Ultrasmall Superparamagnetische IJzeroxide Nanopartikels voor Stamceltracking in Parkinson Therapie

Samenvatting

Parkinson's ziekte (PZ) wordt gekenmerkt door de progressieve verlies van dopaminerge neuronen in de middenhersenen, en de stamceltransplantatiemethode biedt een veelbelovende strategie voor de behandeling. In deze studies is het volgen van de biologische gedragingen van de getransplanteerde cellen in vivo essentieel voor een basaal begrip van stamcelfunctie en evaluatie van klinische effectiviteit. In de huidige studie hebben we een nieuwe ultrasmall superparamagnetische ijzeroxide nanopartikels coating met polyacrylzuur (PAA) en methoxypolyethyleenglycol amine (PEG) ontwikkeld door thermische decompositiemethode en een twee-stapsmodificatie. De USPIO-PAA/PEG NP's hebben een uniforme diameter van 10,07 ± 0,55 nm en een juiste absorptiepiek van de corresponderende liganden, zoals getoond door TEM en FTIR. MTT liet zien dat de overleving van cellen geïncubeerd met USPIO-PAA/PEG NP's boven de 96% bleef. De gesynthetiseerde USPIO-PAA/PEG had een goede relaxatiesnelheid van 84,65 s⁻¹ Mm⁻¹, wat aangeeft dat ze efficiënt opgenomen en getraceerd kunnen worden door MRI. Verder werden de primaire humane vetweefsel-afgeleide stamcellen (HADSCs) gekarakteriseerd, gelabeld met USPIO-PAA/PEG en getransplanteerd in het striatum van 6-hydroxydopamine (6-OHDA)-geïnduceerde PZ ratmodellen. De gelabelde cellen konden door MRI getraceerd worden tot 3 weken na de transplantatieoperatie; bovendien verzwakte transplantatie met de gelabelde HADSCs de apomorfine-geïnduceerde rotaties in PZ-modellen significant en verhoogde het aantal dopaminerge neuronen in de substantia nigra. Over het algemeen biedt de ontwikkeling van USPIO-PAA/PEG NP's een veelbelovend hulpmiddel voor in vivo traceringstechniek van celtherapie en identificeert een nieuwe strategie om stamcellen met therapeutisch potentieel in PZ te tracken.

Inleiding

Parkinson's ziekte is een neurodegeneratieve ziekte die gekenmerkt wordt door het progressieve verlies van dopaminerge neuronen in de middenhersenen. De relatief focale schade maakt het een goede kandidaat voor cel-gebaseerde therapieën. Verscheidene celtypen, variërend van foetale middenhersensweefsel [1] tot geïnduceerde neuronen afgeleid van embryonale stamcellen (ESC) of geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC) [2], zijn geïmpliceerd in de behandeling van PZ; echter, ethische zorgen en het potentiële risico op tumorogenese konden niet vermeden worden tijdens de toepassing [3]. Mesenchymale stamcellen (MSC) zijn multipotente stamcelpopulaties die in het afgelopen decennium gerapporteerd zijn als een veelbelovend therapeutisch hulpmiddel voor neurodegenerative ziekten, inclusief PZ [4, 5]. Vergeleken met andere celtypen, tonen MSC goede proliferatie, wijdverspreide beschikbaarheid door het menselijk lichaam en immunonderdrukkende capaciteit. Sommige studies hebben getoond dat intracraniële transplantatie van MSC's neuroprotectie, neuronale differentiatie en immunomodulatie bevordert [6,7,8]. In deze studies is het volgen van de levensvatbaarheid, migratie en integratie van getransplanteerde cellen in vivo essentieel voor een basaal begrip van stamcelfunctie en evaluatie van klinische effectiviteit.

Om de therapeutische effecten van de getransplanteerde cellen beter te analyseren, zijn verschillende tracers ontwikkeld. De veiligheid en effectiviteit van tracers zijn de meest kritische factoren die de toepassing beïnvloeden. Vergeleken met labelen met fluorescente proteïnen [9], zou tracking met superparamagnetische ijzeroxide (SPIO) deeltjes geen genetische modificatie aan de getransplanteerde cellen brengen [10,11,12]. Verscheidene studies hebben SPIO gebruikt als een effectief contrastmiddel om de getransplanteerde cellen te visualiseren en te tracken [6, 13, 14]. Echter, sommige van de commercieel beschikbare SPIO zijn gerapporteerd om de normale functies van MSC te beïnvloeden [15,16,17]; daarom zijn uitgebreide inspanningen gewijd aan de ontwikkeling van nieuwe SPIOs. In de huidige studie synthetiseerden we een ultrasmall SPIO nanopartikels (USPIO) coating met polyacrylzuur (PAA) en een daaropvolgende methoxypolyethyleenglycol amine (PEG) laag. De nieuwe USPIO-PAA/PEG toont goede cellulaire internalisatie en langetermijn MRI tracking capaciteit in vitro en in vivo. Bovendien behielden de USPIO-PAA/PEG-gelabelde MSC's afgeleid van humaan vetweefsel (HADSCs) de biologische kenmerken, verbeterden de gedragsstoornissen en verhoogden TH-immunoreactiviteit in de substantia nigra van PZ diermodellen.

Materialen en Methode

Materialen

IJzeracetylacetonaat, TREG (triethyleenglycol), diethyleenglycol en PEG werden gekocht bij Aladdin Industrial Corporation (Shanghai, China). Methylthiazolyldifenyl-tetrazoliumbromide (MTT) werd gekocht bij Sigma-Aldrich Corporation (Shanghai, China). Dulbecco's gemodificeerde eagle medium (DMEM), trypsin–EDTA (0,25%) en foetale runderserum (FBS) werden gekocht bij Thermo Fisher Scientific. 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride en N-Hydroxy succinimide werden gekocht bij Sigma-Aldrich (China). N, N-Dimethylformamide, absolute ethylalcohol en ethylacetaat werden gekocht bij Sinopharm Chemical Reagent Corporation. Ultrazuiver water werd geproduceerd door Millipore zuivere en ultrazuivere waterzuiveringssystemen. Antihuman CD90-FITC, antihuman CD45-PE, antihuman CD34-FITC en antihuman CD105-PE werden gekocht bij Biolegend.

Synthese van USPIO

De USPIO werd gesynthetiseerd door de polyolmethode zoals eerdere onderzoek [18,19,20,21]. Experimentele stappen zijn als volgt: ijzeracetylacetonaat 1 mmol en TREG 25 mL werden gemengd in een drie-hals fles, welke verbonden was met argon, bolvormige condensator en thermometer. Na incubatie met argonstroom voor 15 min, werd het mengsel verhit tot 120℃ (verhittingsgraad is 3 °C/min) en 1 uur gehandhaafd, en vervolgens werd het mengsel verder verhit tot 250 °C met dezelfde verhittingsgraad en 30 min gehandhaafd. De reactiemengsel werd natuurlijk afgekoeld tot kamertemperatuur, verdund met 2 mL absolute ethylalcohol, gevolgd door neerslag met ethylacetaat. Het sediment werd verzameld door centrifugatie bij 8000 rpm voor 20 min en vervolgens heropgelost in absolute ethylalcohol. De USPIO werd opgeslagen in absolute ethylalcohol bij 4 °C voor verder gebruik.

Bereiding van PAA/PEG Gecoate USPIO

De USPIO-PAA werd verkregen volgens een eerdere rapportage [22]. In detail, polyacrylzuur (PAA) 1,5 g werd opgelost in 24 mL diethyleenglycol. Na een 5-min argonstroom, werd het mengsel verhit tot 110 °C en gehandhaafd tot de oplossing helder was. De ethanol dispersieoplossing bevattende 28 mg USPIO bereid in de vorige stap werd na ultrasoon dispersie toegevoegd aan de bovengenoemde heldere oplossing. De oplossing werd uiteindelijk verhit tot 210 °C met een snelheid van 3 °C/min. De reactie werd gestopt na 2 uur reflux en natuurlijk afgekoeld tot kamertemperatuur. Na afkoeling werd ethylacetaat toegevoegd aan de reactieoplossing om de USPIO NP's te neerslaan en vervolgens gecentrifugeerd bij 8000 rpm voor 20 min om het supernatans te verwijderen. Het neerslag werd vervolgens gedispergeerd in ethanol, gevolgd door neerslag met ethylacetaat. Na de wasprocedures voor drie keer, werd de USPIO-PAA gedispergeerd in ultrazuiver water voor verder gebruik. Om de biocompatibiliteit te verbeteren, koppelden we verder PEG aan het oppervlak van nanopartikels door EDC en NHS-gemiddelde amidatie [23]. 0,45 g PEG werd opgelost in 5 ml ultrazuiver water en toegevoegd aan de 15 ml USPIO-PAA dispersie (bevat 35 mg Fe) aangevuld met 20 mg EDC en 12 mg NHS. Het mengsel werd mechanisch gerold bij kamertemperatuur voor 2 uur, en vervolgens werd 10 ml DMF oplosmiddel toegevoegd, water verwijderd bij 40℃ in de rotary verdampingapparatuur. Uiteindelijk werden 40 mg DEC en 24 mg NHS toegevoegd aan het mengsel, mengend bij kamertemperatuur voor 48 uur. De reactieoplossing werd overgebracht naar een dialysezak in ultrazuiver water voor 72 uur, gedurende welke ultrazuiver water elke 12 uur vervangen werd. Het mengsel werd verder overgebracht in een ultrafiltratiebuis om moleculen met een Mr > 30 kD te verzamelen door centrifugatie bij 4000 rpm voor 10 min. Het eindproduct werd opgelost in ultrazuiver water en opgeslagen bij 4 °C. In sommige gevallen werd SPIO-PAA/PEG opgelost in water verzameld door centrifugatie met een ultrafiltratiecentrifugetje (> 30 KD poriënmaat, Millipore), en de pellets werden gedroogd in een vacuümoven voor verder experiment.

Karakterisering van NP's

De deeltjesgrootte, grootteverdeling en morfologie van de monsters werden geanalyseerd door TEM. De coatinglaag werd gemeten door negatieve kleuring. Na ultrasoon dispersie, werden de USPIO-PAA en USPIO-PAA/PEG in waterige oplossing toegevoegd aan het koperen netwerk van 300-mesh koolstof ondersteunende membraan, natuurlijk gedroogd en vervolgens in een projectie elektronenmicroscoop (Tecnai G2F20 s-twin, FEI) geplaatst voor observatie.

De infraroodspectroscopieanalyse wordt uitgevoerd op Agilent Technologies Cary 600 Series FTIR Spectrometer, waar het gedroogde monsterpoeder direct aan de monstertank wordt toegevoegd voor detectie.

De Fe-inhoud in USPIO-PAA/PEG dispersie werd bepaald door vlamatoomabsorptiespectrometrie (FAAS), wiens model PerkinElmer Analyst 700 is. Eerst werd 1, 2, 3, 4 en 5 μg/mL ijzer standaardoplossing geconfigureerd om de standaardcurve te tekenen, en vervolgens werd 100 μL USPIO-PAA of USPIO-PAA/PEG dispersieoplossing opgelost met salpeterzuur, en de ijzerinhoud bepaald in een 50-mL volumetrische fles.

Magnetische resonantie imaging van de nanopartikels werd uitgevoerd op klinische scanners met magnetisch veld van 3 T in de afdeling imaging van het eerste geaffilieerde ziekenhuis van Soochow Universiteit. De nanopartikels werden gedispergeerd in 1% agarose geloplossing volgens de corresponderende concentratie. Na het stollen van de oplossing, werd de transversale relaxatietijd van de monsters gemeten door multi-echo sequentie. Exporteren van de verwerving van MRI in DICOM formaat en vervolgens gebruikmakend van de RadiAnt DICOM Viewer om te openen, de grijwaarden lezen, door de grijwaarden van verschillende echo tijden in te voeren in origin voor fitting, werden de transversale relaxatietijden van USPIO dispersies met verschillende concentraties verkregen; ten slotte werd de transversale relaxatiesnelheid r2 van USPIO-PAA en USPIO-PAA/PEG monsters verkregen door lineaire fitting met de transversale relaxatiesnelheid van 1/T2 en de Fe-concentratie van de monsters. De magnetische hystereselus van USPIO-PAA en USPIO-PAA/PEG werden verkregen door gebruik te maken van Quantum Design DynaCool-9 apparaat in Suzhou University of science and technology volgens de methoden beschreven eerder [24].

HADSCs Isolatie en Identificatie

Alle studies werden uitgevoerd in overeenstemming met de 'Ethische Leidende Principes op Humane Embryonale Stamcelonderzoek' (van het Ministerie van Wetenschap en Technologie en het Ministerie van Volksgezondheid, Volksrepubliek China, 2003) en de Verklaring van Helsinki. Vetweefselmonsters werden verkregen met toestemming na informatie en ethische goedkeuring van het eerste geaffilieerde ziekenhuis van Soochow Universiteit. Het vetweefsel werd gewassen en in kleine stukjes gesneden na het verwijderen van bloedvaten en bindweefsel onder een anatomische microscoop. De blokken werden verteerd met type I collagenaas (0,3 pzu/mL) bij 37 °C voor 30 min, gevolgd door centrifugatie bij 500g voor 10 min. Het celpellet werd opgeschorst in DMEM + 10% FBS en gezaaid met een dichtheid van 8 × 10⁴/cm². Na 48 uur werd het oude medium bevattende drijvende cellen weggegooid en vervangen door vers medium.

HADSCs werden gekarakteriseerd door flowcytometrie voor oppervlaktemarkers specifiek labelend mesenchymale (CD90 en CD105) en hematopoïetische (CD34 en CD45) stamcellen. In totaal 1 × 105 cellen werden geoogst en geïncubeerd met ofwel PE, FITC, APC/cy7 of PerCP-geconjugeerde antilichamen tegen CD34, CD45, CD90 en CD105 muis-antihumane monoclonale antilichamen en geschikte isotype controles. Gekleurde cellen werden geanalyseerd met een flowcytometer (LSRFortessa, BD, VS), en data werden geanalyseerd met FlowJo software. Vier fenotypen van CD90+, CD105+, CD34− en CD45− werden geselecteerd voor de oppervlaktemarkers van HADSCs. Expressieniveaus van celoppervlaktemarkers werden geïdentificeerd door flowcytometrie (BD LSRFortessa).

De adipogene en osteogene differentiatie van HADSCs werden geëvalueerd door Oil Red O en Alizarin Rode Kleuring, respectievelijk. HADSCs werden gekweekt met ofwel MesenCultTM Adipogene Differentiatie medium (Stem cell Tech., 05412) of OriCellTM Osteogene Differentiatie Kit (Cyagen, HUXMA-90021). Voor adipogene differentiatie van HADSCs, werden cellen beoordeeld op dag 14 door kwalitatieve Oil Red O kleuring voor lipiden gevulde volwassen adipocyten (VivaCell Biosciences, C37A00150). Voor osteogene differentiatie van HADSCs, werden cellen beoordeeld op dag 21 door Alizarin Rode Kleuring voor calcium nodule in volwassen osteocyten (VivaCell Biosciences, C37C00150). Afbeeldingen werden verkregen met een omgekeerde Nexcope microscoop.

In Vitro Cellulaire Opname van USPIO-PAA/PEG en Biocompatibiliteits Evaluatie

HADSCs werden geplateerd in een 6-put plaat met een dichtheid van 1 × 10⁶ per put. Cellen werden geïncubeerd met het medium bevattende USPIO-PAA/PEG (Fe 10 μg/mL en 0,1 μg/mL) voor 2 uur, en gekleurd met Pruisisch blauw (PB) kleuring voor intracellulaire Fe identificatie.

De biocompatibiliteit van USPIO-PAA/PEG werd bepaald door MTT colorimetrie en 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU) incorporatie assay (EdU proliferatie kit, Thermo). Voor MTT, werden HADSCs geplateerd in een 96-put plaat met een dichtheid van 5 × 10³ per put en geïncubeerd met verschillende concentraties (0, 10, 20, 40, 80, 160 Fe μg/mL) van USPIO-PAA/PEG 24 uur, 48 uur of 72 uur. 20 μl MTT oplossing (5 mg/mL) werd aan elke put toegevoegd voor 4 uur, gevolgd door 150 μL dimethylsulfoxide om de kristallen op te lossen. Absorptiewaarde van elke put werd gemeten bij OD 570 nm met behulp van enzym-gelabeld instrument (BioTek Synergy HT). Voor EdU assay, werden HADSCs geïncubeerd met de SPIO-PAA/PEG bij een 160 Fe μg/mL voor 72 uur, gevolgd door de incubatie met 10 μM EdU voor 24 uur. Cellen werden verzameld, gefixeerd met 4% paraformaldehyde en geneutraliseerd met een 2 mg/mL glycine. Na permeabilisatie werden cellen geïncubeerd met de kleurstofoplossing (Azide 647 complex), de EdU incorporatiepercentages werden geëvalueerd door flowcytometrie.

6-OHDA-Geïnduceerd PZ Model

Vijftien–twintig mannelijke Wistar ratten (SPF graad, gewicht 220 ± 20 g) werden gebruikt voor in vivo tracing van USPIO-PAA/PEG-gelabelde HADSCs op PZ dieren. Alle procedures werden uitgevoerd volgens de Regels in China (Reglement voor de administratie van zaken betreffende proefdieren, 2017) en goedgekeurd door de Institutionele Dierverzorging en Gebruikscommissie bij Chinese Academy of Sciences. Tegenwoordig, werden dieren gehuisvest onder gecontroleerde verlichting (12/12-uurs licht/donker cyclus, "aan" om 7 uur) met ad libitum toegang tot voedsel en water. PZ model werd bereid door 2-punt injectie van 6-hydroxydopamine (6-OHDA, Sigma, St. Louis, MO, VS) in het unilaterale striatum van ratten. Zoals eerder beschreven [25, 26], werden ratten stereotactisch geïnjecteerd met 3 μL van 6-OHDA oplossing (5 μg/μL) op 2 coördinaten (AP: 1,2 mm, ML: 2,2 mm, DV: − 4,0 tot 6,0 mm; en AP: − 1,0 mm, ML: 4,4 mm, DV: − 4,5 tot 6,5 mm), respectievelijk. Apomorfine-geïnduceerde rotatie (0,5 mg/kg, subcutaan) tests werden gebruikt om de geldigheid van PZ modellen te testen. De ratten werden geïnjecteerd met apomorfine (0,5 mg/kg) subcutaan op 1, 2 en 3 weken na 6-OHDA behandeling, en de rotatiescores werden geëvalueerd voor 30 min in een open veld. Het PZ model heeft meer dan 7 rotaties per min geïnduceerd door apomorfine en werd als geslaagd beschouwd.

Celtransplantatie en In Vivo MRI Imaging

HADCs werden geïncubeerd met USPIO-PAA/PEG (ijzerconcentratie was 10 μg/mL) voor 2 uur toen ze 80% confluentie bereikten. 3 weken na PZ modelbereiding, werden 3 × 10⁶ van USPIO-PAA/PEG-gelabelde HADCs of fysiologisch zoutwater geïnjecteerd in het linker striatum van PZ ratmodellen op de volgende coördinaat (AP: 1,2 mm, ML: 2,2 mm, DV: − 4,0 tot 6,0 mm). Dieren die transplantatie ondergingen, werden geadministreerd met buprenorfine (0,5 mg/kg) onmiddellijk na de operatie en voor 2 dagen daarna. Deze dieren werden onderworpen aan de apomorfine-geïnduceerde rotatietests op 1, 2 of 3 weken na de transplantatieoperatie.

Voor in vivo MRI, werden dieren geïmageerd met behulp van een in vivo imaging systeem (IVIS) klein dier imaging systeem (PerkinElmer, Waltham, MA, VS) op de 3e, 9e, 15e en 21e dag na de fysiologisch zoutwater of HADSCs injectie.

Histologische Analyse

De hersenen van de overige ratmodellen werden geoogst en gesneden tot een dikte van 30 mm voor analyse 3 weken na stamceltransplantatie (n = 5 per groep). Coupes werden geïncubeerd met anti-tyrosine hydroxylase (TH, abcam, Engeland) en gevisualiseerd met Alexa-594-geconjugeerde ezel anti konijn antilichaam (Abcam). DAPI werd gebruikt voor tegenkleuring met kernen. Afbeeldingen werden vastgelegd met Leica TCS SP5 confocale microscoop.

Statistische Analyse

Numerieke data werden uitgedrukt als het gemiddelde ± SD. Data werden onderworpen aan 2-zijdige Student t-toetsen of one-way ANOVA met behulp van GraphPad Prism 7.0 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, VS) om het verschil te evalueren. * geeft p < 0,05 aan en NS geeft geen significant verschil aan.

Resultaten

De Synthese en Karakterisering van Nanopartikels

Het experimentele ontwerp is getoond in Fig. 1. De hydrofobe USPIO NP's werden bereid door gebruik te maken van de thermische decompositiemethode. Zoals getoond in Fig. 2a–c, was de diameter van de oorspronkelijke USPIO NP's 4,07 ± 0,57 nm; door coating met PAA, nam de diameter van de USPIO-PAA NP's toe tot 6,34 ± 0,54 nm; een verdere modificatie van de NP's met PEG maakt de diameter van USPIO-PAA/PEG NP's 10,07 ± 0,55 nm bereiken. Alle drie nanopartikels waren bolvormig van vorm en gelijkmatig gedispergeerd. Statistische analyse toonde aan dat er significant verschil was (F = 10, **p < 0,01, ##p < 0,01) tussen de diameters van de USPIO, USPIO-PAA en USPIO-PAA/PEG NP's, wat een succesvolle modificatie met PAA en PEG aangeeft (Fig. 2d).

Door gebruik te maken van de infraroodabsorptiemethode, vonden we dat USPIO-PAA een duidelijke carbonylabsorptiepiek heeft bij 1728 cm⁻¹ door de carbonyl strekkingsvibratie piek in het PAA molecuul; USPIO-PAA/PEG heeft een koolstof-stikstof binding in-plaat buigingsvibratie piek bij 1595 cm⁻¹ en een strekkingsvibratie piek van hydroxyle groep bij 3440 cm⁻¹ (Fig. 2e). Al deze data bevestigden verder dat PAA of PEG moleculen met succes zijn gemodificeerd aan het oppervlak van NP's.

USPIO-PAA/PEG Toonde Goede In Vitro Magnetische Respons en Biocompatibiliteit met HADSC

De in vitro imaging capaciteit van USPIO-PAA en USPIO-PAA/PEG werd geëvalueerd door de grijwaarden van MRI afbeeldingen bij verschillende concentraties (equivalent aan Fe concentraties). Na fitting, werden de transversale relaxatietijden van de dispersies bij verschillende concentraties verkregen. Door de transversale relaxatiesnelheid van 1/T2 als de verticale coördinaat en de Fe-concentratie als de horizontale coördinaat in te stellen, werd de transversale relaxatiesnelheid van USPIO-PAA berekend als 107,94 s⁻¹ mm⁻¹ (Fig. 3a), en 84,65 s⁻¹ mm⁻¹ voor USPIO-PAA/PEG (Fig. 3b). Beide deeltjes toonden goede MRI imaging eigenschappen. De magnetische hystereselus van SPIO-PAA en de SPIO-PAA/PEG toonden aan dat de verzadigingsmagnetisatiewaarde van SPIO-PAA 57 emu/g is boven 10.000 Oe (Fig. 3c), en die van SPIO-PAA/PEG is 40 emu/g boven 10.000 Oe (Fig. 3d). De coercitieve kracht en remanentie waren dicht bij nul (Fig. 3c, d), wat verder aangeeft dat zowel SPIO-PAA als SPIO-PAA/PEG superparamagnetisme waren.

Door de USPIO-PAA/PEG NP's met HADSCs te incuberen voor verschillende tijd, vonden we dat USPIO-PAA/PEG NP's geen significante effecten hebben op de overleving van cellen (p > 0,05). De cellevensvatbaarheid van HADSCs blijft boven 96% wanneer de equivalente Fe-concentratie varieerde van 0 tot 160 μg/mL. Bovendien induceert de toename van de incubatietijd (van 24 tot 72 uur) geen significante celverlies bij elke Fe-concentratie (Fig. 4a). Een vergelijkbare observatie werd verkregen toen USPIO-PAA/PEG NP's geïncubeerd werden met iPSCs bij verschillende concentraties (Fig. 4b). Zelfs toen HADSCs behandeld werden met de 160 μg Fe/mL USPIO-PAA/PEG voor 72 uur, is de proliferatiecapaciteit, zoals aangegeven door de EdU incorporatiepercentages, niet beperkt door de aanwezigheid van USPIO-PAA/PEG (Fig. 4c). Al deze data gaven de biosafety van de gesynthetiseerde USPIO-PAA/PEG NP's aan.

Om te identificeren of cellen effectief gelabeld konden worden door USPIO-PAA/PEG NP's, hebben we de HADSCs geïncubeerd met USPIO-PAA/PEG NP's bij equivalente Fe 10 μg/mL of 0,1 μg/mL voor 2 uur. Zoals getoond in Fig. 4d, werden een groot aantal NP's gekleurd in blauw waargenomen in bijna 100% van HADSCs in de aanwezigheid van USPIO-PAA/PEG (Fe 10 μg/mL). Zelfs toen de dosis van USPIO-PAA/PEG verminderd werd tot 0,1 μg Fe/ml, observeerden we nog steeds rather uniform en gedispergeerd PB kleuren in bijna alle HADSC. Vergeleken met sommige van de andere gerapporteerde SPIOs [14, 27, 28], vertoonde USPIO-PAA/PEG hoge celopname-efficiëntie.

Langetermijn Tracking van USPIO-PAA/PEG NP's-Gelabelde HADSCs in PZ Rat Modellen

HADSCs gelabeld met USPIO-PAA/PEG NP's werden getransplanteerd in het linker striatum van PZ ratmodel door stereotactische injectie. Zoals getoond in Fig. 5, observeerden we een duidelijke MRI signaal in het linker striatum 3 dagen na de HADSC transplantatie, wat een adequate in vivo tracing van de getransplanteerde cellen aangeeft. Een dynamische observatie op D3, D9, D15 en D21 na transplantatie toonde aan dat de getransplanteerde cellen met NP-labeling duidelijk getraceerd konden worden tot 3 weken, en de MRI signalen toonden geen duidelijke reductie tijdens het proces. Deze resultaten geven aan dat de gesynthetiseerde nanopartikels goed potentieel hebben voor de in vivo tracing van de getransplanteerde cellen.

USPIO-PAA/PEG NP's-Gelabelde HADSCs Vertoonden Therapeutische Effecten in PZ Model

Om te evalueren of NP-gelabelde HADSCs therapeutische effecten vertoonden, voerden we eerst een fenotypische karakterisering van de geïsoleerde HADSCs uit. Zoals getoond in Fig. 6a, waren de gekweekte HADSCs spindelvormige cellen. De flowcytometrie analyse toonde aan dat de HADSCs hoog tot uitdrukking brachten van markers voor mesenchymale cellen, zoals CD90 (> 99%) en CD105 (> 99%), terwijl weinig van hen hematopoïetische markers zoals CD34 en CD45 uitdrukten (Fig. 6b–g). De HADSCs konden differentieren naar ofwel adipogene of osteogene lijnen onder bepaalde condities, en de differentiatiecapaciteit werd getoond door Oil Red O of Alizarin Rode Kleuring, respectievelijk (Fig. 5h). Let op de lipiddruppels of gecalcificeerde nodulen in de gedifferentieerde HADSCs, terwijl geen dergelijke structuur in de controle HEK293 cellen (Fig. 6h). Al deze geven aan dat HADSCs voldoen aan de criteria van mesenchymale cellen.

De apomorfine-geïnduceerde rotaties waren 17,1 ± 1,79, 28,7 ± 1,77 en 31,86 ± 1,72 per minuut in de 1e, 2e en 3e weken na 6-OHDA injectie, wat de succesvolle vestiging van het rat PZ model bevestigde. Zoals getoond in Fig. 7, daalde de rotatieaantallen van PZ ratmodellen tot 32,59 ± 1,12, 31,85 ± 1,98 en 31,54 ± 1,73 in de 1e, 2e en 3e weken gevolgd door NP-gelabelde HADSCs transplantatie in het striatum van laesie zijde. Statistische analyse onthulde een significant verschil tussen de fysiologisch zoutwater- en de HADSC-geadministreerde groepen vanaf de 2e week na transplantatieoperatie (p < 0,01 op 2e week, p < 0,01 op 3e week; n = 5 in elke groep), wat aangeeft dat de NP-gelabelde HADSCs de gedragsstoornissen in de PZ modellen verbeteren.

PZ wordt gekenmerkt door het verlies van neuronen die tyrosine hydroxylase (TH) expresseren in de substantia nigra. Door gebruik te maken van immunokleuring tegen TH, vonden we dat 6-OHDA de TH-exprimerende neuronen in de substantia nigra reduceert, en de transplantatie met HADSCs in het striatum van PZ ratmodellen kon dergelijke reductie verlichten (Fig. 8). Gecombineerd met de observatie dat celtransplantatie de gedragsstoornissen van PZ ratten verlicht, concludeerden we dat USPIO-PAA/PEG NP's-gelabelde HADSCs therapeutische effecten uitoefenen in PZ ratmodellen.

Discussie

Celtherapie is een veelbelovende strategie voor de behandeling van neurodegenerative ziekten en is de afgelopen 20 jaar in de voorhoede van preklinisch onderzoek geweest [29, 30]. Het traceren van getransplanteerde cellen is een onmisbaar onderdeel voor de verduidelijking van onderliggende mechanismen alsook de evaluatie van klinische effecten; het is echter uitdagend en tot op zekere hoogte, belemmerde de toepassing van celtherapie [31, 32]. Gecomputeriseerde tomografie (CT), nabij-infrarood fluorescentie imaging (NIFI) en MRI zijn de meest gebruikte methoden voor de in vivo tracking van getransplanteerde cellen [31, 32]. Vergeleken met de rather hoge straling van CT en lage gevoeligheid van NIFI, toont MRI goede imaging van diep weefsel, hoge contrast en lage ioniserende straling, wat het een goede kandidaat maakt voor de in vivo tracing [33,34,35,36]. De ontwikkeling van geschikte tracers voor MRI wordt daarom een onmisbaar onderdeel van het bevorderen van de toepassing van celtherapie.

SPIO is een simpele en betrouwbare labelstrategie voor MRI visualisatie. Om langetermijn in vivo tracing van de getransplanteerde cellen te bereiken, is vereist dat de SPIO deeltjes een uniforme en ultrasmall grootte hebben, aangezien grote deeltjes kunnen leiden tot onevenredige verdeling van de tracers en interfereren met de normale bloedcirculatie [33]. Bovendien zijn de internalisatie-efficiëntie en biocompatibiliteit van nanopartikels een andere belangrijke index om de tracers te evalueren. Nanopartikels gaan meestal naar binnen cellen door vloeistof-fase endocytose [37], receptor-gemiddelde endocytose [38] en fagocytose [39]. Om een betere cellulaire opname te bereiken, worden de SPIO deeltjes meestal gemodificeerd met intermediaire liganden [18, 40, 41].

Naast celtracking, is SPIO ook toegepast voor medicijnlevering [42]. De weefseldistributie en farmacokinetische clearance zijn belangrijke index voor beide toepassingen. Vergeleken met de NPs-PAA, toonden NPs-PAA/PEG langere retentietijd in bloed en langzamere urineclearance [43]. Dicht met PEG gecoate NP's bieden veel meer uniforme verdeling over slijmvlies epitheele oppervlakken, inclusief de gastro-intestinale tractus [44], respiratoire systeem [45, 46] en hersentumor [42], etc. Bovendien vermindert PEG coating de hechting van proteïnen en vorming van corona, wat op zijn beurt de uniforme verdeling van de NP's kan bevorderen ten koste van verminderde opname [47]. Als een potentiële goede diagnostische en therapeutische tool, is de labelcapaciteit van SPIO-PAA/PEG aan MSC's en de verdere toepassing in hersenstoornissen zoals PZ niet goed bestudeerd, en de huidige studie was ontworpen om deze vraag te beantwoorden. In de huidige studie synthetiseerden we een nieuwe ultrasmall USPIO-PAA/PEG nanopartikels, door de SPIO kernen te modificeren met PAA en PEG liganden, respectievelijk. De USPIO-PAA/PEG NP's hebben uniforme ultrasmall diameter (10,07 ± 0,55 nm), goede dispersie in waterige oplossing, biocompatibiliteit met diverse celtypen alsook goede magnetische respons effect in vitro en in vivo. Belangrijk is dat de signalen van gelabelde HADSCs duidelijk gedetecteerd konden worden onder MRI na hersentransplantatie tot drie weken, wat het goede potentieel voor klinische toepassing aangeeft.

PZ wordt gekenmerkt door een progressief verlies van dopaminerge neuronen in de substantia nigra, en door het tekort aan dopaminerge niveaus in de dopaminerge netwerken [1]; de meest getroffen is de nigrostriatale weg inclusief het striatum. In de huidige studie transplanteden we USPIO-PAA/PEG-gelabelde HADSCs in het striatum van PZ ratmodellen, en vonden we dat dergelijke transplantatie de gedragsstoornissen verbeterde; bovendien verzwakte het het verlies van dopaminerge neuronen in de substantia nigra tot een bepaalde mate. Op dezelfde manier rapporteerde Ardeshir et al. dat het transplanteren van de MSC's afgeleid van rat vetweefsel de apomorfine-geïnduceerde rotaties in PZ modellen verzwakte [48]. Verschillend van het transplanteren van foetale middenhersensweefsels [49] of dopaminerge neurale progenitoren [50], oefent HADSCs zijn therapeutische effecten voornamelijk uit door paracrine effecten [51, 52], in plaats van te substitueren voor de beschadigde weefsels. Studies hebben getoond dat MSC's fungeren als bevorderders van immunomodulatie, neuroprotectie en neuronale differentiatie, en deze effecten zijn essentieel gemedieerd door het secretome vrijgegeven door MSC's [6, 7, 51]. Ons resultaat is consistent met deze observaties; bovendien geeft het aan dat de nieuwe USPIO-PAA/PEG tracers niet interfereerden met de neuroprotectie effecten van HADSCs.

Conclusies

We hebben een nieuwe USPIO-PAA/PEG tracers ontwikkeld die hoge celopname-efficiëntie, uitstekende biocompatibiliteit en langetermijn MRI tracing capaciteiten tonen. De HADSCs gelabeld met USPIO-PAA/PEG konden met MRI getraceerd worden gedurende 3 weken na celtransplantatie. Bovendien verzwakten de gelabelde HADSCs de gedragsstoornissen van PZ modellen significant, en verhoogden het aantal dopaminerge neuronen in de substantia nigra. De ontwikkeling van USPIO-PAA/PEG tracer kan een veelbelovend hulpmiddel bieden in stamcelonderzoek en toepassing.