuizen in de overige zeven groepen werden apart geïnjecteerd met Eca109 cellen gebaseerd op de groepering. De concentratie van getransfecteerde KYSE-30 en Eca109 cellen werd aangepast tot 5 × 10⁶ cellen/100 μL. De kaalmhuizen werden vastgezet en subcutaan geïnjecteerd met de corresponderende ESCC cellen onder steriele omstandigheden. De grootste lengte (L) en breedte (W) van de tumoren werden elke week gemeten en tumorvolume (V) = 1/2 × L × W². De kaalmhuizen werden gedood in de 5e week van injectie met de tumoren geëxcideerd, en de tumoren werden gewogen en gefotografeerd. Tumorvormingssnelheid werd berekend als het aantal muizen met subcutane tumor/totaal aantal geïnjecteerde kaalmhuizen in de groep × 100%. De injectietijd werd als x-as genomen, en de tumoromvang als y-as; dus werd de tumorgroeicurve gegraafd.

Immunohistochemische Kleuring

De tumorweefsels van kaalmhuizen werden gefixeerd met 10% formaldehyde, in paraffine ingebettet en in 4 μm gesneden. Vervolgens werden de coupes gedroogd bij 60 °C gedurende 2 uur, ontwekt met xyleen, gedeshydrateerd met gradient ethanol en geïncubeerd met 50 μL 3% H₂O₂ gedurende 10 min. Daarna werden de coupes geweekt in 0,01 M citroenzuur bufferoplossing, gekookt bij 95 °C gedurende 20 min, geblokkeerd met normale geiten serum werkoplossing bij 37 °C gedurende 10 min en toegevoegd met CD₃₄ (1:100, Santa Cruz) bij 4 °C overnacht. Daarna werden de coupes aangevuld met HRP-gemarkeerde geit anti-konijn/muizen IgP polymer (ZSGB-Bio, Peking, China), tegengekleurd met hematoxyline, gedeshydrateerd en permeabiliseerd en vervolgens verzegeld met neutrale balsem. PBS werd gebruikt om de primaire antilichamen te vervangen als de NC. Meting van microvaatdichtheid (MVD): de coupes werden waargenomen onder een laag-vergroting microscoop. Een endotheelcel of een endotheelcelcluster gekleurd in bruinig-geel en significant onderscheiden van de omringende tumorcellen en bindweefsels werd genomen als een microvaat. De vertakkingsstructuur werd ook als een vaat genomen als het ontkoppeld was, terwijl vaten met lumen grootte > 8 erythrocyten, spierlaag of dikker lumen werden uitgesloten. De aantallen microvaten van 3 hoge visuele velden werden vastgelegd, en het gemiddelde aantal was MVD van elk geval.

Statistische Analyse

Alle statistische analyses werden uitgevoerd met SPSS versie SPSS 21.0 software (IBM Corp. Armonk, NY, VS) en gepresenteerd met Graphpad Prism Software 6.0. Data werden uitgedrukt als gemiddelde ± standaarddeviatie. Verschillen tussen twee onafhankelijke groepen werden getoetst met Student's t-toets. Eénrichtings ANOVA werd uitgevoerd voor het vergelijken van drie of meer groepen. P waarde < 0,05 was indicatief voor statistisch significant verschil.

Resultaten

MiR-301 is Hoog Geëxprimeerd, Terwijl PTEN Slecht Geëxprimeerd is in ESCC Weefsels en Cellen

MiR-301 en PTEN expressie in ESCC-weefsels en angrenzende normale weefsels werd beoordeeld met RT-qPCR en Western blot analyse om hun rollen in ESCC te onthullen, en het werd gevonden dat (Fig. 1a-c) miR-301 verhoogd was, terwijl PTEN verlaagd was in ESCC-weefsels. De patiënten werden verdeeld in de lage en hoge expressiegroepen volgens de mediaanwaarde van miR-301 of PTEN expressie om de correlatie tussen miR-301 of PTEN expressie en clinicopathologische kenmerken van ESCC-patiënten te analyseren. De resultaten gaven aan dat miR-301/PTEN expressie niet gerelateerd was aan leeftijd, geslacht, tumoromvang, locatie en differentiatie, wel gecorreleerd met TNM-stadium en LNM van ESCC-patiënten (Tabel 2).

MiR-301 is hoog geëxprimeerd, terwijl PTEN slecht geëxprimeerd is in ESCC weefsels en cellen. a Expressie van miR-301 en mRNA expressie van PTEN in het ESCC weefsel gedetecteerd met RT-qPCR; b eiwitexpressie van PTEN in het ESCC weefsel gedetecteerd met Western blot analyse; c eiwitbanden van PTEN in het ESCC weefsel in Western blot analyse; d expressie van miR-301 en mRNA expressie van PTEN in ESCC cellijn gedetecteerd met RT-qPCR; e eiwitexpressie van PTEN in ESCC cellijn gedetecteerd met Western blot analyse; f eiwitbanden van PTEN in Western blot analyse. *P < 0,05 versus HEEC. Data werden uitgedrukt als gemiddelde ± standaarddeviatie, en de t-toets werd uitgevoerd voor vergelijkingen tussen twee groepen

Vervolgens werd expressie van miR-301 en PTEN in 4 ESCC cellijnen en HEECs bepaald met RT-qPCR en Western blot analyse. We vonden dat (Fig. 1d-f) miR-301 verhoogd was en PTEN verlaagd in ESCC cellijnen, waarvan KYSE-30 de hoogste miR-301 expressie en de laagste PTEN expressie had, terwijl Eca109 de tegenovergestelde neiging had. Dus werd KYSE-30 cellijn behandeld met gedownreguleerde miR-301/overexpressie PTEN en Eca109 cellijn behandeld met overexpressie miR-301/gedempte PTEN in de cellulaire experimenten.

PTEN is Getarget door miR-301

Een bio-informatica software (https://www.microrna.org/) voorspelde dat PTEN het target gen was van miR-301 (Fig. 2a). Het werd verder bevestigd door dubbele luciferase reporter gen assay dat de luciferase activiteit aanzienlijk afnam in ESCC cellen gecotransfecteerd met PTEN-wt vector en miR-301 mimic vergeleken met die gecotransfecteerd met PTEN-mut vector en miR-301 mimic, wat impliceert dat miR-301 specifiek kan binden aan PTEN (Fig. 2b, c).

PTEN is het target gen van miR-301. a Binding sites van miR-301 en PTEN voorspeld door online voorspellingssoftware; b target relatie tussen miR-301 en PTEN in KYSE-30 cellen beoordeeld door dubbele luciferase reporter gen assay; c target relatie tussen miR-301 en PTEN in Eca109 cellen beoordeeld door dubbele luciferase reporter gen assay; d expressie van miR-301 en PTEN mRNA expressie in KYSE-30 cellen gedetecteerd met RT-qPCR na miR-310 downregulatie of PTEN upregulatie; e eiwitexpressie van PTEN in KYSE-30 cellen gedetecteerd met Western blot analyse na miR-310 downregulatie of PTEN upregulatie; f eiwitbanden van PTEN in KYSE-30 cellen in Western blot analyse na miR-310 downregulatie of PTEN upregulatie; g expressie van miR-301 en mRNA expressie van PTEN in Eca109 cellen gedetecteerd met RT-qPCR na miR-310 upregulatie of PTEN downregulatie; h eiwitexpressie van PTEN in Eca109 cellen gedetecteerd met Western blot analyse na miR-310 upregulatie of PTEN downregulatie; i eiwitbanden van PTEN in Eca109 cellen in Western blot analyse na miR-310 upregulatie of PTEN downregulatie. *P < 0,05 versus de inhibitor-NC groep, & P < 0,05 versus de oe-NC groep, ^#P < 0,05 versus de miR-301 inhibitor + si-NC groep, a P < 0,05 versus de mimic-NC groep, b P < 0,05 versus de si-NC groep, c P < 0,05 versus de miR-301 mimic + oe-NC groep; N = 3. Data werden uitgedrukt als gemiddelde ± standaarddeviatie, en de t-toets werd uitgevoerd voor vergelijkingen tussen twee groepen. ANOVA werd gebruikt voor vergelijkingen onder meerdere groepen

RT-qPCR en Western blot analyse werden gebruikt om miR-301 en PTEN expressie in getransfecteerde cellen te beoordelen, en het werd gevonden dat in KYSE-30 cellen (Fig. 2d-f), cellen behandeld met miR-301 inhibitor miR-301 downreguleerde, terwijl PTEN upreguleerde; cellen behandeld met pcDNA-PTEN (oe-PTEN) verhoogde PTEN expressie, en si-PTEN keerde het effect van miR-301 inhibitor op PTEN expressie om. In Eca109 cellen (Fig. 2g-i), cellen behandeld met miR-301 mimic upreguleerde miR-301, terwijl PTEN downreguleerde; cellen behandeld met si-PTEN verlaagde PTEN expressie, en pcDNA-PTEN (oe-PTEN) keerde de inhibitieve rol van miR-301 mimic in PTEN expressie om. Deze data suggereerden dat miR-301 PTEN targette.

Geïnhibeerde miR-301 of Overexpressie PTEN Beperkt Vitaliteit van ESCC Cellen; Verhoogde miR-301 of Verminderde PTEN Bevordert Vitaliteit van ESCC Cellen

Celvitaliteit van ESCC cellen werd beoordeeld met kolonievormings- en CCK-8 assays. De resultaten onthulden dat in KYSE-30 cellijn (Fig. 3a-c), transfectie van miR-301 inhibitor of oe-PTEN kolonievormingsvaardigheid en celvitaliteit onderdrukte; transfectie van gedempte PTEN elimineerde de impact van miR-301 inhibitor op ESCC celvitaliteit; in Eca109 cellijn (Fig. 3d-f), transfectie van miR-301 mimic of si-PTEN bevorderde kolonievormingsvaardigheid en celvitaliteit; PTEN overexpressie keerde de promotieve rol van miR-301 verhooging in kolonievormingsvaardigheid en vitaliteit van Eca109 cellen om. Deze resultaten suggereerden dat miR-301 knockdown of PTEN overexpressie de vitaliteit van ESCC cellen onderdrukte, welke werden bevorderd door miR-301 verhooging of PTEN inhibitie.

Geïnhibeerde miR-301 of overexpressie PTEN beperkt vitaliteit van ESCC cellen; verhoogde miR-301 of verminderde PTEN bevordert vitaliteit van ESCC cellen. a Aantal koloniën in KYSE-30 cellen na transfectie gedetecteerd met kolonievormingsassay na miR-310 downregulatie of PTEN upregulatie; b kolonievormingsvaardigheid van KYSE-30 cellen na transfectie gedetecteerd met kolonievormingsassay na miR-310 downregulatie of PTEN upregulatie; c vitaliteit van KYSE-30 cellen na transfectie gedetecteerd met CCK-8 assay na miR-310 downregulatie of PTEN upregulatie; d aantal koloniën in Eca109 cellen na transfectie gedetecteerd met kolonievormingsassay na miR-310 upregulatie of PTEN downregulatie; e kolonievormingsvaardigheid van Eca109 cellen na transfectie gedetecteerd met kolonievormingsassay na miR-310 upregulatie of PTEN downregulatie; f vitaliteit van Eca109 cellen na transfectie gedetecteerd met CCK-8 assay na miR-310 upregulatie of PTEN downregulatie; *P < 0,05 versus de inhibitor-NC groep; & P < 0,05 versus de oe-NC groep; ^#P < 0,05 versus de miR-301 inhibitor + si-NC groep; a P < 0,05 versus de mimic-NC groep; b P < 0,05 versus de si-NC groep; c P < 0,05 versus de miR-301 mimic + oe-NC groep, N = 3. Data werden uitgedrukt als gemiddelde ± standaarddeviatie, en ANOVA werd gebruikt voor vergelijkingen onder meerdere groepen

Geïnhibeerde miR-301 of Overexpressie PTEN Remt Migratie en Invasie van ESCC Cellen; Verhoogde miR-301 of Verminderde PTEN Induceert Migratie en Invasie van ESCC Cellen

Migratie- en invasievaardigheden van ESCC cellen werden beoordeeld met Transwell assay. De resultaten suggereerden dat in KYSE-30 cellijn (Fig. 4a, b), de celmigratie- en invasievaardigheden werden geremd door inhibitie van miR-301 of overexpressie van PTEN; de onderdrukkende rol van miR-301 inhibitor in celmigratie- en invasievaardigheden werd omgekeerd door si-PTEN. In Eca109 cellijn (Fig. 4c, d), de celmigratie- en invasievaardigheden werden bevorderd na transfectie van miR-301 mimic of si-PTEN; overexpressie PTEN keerde de impact van miR-301 mimic op celmigratie- en invasievaardigheden om. De bovenstaande bevindingen impliceerden dat de migratie en invasie van ESCC cellen werden geïnhibeerd door miR-301 repressie of PTEN elevatie, terwijl werden vergemakkelijkt door miR-301 upregulatie of PTEN downregulatie.

Geïnhibeerde miR-301 of overexpressie PTEN remt migratie en invasie van ESCC cellen; verhoogde miR-301 of verminderde PTEN bevordert migratie en invasie van ESCC cellen. a Migratie- en invasievaardigheden van getransfecteerde KYSE-30 cellen beoordeeld met Transwell assay na miR-310 downregulatie of PTEN upregulatie; b statistische resultaten van gemigreerde en invasieve in KYSE-30 cellen door Transwell assay na miR-310 downregulatie of PTEN upregulatie; c migratie- en invasievaardigheden van Eca109 cellen onder de groepen beoordeeld met Transwell assay na miR-310 upregulatie of PTEN downregulatie; d statistische resultaten van gemigreerde en invasieve in Eca109 cellen door Transwell assay miR-310 upregulatie of PTEN downregulatie. *P < 0,05 versus de inhibitor-NC groep; & P < 0,05 versus de oe-NC groep; ^#P < 0,05 versus de miR-301 inhibitor + si-NC groep; a P < 0,05 versus de mimic-NC groep; b P < 0,05 versus de si-NC groep; c P < 0,05 versus de miR-301 mimic + oe-NC groep, N = 3. Data werden uitgedrukt als gemiddelde ± standaarddeviatie, en ANOVA werd gebruikt voor vergelijkingen onder meerdere groepen

Geïnhibeerde miR-301 of Overexpressie PTEN Induceert Celdelingsstilstand en Apoptose van ESCC Cellen; Verhoogde miR-301 of Verminderde PTEN Onderdrukt Celdelingsstilstand en Apoptose van ESCC Cellen

Stroomcytometrie werd gebruikt om de celdelingsovergang en apoptose van cellen na transfectie te detecteren, en de resultaten gaven aan dat in KYSE-30 cellijn (Fig. 5a-d), transfectie van miR-301 inhibitor of oe-PTEN de apoptosesnelheid bevorderde en cellen in G0/G1 fase verhoogde, terwijl die in S en G2/M fasen verlaagde; de verandering van apoptose en celdelingsstilstand geïnduceerd door miR-301 inhibitor kon worden omgekeerd door si-PTEN.

Geïnhibeerde miR-301 of overexpressie PTEN induceert celdelingsstilstand en apoptose van ESCC cellen; verhoogde miR-301 of verminderde PTEN onderdrukt celdelingsstilstand en apoptose van ESCC cellen. a Celdelingsverdeling van KYSE-30 cellen in elke groep gedetecteerd door stroomcytometrie na miR-310 downregulatie of PTEN upregulatie; b statistische resultaten van percentage in G0/G1, S en G2/GM fasen van KYSE-30 cellen in stroomcytometrie na miR-310 downregulatie of PTEN upregulatie; c apoptose van KYSE-30 cellen gedetecteerd door stroomcytometrie na miR-310 downregulatie of PTEN upregulatie; d apoptosesnelheid van getransfecteerde KYSE-30 cellen gedetecteerd met stroomcytometrie na miR-310 downregulatie of PTEN upregulatie; e celdelingsverdeling van Eca109 cellen in elke groep gedetecteerd door stroomcytometrie miR-310 upregulatie of PTEN downregulatie; f statistische resultaten van percentage in G0/G1, S en G2/GM fasen van Eca109 cellen in stroomcytometrie na miR-310 upregulatie of PTEN downregulatie; g apoptose van Eca109 cellen gedetecteerd door stroomcytometrie na miR-310 upregulatie of PTEN downregulatie; h apoptosesnelheid van getransfecteerde Eca109 cellen gedetecteerd met stroomcytometrie na miR-310 upregulatie of PTEN downregulatie. *P < 0,05 versus de inhibitor-NC groep; & P < 0,05 versus de oe-NC groep; ^#P < 0,05 versus de miR-301 inhibitor + si-NC groep; a P < 0,05 versus de mimic-NC groep; b P < 0,05 versus de si-NC groep; c P < 0,05 versus de miR-301 mimic + oe-NC groep, N = 3. Data werden uitgedrukt als gemiddelde ± standaarddeviatie, en ANOVA werd gebruikt voor vergelijkingen onder meerdere groepen

Volgens de resultaten van stroomcytometrie vonden we dat in Eca109 cellijn (Fig. 5e-h), transfectie van miR-301 mimic of si-PTEN de apoptosesnelheid remde, cellen in G0/G1 fase verlaagde en die van de S fase en G2/M fasen verhoogde; PTEN overexpressie keerde het effect van miR-301 mimic op de apoptosesnelheid en celdelingsstilstand van Eca109 cellen om. We concludeerden uit deze resultaten dat gedownreguleerde miR-301 of upreguleerde PTEN celdelingsovergang en apoptose in ESCC cellen bevorderden, terwijl geïnhibeerde miR-301 of gedempte PTEN tegengestelde effecten uitoefenden.

Geïnhibeerde miR-301 of Overexpressie PTEN Remt Tumorgroei en Angiogenese In Vivo in ESCC; Verhoogde miR-301 of Verminderde PTEN Verhoogt Tumorgroei en Angiogenese In Vivo in ESCC

De groei en veranderingen van ESCC tumoren in kaalmhuizen werden in elke groep waargenomen. Tumorgroei werd beoordeeld, en de resultaten impliceerden dat in KYSE-30 cellijn (Fig. 6a-e), kaalmhuizen geïnjecteerd met miR-301 inhibitor of oe-PTEN tumorvolume en -gewicht verlaagden; de onderdrukkende rol van miR-301 inhibitor in tumorgroei werd afgeschaft door si-PTEN. In Eca109 cellijn (Fig. 6f-j), tumorvolume en tumorgewicht werden verhoogd in kaalmhuizen geïnjecteerd met miR-301 mimic of si-PTEN; overexpressie van PTEN keerde het effect van miR-301 mimic op tumorgroei om. Tegelijkertijd werd de expressie van CD34 in xeno-transplantaten van kaalmhuizen beoordeeld met immunohistochemische kleuring en de bevindingen toonden aan dat (Fig. 7a-d) in KYSE-30 xeno-transplantaten, MVD werd geremd na miR-301 downregulatie of PTEN upregulatie; gedempte PTEN keerde impact van miR-301 inhibitie op MVD om. In Eca109 xeno-transplantaten, MVD werd verhoogd na miR-301 upregulatie of PTEN downregulatie; de versterking van MVD geïnduceerd door upreguleerde miR-301 kon worden afgeschaft door overexpressie PTEN. Deze data gaven aan dat miR-301 inhibitie of PTEN overexpressie tumorgroei en angiogenese in ESCC onderdrukte, terwijl miR-301 verhooging of PTEN demping omgekeerde effecten had.

Geïnhibeerde miR-301 of overexpressie PTEN remt tumorgroei in ESCC; verhoogde miR-301 of verminderde PTEN verhoogt tumorgroei in ESCC. a Representatieve figuren voor de tumorgroei waargenomen door subcutane tumorigenese in kaalmhuizen na KYSE-30 cellen getransfecteerd; b-d veranderingen van tumorvolume van elke groep na KYSE-30 cellen getransfecteerd; e veranderingen van tumorgewicht van elke groep na KYSE-30 cellen getransfecteerd; f representatieve figuren voor de tumorgroei waargenomen door subcutane tumorigenese in kaalmhuizen na Eca109 cellen getransfecteerd; g-i veranderingen van tumorvolume van elke groep na Eca109 cellen getransfecteerd; j veranderingen van tumorgewicht van elke groep na Eca109 cellen getransfecteerd. *P < 0,05 versus de inhibitor-NC groep; & P < 0,05 versus de oe-NC groep; ^#P < 0,05 versus de miR-301 inhibitors + si-NC groep; a P < 0,05 versus de mimic-NC groep; b P < 0,05 versus de si-NC groep; c P < 0,05 versus de miR-301 mimic + oe-NC groep, n = 3 muizen. Data werden uitgedrukt als gemiddelde ± standaarddeviatie, en ANOVA werd gebruikt voor vergelijkingen onder meerdere groepen

Geïnhibeerde miR-301 of overexpressie PTEN remt angiogenese in ESCC; verhoogde miR-301 of verminderde PTEN verhoogt angiogenese in ESCC. a Representatieve afbeeldingen van tumorweefsels waargenomen door immunohistochemische kleuring in kaalmhuizen na KYSE-30 cellen getransfecteerd; b vergelijkingen van MVD van KYSE-30 in tumorweefsels onder de groepen; c representatieve afbeeldingen van tumorweefsels waargenomen door immunohistochemische kleuring in kaalmhuizen na Eca109 cellen getransfecteerd; d vergelijkingen van MVD van Eca109 in tumorweefsels onder de groepen *P < 0,05 versus de inhibitor-NC groep; & P < 0,05 versus de oe-NC groep; ^#P < 0,05 versus de miR-301 inhibitors + si-NC groep; a P < 0,05 versus de mimic-NC groep; b P < 0,05 versus de si-NC groep; c P < 0,05 versus de miR-301 mimic + oe-NC groep, n = 3 muizen. Data werden uitgedrukt als gemiddelde ± standaarddeviatie, en ANOVA werd gebruikt voor vergelijkingen onder meerdere groepen

Discussie

EC is een soort invasieve maligniteit in de maag-darmtract. Als het hoofdtype van EC, is ESCC een maligne tumor die ontstaat in slokdarmepitheele cellen. De miRNAs, bekend als kleine niet-coderende RNA's, zijn aangetoond om een significante rol te spelen als leidende moleculen in het dempen van RNA. Ons onderzoek was ontworpen om de effecten van miR-301 en het target gen PTEN op ESCC-progressie te verkennen, en we vonden dat de geïnhibeerde miR-301 angiogenese en celdeling in ESCC kon onderdrukken door PTEN te verhogen.

MiR-301 expressie werd beoordeeld, en we vonden dat miR-301 hoog geëxprimeerd was in ESCC cellen in vergelijking met HEEC, en de hogere expressie van miR-301 is ook gevonden in ESCC-weefsels in contrast met de angrenzende normale weefsels. Vergelijkbaar met dit resultaat, hebben Li et al. geïdentificeerd dat miR-301 hoge expressie vertoonde in myocardinfarctweefsels. Daarnaast hebben we aufgeklärd dat PTEN getarget werd door miR-301, en de targetrelatie is aangewezen door een bestaande literatuur. We ontdekten ook dat PTEN, bevestigd als getarget door miR-301, verlaagd was in zowel ESCC-weefsels als cellen. Vergelijkbaar, heeft een eerdere studie ontdekt dat PTEN slecht geëxprimeerd was in ESCC vergeleken met niet-tumorale slokdarmepitheele weefsels. Verder hebben Ma et al. verduidelijkt dat PTEN expressie gedegradeerd was in Eca109 cellijn, wat ook geselecteerd was voor een reeks experimenten in dit onderzoek. Deze studies leveren bewijs voor de hoge expressie van miR-301 en lage expressie van PTEN in ESCC.

Een ander belangrijk resultaat in dit onderzoek gaf aan dat de geïnhibeerde miR-301 de kolonievormingsvaardigheid en celproliferatie van ESCC cellen kon remmen via het verhogen van PTEN expressie, en verhoogde miR-301 of verminderde PTEN had tegengestelde effecten. Vergelijkbaar hebben Han et al. uitgelegd dat de downregulatie van miR-301 gemedieerd door luteoline de capaciteit heeft om celproliferatie in prostaatkanker te remmen. Een recent literatuur onthulde dat de overexpressie van PTEN de proliferatie van pancreaskankercellen onderdrukt, en eenzelfde resultaat is samengevat in een studie gericht op prostaatkanker. Daarnaast hebben we ook ontdekt dat de downregulatie van miR-301 of de elevatie van PTEN migratie en invasie van ESCC cellen kon remmen, en verhoogde miR-301 of verminderde PTEN vertoonde de tegenovergestelde trends. In overeenstemming met dit resultaat, hebben Shi et al. ondersteund dat geïnhibeerde miR-301 migratie en invasie van borstkankercellen atenueerde, en het is gerapporteerd dat de migratie en invasie van ESCC cellen kon worden geremd door de inhibitie van miR-130b en de elevatie van PTEN. Deze publicaties hielpen de oncogene rol van miR-301 en tumorremmende effect van PTEN in diverse humane kankers te verifiëren. Een ander resultaat in ons onderzoek was dat geïnhibeerde miR-301 PTEN overexprimeerde om celapoptose te bevorderen en celdelingsstilstand op de G0/G1 fase in ESCC cellen te induceren, en verhoogde miR-301 of verminderde PTEN had de inverse resultaten. Vergelijkbaar is onthuld door een recent literatuur dat geactiveerde PTEN celdelingsstilstand en apoptose in ESCC induceert. Consistent hebben Tian et al. in hun studie gevonden dat de elevatie van PTEN de angiogenese remde door de expressie van vasculaire endotheliale groeifactor in levercelloom te verlagen. Gebaseerd op de bovenstaande data werden de rollen van miR-301 en PTEN in celapoptose en angiogenese in diverse ziekten verder bevestigd. Gevolgd concludeerden we dat de downregulatie van miR-301 de tumorgroei in ESCC kon remmen door de hoge expressie van PTEN, en een vergelijkbare conclusie is ook onthuld in borstkanker en prostaatkanker. Integenstelling, miR-301 verhooging of PTEN reductie induceerde tumorgroei in ESCC. Het kon worden geconcludeerd dat miR-301 en PTEN deelnameidden aan de in vivo kankerceldeling.

Conclusie

In deze studie hebben we getoond dat de repressie van miR-301 angiogenese, celproliferatie, migratie en invasie verbiedt maar apoptose bevordert in ESCC cellen door PTEN up te reguleren. Dit onderzoek kan het begrip van potentiële moleculaire mechanismen van ESCC verder bevorderen en nieuwe targets voor ESCC behandeling bieden.

Afkortingen

ESCC:

Plaveiselcelcarcinoom van de slokdarm

PTEN:

Fosfatase en tensin homoloog

MVD:

Microvaatdichtheid

EC:

Slokdarmkanker

miRNAs:

MicroRNAs

LNM:

Lymfekliermetastasen

UICC:

Union for International Cancer Control

RT-qPCR:

Reverse transcriptie kwantitatieve polymerase kettingreactie

3'UTR:

3'-Onverteerde regio

WT:

Wild type

MUT:

Mutant type

HRP:

Horseradish peroxidase

FBS:

Foetale kalfserum

OE:

Overexpressie

NC:

Negatieve controle

CCK-8:

Cel telling kit

DMEM:

Dulbecco's Modified Eagle Medium

PI:

Propidium iodide

FITC:

Fluoresceïne isothiocyaan

MVD:

Microvaatdichtheid

ANOVA:

Variantieanalyse