Voorbereiding en karakterisering van kikkervisjes- en bolvormige hemin-nanodeeltjes voor verbeterde oplosbaarheid

Resultaten en discussie

Vorming en karakterisering van hemin-nanodeeltjes

De morfologie en grootte van hemine-nanodeeltjes vervaardigd met behulp van de dialysemethode werden onderzocht door TEM. Toen de hemineconcentratie 0, 5 mg / ml was, werden hemine-nanostructuren met verschillende grootten gevormd bij verschillende hemine / water-volumeverhoudingen en voor verschillende dialysedagen (Fig. 1, Aanvullend bestand 1:Figuur S1-S3). De nanodeeltjes hadden goed gedefinieerde bolvormen en hadden een diameter van 50-100 nm wanneer de hemine / water-volumeverhouding 1:10 was na 3 dagen dialyse. Met een toename van de hemine / water-volumeverhouding (1:50), werden nanodeeltjes verzameld in staafvormige deeltjes (figuur 1). We ontdekten in het bijzonder dat naarmate de dialysetijd toenam van 1 tot 3 dagen, de hemine-nanodeeltjes uniform werden verspreid (aanvullend bestand 1:figuur S1-S3). De temperatuur (4 en 25 °C) van de dialyse had weinig invloed op de deeltjesgrootte en de verspreiding van hemine-nanodeeltjes (Aanvullend bestand 1:Figuur S4).

TEM-afbeeldingen van hemine-nanodeeltjes bereid door 3 dagen dialyseren met verschillende hemine/water-volumeverhoudingen, waaronder 1:3 (a ), 1:5 (b ), 1:10 (c ), en 1:50 (d ) bij 25°C. De hemineconcentratie was 0,5 mg/ml

Figuur 2 toont de typische TEM-beelden van hemine-nanodeeltjes die zijn voorbereid voor verschillende dialysedagen met een hemineconcentratie van 0,1 mg/ml. De producten waren voornamelijk goed gedefinieerde, afzonderlijk verspreide, structureel ongebruikelijke en kikkervisjesvormige nanodeeltjes. De kikkervisjesachtige nanodeeltjes werden bij voorkeur verdeeld met 3 dagen dialyse. Het kikkervisje vertoonde een significant verschil in grootte van de maximale breedte van de kop (200 nm) tot de staart (100 nm). Onze resultaten toonden aan dat uniform gedispergeerde nanodeeltjes konden worden gevormd bij de hemine/water-volumeverhouding van 1:10 en na 3 dagen dialyseren bij 25°C voor zowel bolvormige als kikkervisjevormige nanodeeltjes. Daarom kozen we deze twee soorten hemine-nanodeeltjes voor het volgende onderzoek.

TEM-beelden van hemine-nanodeeltjes bereid met de hemine/water-volumeverhouding van 1:10 op verschillende dialysedagen, waaronder 1 dag (a ), 3 dagen (b ), en 5 dagen (c ) bij 25°C. De hemineconcentratie was 0,1 mg/ml

Om de grootte van hemine-nanodeeltjes verder te onderzoeken, werd DLS-bepaling gebruikt om de vorming van nanostructuren te bevestigen. De diameters van bol- en kikkervisjevormige nanodeeltjes waren respectievelijk ongeveer 218,2 ±  6.2 en 299.8 ±  7.6 nm (Fig. 3a). De grootte van de nanodeeltjes gemeten met DLS was iets groter dan de resultaten gemeten met TEM; dit verschil werd toegeschreven aan de zwelling van de nanodeeltjes in een waterige oplossing. Het was bekend dat de DLS-meting de hydrodynamische diameters van nanodeeltjes in een oplossing aangaf [15]. Het ζ-potentieel van bolvormige nanodeeltjes (− 21,4 mV) was ongeveer twee keer zo hoog als die van kikkervisjevormige nanodeeltjes (− 10,8 mV) (Fig. 3b). De PDI van de hemine-nanodeeltjes werd ook bepaald om de deeltjesgrootteverdeling te analyseren. De resultaten toonden aan dat de PDI van de bolvormige en kikkervisjevormige nanodeeltjes respectievelijk 0,348 en 0,402 was (figuur 3c). Deze bevinding gaf aan dat de verkregen hemine-nanodeeltjes een goede polydispersiteit hadden.

De gemiddelde grootte (a ), ζ-potentiaal (b ), PDI en troebelheid (c ), en Tyndall-effect (d ) van verschillend gevormde hemine-nanodeeltjes

Als een lichtstraal door een colloïdale dispersie gaat, wordt een deel van het licht verstrooid door de colloïdale deeltjes die in de oplossing aanwezig zijn, wat leidt tot een divergentie van de lichtstraal. Dit gedrag wordt het Faraday-Tyndall-effect genoemd [16]. In dit geval vertoonde de gratis hemine-oplossing geen Tyndall-effect (aanvullend bestand 1:figuur S5). Niettemin werd het Tyndall-effect waargenomen in de suspensie van zowel bolvormige als kikkervisjevormige nanodeeltjes (figuur 3d), waarmee de vorming van colloïden of nanodeeltjes in de fijne suspensie werd geverifieerd. Het vormingsmechanisme van hemine-nanodeeltjes door de dialysemethode kan te wijten zijn aan diffusie van oplosmiddel door het grensvlak tussen waterfase buiten en organische oplosmiddelfase binnen, wat resulteerde in een afname van de oplosbaarheid van hemine en de vorming van kristalkern. Vervolgens werden verschillend gevormde hemine-nanodeeltjes gevormd door de groei en zelfassemblage van een eenkristalkern op verschillende manieren.

UV–Vis-absorptieanalyse

Volgens de bovenstaande resultaten hebben we onderzocht of er verschillen waren tussen de twee vormen van hemine-nanodeeltjes in hun chromofoorgeneratie. Het UV-Vis-spectrum van zowel bolvormige als kikkervisjevormige nanodeeltjes vertoonde dezelfde absorptiebanden bij 265 nm (figuur 4a). De bolvormige nanodeeltjes vertoonden een smalle absorptieband bij 667 nm en 775 nm. Ter vergelijking:de kikkervisjevormige oplossing van nanodeeltjes vertoonde een brede piek bij 658 nm zonder een piek van 775 nm. Bovendien was de absorptie-intensiteit van bolvormige nanodeeltjes hoger dan die van kikkervisjevormige nanodeeltjes. Zo'n groot verschil kon niet worden verklaard door het kikkervisje te beschouwen als een som van een bol en een taps toelopende staaf, noch door een enigszins onvolmaakte bolconfiguratie. De elektronenoscillatie die overeenkomt met een plasmonabsorptie langs de lange as is vertraagd en/of op een reflecterend pad. De optische eigenschappen van hemine-nanodeeltjes waren dus afhankelijk van de vorm, vergelijkbaar met het rapport van Hu et al. [17], die ontdekte dat kikkervisjes- en bolvormige gouden nanodeeltjes verschillende optische eigenschappen hadden.

een UV–Vis-spectrum, b FTIR-spectra, c fluorescentie-emissiespectra, en d XRD-patronen van vrije hemine, bolvormige nanodeeltjes en kikkervisjevormige nanodeeltjes. De nanodeeltjes werden gedispergeerd in gedeïoniseerd water. RC, relatieve kristalliniteit

De gratis hemine-oplossing vertoonde een maximale absorptie bij 344 nm, en dit werd toegeschreven aan de Soret-band die gewoonlijk wordt geassocieerd met porfyrines (aanvullend bestand 1:figuur S5). De absorptieband van hemine-nanodeeltjes verschoof van 344 naar 265 nm, wat suggereerde dat het π-π-conjugatieve effect van hemine-nanodeeltjes was verbeterd. Verrassend genoeg vertoonden beide soorten nanodeeltjes, in vergelijking met vrij hemine, een hoge, sterke nabij-infraroodabsorptie, wat zeer geschikt is voor op absorptie gebaseerde toepassingen, zoals fotothermische therapie en fotoakoestische beeldvorming [18]. Magno et al. [19] rapporteerde ook dat porfyrine-nanodeeltjes met bijna-infraroodabsorptie aanzienlijke belangstelling hebben gekregen voor toepassingen in fototherapieën en fotodiagnostiek, zelfs als magnetische nanodeeltjes voor magnetische hyperthermietherapie en medicijnafgiftesystemen.

Oplosbaarheid

De oplosbaarheid van hemine is een belangrijke factor, die de absorptie-efficiëntie in het lichaam direct kan beïnvloeden. De kwantitatieve oplosbaarheid in water van zuivere hemine- en hemine-nanodeeltjes bij verschillende temperaturen werd getest (tabel 1). Naarmate de temperatuur toenam, nam de oplosbaarheid in water van alle monsters toe. De oplosbaarheid van vrij hemine bij 25, 37, 60 en 80 °C was bijvoorbeeld respectievelijk 0,009 ± 0.000, 0,060 ± 0,002, 0,144 ± 0,004 en 0,245 ± 0,008 mg/ml (tabel 1).

De hoeveelheid bolvormige nanodeeltjes opgelost bij 25, 37, 60 en 80 °C was respectievelijk 1,333 ± 0,023, 1,499 ± 0,072, 1,889 ± 0,081, en 3,853 ± 0,124 mg/mL, en die van kikkervisjevormige nanodeeltjes waren 0.997 ± 0.045, 1.231 ± 0.035, 1.521 ± 0.058 en 1.795 ± 0.050 mg/mL, respectievelijk. De resultaten van het waterige oplosbaarheidsonderzoek van nanodeeltjes lieten een significante toename zien in vergelijking met pure hemine. De bolvormige nanodeeltjes waren bij temperaturen van 25, 37, 60 en 80 °C beter oplosbaar dan die van de kikkervisjevormige nanodeeltjes. Deze bevinding suggereert dat de oplosbaarheid van de bolvormige nanodeeltjes 308,2 keer hoger zou kunnen zijn in vergelijking met vrij hemine bij 25°C. Deze toename in oplosbaarheid was voornamelijk te danken aan de unieke deeltjesgrootte op nanoschaal. Dit resultaat kwam overeen met andere onderzoeken die zijn gerapporteerd door Gidwani en Vyas [13].

FTIR-spectra-analyses

FTIR-spectra kunnen worden gebruikt om typen functionele groepen te identificeren. De band op 3470 cm ^− 1 wordt voornamelijk toegeschreven aan de rekvibratie van N-H- en hydroxylgroepen van hemine (figuur 4b). Een band van 1460 cm ^− 1 wordt toegeschreven aan de N–H-trilling in het vlak als gevolg van de buigtrilling buiten het vlak van –CH₃ van de aromatische pyrroolring van hemine. De piek op 1600 cm ^− 1 is de karakteristieke piek van de amidebinding als gevolg van de rektrilling van C=O van de aan het oppervlak gebonden carboxylgroep van hemine, waaruit blijkt dat de secundaire amidebinding in hemine bestaat. Deze resultaten komen overeen met die van Xi et al. [20]. De piek bij 3470 cm ^− 1 van hemine-nanodeeltjes was breder dan die van vrije hemine, wat duidelijk wijst op de verbeterde waterstofbindingsinteractie tussen nanodeeltjes.

Fluorescentiespectra

De fluorescentie-eigenschappen van vrije hemine- en hemine-nanodeeltjes werden ook gevolgd door fluorescentiespectroscopie. De fluorescentiesignalen van zowel bolvormige als kikkervisjevormige nanodeeltjes waren verhoogd in het schijnbare emissiemaximum bij 500 nm in vergelijking met vrij hemine (figuur 4c). Dit kan te wijten zijn aan de verhoogde oplosbaarheid van hemine na de vorming van nanodeeltjes [21].

XRD-analyse

De kristallijne aard van vrij hemine en hemine-nanodeeltjes werd bevestigd door XRD. Zoals geïllustreerd in figuur 4d, vertoonden de XRD-patronen van vrij hemine verschillende relatief sterke reflectiepieken bij 2θ =-6,8, 9,6, 11,5, 16,2, 21,5 en 23,9°. De karakteristieke pieken van de bolvormige nanodeeltjes waren dezelfde als die van vrij hemine, wat aangeeft dat de kristalstructuur van bolvormige nanodeeltjes niet veranderde in de nanodeeltjes formuleringen. Voor de kikkervisjevormige nanodeeltjes verdwenen echter de meeste karakteristieke pieken. Bovendien was de relatieve kristalliniteit van bol- en kikkervisjevormige nanodeeltjes significant verlaagd tot respectievelijk 47,0% en 35,7%, vergeleken met 56,7% voor gratis hemine. Deze resultaten gaven aan dat de formuleringen van nanodeeltjes de gedeeltelijk kristallijne gebieden van hemine zouden kunnen vernietigen.

Effecten van pH, temperatuur en zoutconcentratie op stabiliteit

De variaties in de grootte, PDI, ζ-potentiaal en troebelheid van hemine-nanodeeltjes na incubatie bij verschillende pH-niveaus [2,3,4,5,6,7,8,9,10,11] werden gemeten (Fig. 5a , B). De grootte van hemine-nanodeeltjes bleef vrijwel onveranderd met gemiddelde diameters van ongeveer 200 nm onder zure omstandigheden (figuur 5a). Bij lage pH-waarden van 2 nam de grootte van de hemine-nanodeeltjes af tot ongeveer 122,4 nm. Bij een pH van 7 nam de grootte van de nanodeeltjes toe tot 293,6 nm, en deze nam aanzienlijk toe (P < 0,05) onder alkalische omstandigheden (een pH van 9 en 11,0) met gemiddelde diameters van meer dan 400 nm. De PDI van de nanodeeltjes was minder dan 0,5 in zure omstandigheden, wat aantoont dat er geen duidelijke aggregatie van nanodeeltjes is [22]. Het ζ-potentieel van nanodeeltjes nam af met toenemende pH-waarden (figuur 5b). De troebelheid van nanodeeltjes vertoonde dezelfde trend in grootte. Deze resultaten gaven aan dat nanodeeltjes stabiel waren in zure omstandigheden en onstabiel in alkalische omstandigheden.

Stabiliteit van hemine-nanodeeltjes. Het effect van verschillende pH-waarden (a ), temperaturen (c ), en zoutconcentraties (e ) op de deeltjesgrootte en PDI van nanodeeltjes. Het effect van verschillende pH-waarden (b ), temperaturen (d ), en zoutconcentraties (f ) op de ζ-potentiaal en troebelheid

De effecten van thermische behandeling (25, 60 en 80 ° C) gedurende 30 min op de grootte, PDI, ζ-potentiaal en troebelheid van hemine-nanodeeltjes werden bepaald (figuur 5c, d). Toen de temperatuur werd verhoogd, namen de deeltjesgrootte, PDI, ζ-potentiaal en troebelheid van nanodeeltjes iets toe. De resultaten suggereren dat de hemine-nanodeeltjes een uitstekende thermische stabiliteit hadden. Evenzo, naarmate de ionsterkte toenam, werden de grootte, ζ-potentiaal en troebelheid van nanodeeltjes ook verhoogd, wat de dissociatie van de nanodeeltjes veroorzaakte (Fig. 5e, f).