Nanodeeltjes-geleverde artesunaat versterkt antitumorale effectiviteit via mitochondriële apoptose-activering

Samenvatting

Artemisinine en hun derivaten bleken een breed spectrum aan antikankeractiviteiten uit te oefenen, en ze induceerden significante antikankereffecten in tumorkunsten. Artemisinine en hun derivaten kunnen snel worden geabsorbeerd en zijn wijdverspreid, waarbij ze selectief tumorkunsten doden. Omdat lage concentraties artesunaat primair afhankelijk waren van oncose om celdood in tumorkunsten te induceren, waren de antitumorale effecten ongunstig en beperkt. Om betere antitumorale effecten te verkrijgen, maakten we in deze studie gebruik van een nieuwe nanotechnologie om nieuwe artesunaat-geladen bovine serumalbumine (BSA) nanodeeltjes te ontwerpen om de mitochondriële accumulatie van artesunaat te bereiken en mitochondriële-gemedieerde apoptose te induceren. De resultaten toonden aan dat, in vergelijking met vrije artesunaat's betrouwbaarheid op oncotische dood, artesunaat-geladen BSA-nanodeeltjes hogere cytotoxiciteit vertoonden en hun significante apoptotische effecten werden geïnduceerd door de distributie van artesunaat in de mitochondriën. Deze bevinding wijst erop dat artesunaat-geladen BSA-nanodeeltjes de mitochondriële integriteit schaden en mitochondriële-gemedieerde celdood activeren door apoptose-gerelateerde proteïnen te upreguleren en de snelle vrijgave van cytochroom C te faciliteren.

Achtergrond

Artemisinine en hun derivaten zijn wijd gebruikt in de behandeling van malaria vanwege hun hoge antimalaria-activiteit en lage toxiciteit. Onderzoekers vonden ook dat artemisinine en hun derivaten significante antitumorale activiteit vertoonden dankzij hun weinig toxische bijwerkingen en betere verdraagzaamheid door patiënten [1]. Er werd gerapporteerd dat artesunaat (Ats) zeker tumorkelgroei remde en verder significante antikankereffecten in tumorkunsten induceerde [2,3,4]. Sommige experimenten gaven aan dat Ats na 48 uur verschillende graden van apoptose en oncose in tumorkunsten veroorzaakte, en dat de graden van apoptose en oncose afhankelijk waren van de dosis Ats. Bij lage concentraties induceerde Ats geen duidelijke apoptose in tumorkunsten en was Ats-geïnduceerde celdood vergezeld van oncose-achtige dood [5,6,7,8]. Om grotere antitumorale effecten te verkrijgen, werd een hogere dosering Ats toegepast, maar dit bevestigde de ernstige toxiciteit en beenmergonderdrukking verder. Daarom is het nodig om een effectieve behandeling te vinden die de effectieve dosering van Ats reduceert om de antitumorale efficiëntie te verbeteren [9,10,11]. Er werd gevonden dat de mitochondriën een belangrijke rol speelden bij het reguleren van de apoptotische en oncotische effecten van Ats. De mitochondriën waren ook betrokken bij het reguleren van het transductieproces van een wijd scala aan apoptotische signalen [12,13,14,15,16,17]. Toen de mitochondriën door geneesmiddelen werden aangevallen, werd hun permeabiliteit verhoogd en het membraanpotentiaal verlaagd, wat leidde tot endometriale zwelling van het mitochondriale membraan en de snelle vrijgave van cytochroom C uit de mitochondriën in het cytoplasma [18,19,20]. Verder werden sommige proteïnen uit de caspase-familie geactiveerd, en de cascadereactie van celdood geïnduceerd.

Om de antitumorale effecten van Ats te verbeteren, werden veel nieuwe technieken geprobeerd om de distributie van het geneesmiddel in tumorkunsten te verhogen of de gerichte afgifte van geneesmiddelen in celorganellen te verbeteren om celdood te induceren [21,22,23]. Nanodeeltjes (ND's) als een sleutelinstrument in gerichte kankerbehandeling zijn breed onderzocht, en ze hebben veelbelovende potentie getoond. Omdat ND's een kleinere deeltjesgrootte en een groot oppervlak kenmerken, kunnen ze de bloedsomloop via de capillairen binnengaan en door de endothelelecellen gaatjes passeren en migreren naar de tumorplaats, wat een gerichte medicijndistributie bereikt en de biobeschikbaarheid van het geneesmiddel verbetert. Bovendien kunnen ND's de afgifte van het geneesmiddel controleren door de afbraak van biomateriaal in een langdurig en glad patroon, wat uiteindelijk de eliminatie halfwaarde verlengt, de effectieve bloedconcentratie verbetert, en de doseringsfrequentie verlaagt. Meest van alles kunnen medicijn-geladen ND's worden afgeleverd op specifieke locaties binnen de cellen, wat de behandelingsefficiëntie verbetert [24,25,26].

Om de antitumorale effecten van Ats bij lage concentraties te verbeteren, probeerden we nieuwe Ats-geladen bovine serumalbumine (BSA) ND's te ontwerpen. Vanwege de lage pH in tumorkunsten, resulteert de accumulatie van een groot aantal waterstofprotonen op het buitenste mitochondriale membraan of in de intermembraanruimte, tegelijkertijd is het binnenste mitochondriale membraan rijk aan negatieve lading door de chemische samenstelling en mitochondriale matrixsecretie, wat een electropositieve buiten- en negatieve binnen-transmembraanpotentiaal creëert die een gunstige levering van BSA mogelijk maakt. Vervolgens kan de massale accumulatie van Ats in mitochondriën effectief mitochondriële-gemedieerde apoptose triggeren. De resultaten toonden aan dat, in vergelijking met de typische oncotische dood geïnduceerd door vrije Ats, Ats specifiek in de mitochondriën werd overgedragen met de bemiddeling van BSA ND's en de mitochondriële-gemedieerde activatie van apoptose-gerelateerde caspase-proteïnen bevorderde. Dit ontbrandde significante celdood, wat de hogere cytotoxiciteit benadrukte.

Methoden

Materialen

BSA werd gekocht van Sigma-Aldrich Co. (St Louis, MO, VS), en Ats werd gekocht van de Guilin Pharmaceutical Corporation (Guilin, Volksrepubliek China). SMMC-7721 cellen en Plc cellen werden gekocht van het Instituut voor Biochemie en Celbiologie van de Chinese Academie van Wetenschappen (Shanghai, Volksrepubliek China). Alle andere gekochte chemicaliën waren van analytische graad; ze werden verkregen van diverse leveranciers.

Bereiding en karakterisering van Ats-geladen BSA ND's

Volgens de eerder gerapporteerde literatuur [27], werden Ats-geladen BSA ND's bereid via een ontwateringsmethode. Kortom, Ats-geladen BSA ND's werden bereid door snel 1,0 mL anhydrous alcohol met een bepaalde hoeveelheid Ats in 0,5 mL BSA-oplossing bij 37 °C te droppen tot opalescentie. Met de verwijdering van ethanol door rotatieverdamping, werden Ats-geladen BSA ND's verder uitgevallen uit het medium, en werd 8% glutaraldehyde in water (0,5 µL/mg BSA) toegevoegd om deeltjeskruislinking te induceren onder roeren van de suspensie over een periode van 24 uur. Ten slotte werden ND's verzameld en driemaal gewassen met gedemineraliseerd water om hun fysieke karakteristieken verder te analyseren, inclusief hun hydrodynamische diameter, polydispersiteitsindex (PDI), zetapotentieel, en morfologie met behulp van een Brookhaven Zetasizer (Brookhaven Instruments Corporation, Holtsville, NY, VS) en een transmissie-elektronenmicroscoop (JEM-1200EX; JEOL, Tokyo, Japan). De insluitefficiëntie van Ats in BSA ND's werd geschat met een eerder gerapporteerde methode [27].

MTT-toets

Twee soorten tumorcellijnen, SMMC-7721 cellen en Plc cellen, werden apart geïnculeerd met 20% fetale boviene serum (FBS). De celdichtheid werd aangepast tot 1 × 10⁶ cellen/mL door celtelling, en de celsuspensies werden verder gedilueerd tot 1 × 10⁵ cellen/mL. De gedilueerde suspensies werden verder apart in een 96-putplaat toegevoegd (100 µL per put, ongeveer 1 × 10⁴ cellen/put) voor continue incubatie van 24 uur bij 37 °C onder voorwaarden van 5% CO₂ en 95% O₂. Het medium werd vervangen door serumvrij medium in de aanwezigheid van ofwel vrije Ats ofwel Ats-geladen BSA ND's met verschillende concentraties Ats, en werd vervolgens 24 uur geïnculeerd. In totaal 50 µL van 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyl tetrazoliumbromide (MTT) (5 mg/mL) werd aan elke put toegevoegd en 4 uur geïnculeerd voor cultuurbeëindiging. Toen het tetrazoliumkleurstof MTT gereduceerd werd tot het onoplosbare formazan, werden de 96-putplaten gecentrifugeerd met 1000 toer/min voor 5 min, en het supernatant werd van elke put afgegoten, gevolgd door de toevoeging van 150 µL dimethylsulfoxide (DMSO), dat de kristallen volledig oploste. De absorbantie van de oplossing werd gemeten met een microplaatlezer (Syneray-2; BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT, VS) bij 490 nm.

Intracellulaire distributie van de BSA ND-groep in cellen

SMMC-7721 cellen en Plc cellen in de logaritmische fase werden geselecteerd en behandeld met trypsine digestie; de celconcentratie werd aangepast tot 1 × 10⁶ cellen/mL. Vervolgens werden de gekweekte cellen in een 6-put celkweekplaat toegevoegd voor adhesie, en het kweekmedium werd verwijderd gevolgd door de toevoeging van rhodamine B-gelabelde BSA ND's. De kern werd gekleurd met Hoechst (blauw) voor 15 min bij 37 °C, en de mitochondriën werden gekleurd door Mitotracker Green FM. De locatie van BSA ND's in cellen werd binnen de cellen getraceerd met behulp van confocale laserscannende microscopie (FluoView FV10i; Olympus Corporation, Tokyo, Japan).

Mitochondriale membraanpotentiaal verandering

JC-1 kan worden gebruikt om veranderingen in het mitochondriale membraanpotentieel te bepalen. Wanneer het mitochondriale membraanpotentieel hoog was, kon JC-1 vrij door het celmembraan gaan en aggregaten in de mitochondriën vormen, met een rode fluorescentie (opwekingsgolfengte, 525 nm; emissiegolfengte, 590 nm); toen het mitochondriale membraanpotentiaal daalde, werd JC-1 overgeplaatst van de mitochondriale matrix naar het celcytoplasma om een groen fluorescent monomeer te vormen (opwekingsgolfengte, 490 nm; emissiegolfengte, 530 nm). SMMC-7721 cellen en Plc cellen werden respectievelijk gezaaid in confocale schalen om een dichtheid van 1 × 10⁶ cellen/mL te bereiken voor continue incubatie van 12 uur. Vervolgens werd het kweekmedium weggegooid en serumvrij kweekmedium met de dispersie van Ats of Ats-geladen BSA ND's werd aan de schaal toegevoegd. Na 9 uur werd het medium weggegooid en de cellen tweemaal gewassen met PBS, gevolgd door de toevoeging van 2 mL JC-1 met een concentratie van 2 µmol/L; de cellen werden vervolgens 30 min geïnculeerd bij 37 °C in het donker. Een laserscannende confocale microscoop (FluoView FV10i; Olympus Corporation) werd gebruikt om de veranderende beeldvorming in het mitochondriale membraan te observeren.

ROS-productiemeting en kleuring van het endoplasmatisch reticulum (ER)

Cellen werden geïnculeerd met 20% FBS en de celdichtheid werd aangepast tot 1 × 10⁶ cellen/mL door celtelling; en de celsuspensies werden verder gedilueerd tot 1 × 10⁵ cellen/mL. De gedilueerde suspensies werden verder in 96-putplaten toegevoegd (100 µL per put, ongeveer 1 × 10⁴ cellen/put) voor continue incubatie van 24 uur bij 37 °C onder 5% CO₂ en 95% O₂. Ten tweede werden vrije Ats en Ats-geladen BSA ND's met de cellen geïnculeerd voor 6, 12, en 24 uur, gevolgd door continue incubatie met 10 µM van 2,7-dichloorfluoresceïne diacetaat (DCFH-DA; Sigma-Aldrich Co.) voor ongeveer 30 min. Ijs-koud PBS-buffer werd gebruikt om de cellen driemaal te wassen om de niet-geïternaliseerde ND's te verwijderen. De intracellulaire DCF-fluorescentie-intensiteit, die op 485 nm wordt opgewekt en op 530 nm geëmiteerd, werd gedetecteerd met een microplaatlezer (Synergy-2; BioTek Instruments) om de mate van oxidatieve stress te onderzoeken. De testgroepen werden behandeld met SMMC-7721 cellen en Plc cellen voor 24 uur, en de ER-Tracker Blue–White DPX sonde (Molecular Probes, Eugene, OR, VS) werd aan de cellen toegevoegd voor incubatie van 30 min. Na het weggooien van de laadoplossing en wassen van de cellen met PBS, werd de morfologische verandering van het ER waargenomen door confocale laserscannende microscopie.

Cel-oncose en apoptose evaluatie door flow cytometrie

Volgens het protocol van onze eerdere studie [28], werd een Annexin V–fluoresceïne isothiocyaanate (FITC)/propidium iodide (PI) kleurassay gebruikt om de cel-oncose en apoptose geïnduceerd door vrije Ats en Ats-geladen BSA ND's te evalueren. Cellen werden gelysed met trypsine en gezaaid in zes-putplaten met een concentratie van 1 × 10⁶ cellen/mL voor 24 uur continue incubatie. Vervolgens werd het kweekmedium verwijderd en serumvrij medium met vrije Ats en Ats-geladen BSA ND's werd aan de putten toegevoegd. Na behandeling werden de cellen verzameld en opgelost in Nicoletti-buffer (Beijing 4A Biotech Co., Ltd., Beijing, Volksrepubliek China) met PI- en FITC-gelabelde Annexin V (AV-FITC). De morfologische verandering van de cellen werd waargenomen door confocale laserscannende microscopie. Om de celdood- en oncose-ratios geïnduceerd door de Ats-geladen ND's te verifiëren, werden de percentages van vroege apoptotische (Q4), oncotische (Q2), necrotische (Q1), en levende cellen (Q3) gekwantificeerd door flow cytometrie.

Western blot analyse van apoptose-gerelateerde proteïnen en cytochroom C in cellen

Een western blot assay werd uitgevoerd om de niveaus van relatieve proteïnen te bepalen toen vrije Ats of Ats-geladen ND's met SMMC-7721 cellen werden geïnculeerd voor 24 uur. Cellen werden gelysed met ijs-koud radioimmunopercipitatie assay (RIPA) buffer met een protease-inhibitorcocktail en fosfataase-inhibitors (Roche, Basel, Zwitserland). Proteïneconcentraties werden bepaald met een gemodificeerde BSA-assay kit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, VS) en genormaliseerd voordat ze op 10% natrium dodecylsulfate (SDS)–polyacrylamide gel elektroforese (PAGE) werden geladen. De niveaus van de doelproteïnen werden gefotografeerd en geanalyseerd met een UVP gel analysesysteem (iBox Scientia 600; UVP, LLC., Upland, CA, VS).

Resultaten

Kenmerken van Ats-geladen BSA ND's en cellulaire vitaliteitstudie

Het werd waargenomen in Fig. 1a, b dat Ats-geladen BSA ND's een spherische vorm vertoonden, en homogene verdeeld waren met een lage PDI van 0,016. De gemiddelde deeltjesgrootte van Ats-geladen BSA ND's was ongeveer 99,9 ± 2,3 nm en het zetapotentieel was negatief en waardeerde rond -25,6 ± 4,3 mV. Het vrijgaveprofiel toonde een gladde en langdurige vrijgave die in Fig. 1c getoond wordt. In vergelijking met de snelle vrijgave van vrije Ats in medium in vitro, werd Ats ingesloten in de kern van BSA ND's langzaam gediffundeerd van het interieur van de ND's in het medium en toonde een gladde en langdurige vrijgavepatroon, dankzij de continue afbraak van BSA. Meer dan 85% van vrije Ats werd volledig vrijgegeven binnen de eerste 6 uur, terwijl de totale cumulatieve hoeveelheid geneesmiddel vrijgegeven uit de ND's in het medium binnen een 48-uursperiode 78,9% was. Dit gaf aan dat ND's de vrijgave van het geneesmiddel konden controleren via de afbraak van biomaterialen in een langdurig en glad patroon, dus de eliminatie halfwaarde verlengden, de effectieve bloedconcentratie verbeterden, en de doseringsfrequentie verlaagden.

MTT werd gebruikt om de remmende effecten van vrije Ats en Ats-geladen BSA ND's in SMMC-7721 cellen en Plc cellen op verschillende tijdstippen te onderzoeken. De resultaten (Fig. 1d, e) toonden aan dat de cytotoxiciteit van vrije Ats toenem met de toename van de medicijnconcentratie, en Ats-geladen BSA ND's toonden een geleidelijke verhoogde cytotoxiciteit. Dit bewijst dat Ats en Ats-geladen BSA ND's de groei van tumorkunsten remden en dat de remmingsratio afhankelijk was van de dosis Ats. In vergelijking met vrije Ats, toonden Ats-geladen BSA ND's hogere cytotoxiciteit en hogere gevoeligheid in beide cellen, en resulteerden in grotere celremming. Zoals getoond in Fig. 1d, e, veroorzaakte behandeling van beide cellen met Ats-geladen BSA ND's een significante afname in celvitaliteit na 24 uur in vergelijking met die van vrije Ats. De 50% maximaal inhibitieconcentratie (IC50) waarden voor de SMMC-7721 cellen en Plc cellen behandeld met Ats-geladen BSA ND's waren 50,1 en 44,9 µg/mL na 24 uur, respectievelijk, in vergelijking met de waarden van 69,2 en 74,9 µg/mL na 24 uur in cellen behandeld met vrije Ats. Dit gaf aan dat wanneer Ats in BSA ND's geladen was, het de intracellulaire locatie kon veranderen, bemiddeld door de ND's, en uiteindelijk meer cellen doodde.

In vitro cellulair opname van BSA ND's

De intracellulaire distributie en locatie van BSA ND's in beide typen tumorcellen werden waargenomen door confocale laserscannende microscopie, zoals getoond in Fig. 2. Na rhodamine B-gelabelde ND's 3 uur met cellen waren gecocultureerd, was rode fluorescentie duidelijk zichtbaar in het cytoplasma; met het verstrijken van de tijd, werden de meeste BSA ND's intracellulair geïternaliseerd en diffundeerden in het cytoplasma, met een versterkte tijdsafhankelijke rode fluorescentie. Het werd ook waargenomen dat BSA ND's in het cytoplasma geco-lokaliseerd waren met de mitochondriën, zichtbaar door het verschijnen van gele fluorescentie, wat diende om aan te geven dat de inherente rode fluorescentie van rhodamine B-gelabelde ND's en de groene fluorescentie geëmiteerd door de mitochondriale indicator MitoTracker® green FM samengevoegd waren. Dit bewijst dat de geïternaliseerde BSA ND's specifiek in de mitochondriën konden accumuleren, wat de mogelijkheid benadrukt dat Ats in de mitochondriën kan worden afgeleverd met de bemiddeling van BSA ND's.

Mitochondriale membraanpotentiaal analyse

Om te verduidelijken of Ats-geladen BSA ND's interfereren met de mitochondriale functie na de levering van Ats in de mitochondriën, werden veranderingen in het mitochondriale membraanpotentieel bepaald. Figuur 3 toonde aan dat na JC-1-kleuring, de meerderheid van de mitochondriën in tumorcellen behandeld met vrije Ats sterke rode fluorescentie en zwakke groene fluorescentie-intensiteit vertoonden. Dit suggereerde dat de meerderheid van JC-1 in een geaggregeerde toestand bestond, wat de integriteit van het mitochondriale membraan en een hoger potentieel versterkte. Integenstelling, toen JC-1 de Ats-geladen BSA ND's-behandelde cellen kleurde, vertoonden de mitochondriën in beide tumorcellen sterkere groene fluorescentie, wat aangeeft dat het mitochondriale membraan ernstig beschadigd was en het potentieel significant was gedaald. Saamgenomen bewijst dit dat Ats met succes in de mitochondriën werd afgeleverd met de bemiddeling van BSA ND's, wat resulteerde in mitochondriale membraandepolarisatie.

ROS-productiemeting en kleuring van het ER

Het was breed bevestigd dat de generatie van een groot aantal ROS fosfolipideperoxidatie in het binnenste mitochondriale membraan kan veroorzaken en ook een afname in het mitochondriale membraanpotentieel kan induceren, wat resulteert in de snelle vrijgave van cytochroom C. We gebruikten DCFH-DA als een fluorescentiesonde om de verandering van ROS te detecteren. DCFH-DA ging vrij door het celmembraan in de cel en werd getransformeerd in DCFH door esterase-hydrolyse. De gegenereerde DCFH kan niet door het celmembraan gaan, en kan gemakkelijk in de cellen geladen worden. Intracellulaire ROS oxideerden non-fluorescerende DCFH tot DCF met een groene fluorescentiekleur. Daarom kan DCF-fluorescentiedetectie het niveau van intracellulaire ROS aangeven.

Wanneer beide cellen behandeld werden met vrije Ats en Ats-geladen BSA ND's voor een bepaalde periode, was de hoeveelheid intracellulaire ROS ook toegenomen, met een tijdsafhankelijke relatie. In vergelijking met vrije Ats, was de generatie van ROS in SMMC-7721 cellen en Plc cellen behandeld met Ats-geladen BSA ND's significant verhoogd. Figuur 4a toonde aan dat de ROS-niveaus in SMMC-7721 cellen en Plc cellen blootgesteld aan Ats-geladen BSA ND's voor 48 uur waren toegenomen tot 1,53-voud en 1,28-voud, respectievelijk, in vergelijking met SMMC-7721 cellen en Plc cellen behandeld met vrije Ats. Dit ondersteunde het idee dat de ND's de productie van intracellulaire ROS versnelden. In vergelijking met de controlegroep en vrije Ats, en na behandeling met Ats-geladen BSA ND's, was de fluorescentiekleurintensiteit van de ER-Tracker Blue–White DPX als ER-specifieke kleurstof significant toegenomen, wat suggereerde dat ER-stress ook geactiveerd werd in de Ats-geladen ND-behandelde cellen met een corresponderende toename in het ROS-niveau. Deze bevinding benadrukte dat Ats specifiek in de mitochondriën gelokaliseerd was, bemiddeld door BSA ND's; dit leidde tot een significante toename in het niveau van zuurstofvrije radicalen in de cellen, wat de inductie van ER-stress triggerde en het mitochondriale pad activeerde om caspase-afhankelijke cellulaire apoptose te induceren.

Evaluatie van cel-apoptose en necrose

Cellen werden behandeld door een Annexin V-FITC/PI kleurassay. Levende cellen bounden niet aan Annexin V-FITC/PI, dus geen fluorescentie verscheen. Apoptotische cellen bounden niet aan PI, maar werden gekleurd met Annexin V-FITC, met groene fluorescentie als resultaat. Integenstelling, voor de oncotische cellen, waren hun celmembranen tot enige mate beschadigd, en de celkernen waren gedileerd om in stukken te breken, wat zowel groene als rode fluorescentie liet zien. Zoals getoond in Fig. 5a, in vergelijking met de controlegroep, toen vrije Ats en Ats-geladen ND's met cellen werden geïnculeerd voor 24 uur, werden sterke groene en rode fluorescentie waargenomen in de cellen, wat aangeeft dat vrije Ats en Ats-geladen BSA ND's tumorcel-oncose en apoptose induceerden. Vooral na behandeling met Ats-geladen BSA ND's, waren de kleurintensiteiten verkregen van Annexin V-FITC en PI significant toegenomen, wat suggereerde dat de graden van oncose en apoptose significant verhoogd waren in de Ats-geladen ND-behandelde cellen.

De percentages van vroege apoptotische (Q4), oncotische (Q2), necrotische (Q1), en levende cellen (Q3) werden getoond in Fig. 5b. Deze bevinding toonde aan dat wanneer cellen behandeld werden met vrije Ats, de oncotische ratios geleidelijk toenamen tot 24,4 en 4,6%, en de apoptotische ratio bleef op 4,9 en 7,1% in SMMC-7721 cellen en Plc cellen, respectievelijk, wat suggereerde dat vrije Ats het optreden van oncose en apoptose triggerde om celdood te veroorzaken. Integenstelling, Ats-geladen BSA ND's verbeterden de cel-apoptose- en oncose-ratio's significant. De apoptotische ratios waren significant toegenomen tot 10,9% in SMMC-7721 cellen en tot 11,5% in Plc cellen. De oncotische ratios waren toegenomen tot 29,0% in SMMC-7721 cellen en tot 21,6% in Plc cellen. Dit gaf aan dat de mitochondriële levering van Ats met de bemiddeling van BSA ND's de dood van tumorkunsten versnelde door de oncotische en apoptotische effecten te versterken. Ats-geladen BSA ND's triggerden het apoptotische signaaltransductieproces en bevorderden de mitochondriële-gemedieerde cascadereactie van cellulaire apoptose.

Western blot analyse

Om de afhankelijkheid van celdood van de apoptose geïnduceerd door vrije Ats en Ats-geladen ND's te verkennen, werd een western blot assay uitgevoerd om de expressie van apoptose-proteïnen te detecteren. Er werd gevonden dat in Ats-geladen ND-behandelde SMMC-7721 cellen, het intracellulaire expressieniveau van het Bax-proteïen significant toegenomen was (Fig. 6). Deze bevinding suggereerde dat met de hulp van BSA ND's, Ats in de mitochondriën accumuleerde en mitochondriële dysfunctie veroorzaakte. Het cytoplasmatische Bax-monomeerproteïen werd overgeplaatst naar het buitenste mitochondriale membraan en onderging oligomerisatie, vormend een proteïenkanaal in het buitenste mitochondriale membraan, wat verder leidde tot een toename in membraanpermeabiliteit. Het expressieniveau van cytochroom C in het cytoplasma was ook bijzonder en significant verhoogd, en de expressies van caspase-3 en caspase-9 bleken een opwaartse trend te vertonen. Daarom, door de hogere membraanpermeabiliteit van de mitochondriën, werd cytochroom C snel in het cytoplasma vrijgegeven, wat celdood-signalerende proteïnen (caspases) activeerde en de cascadereactie van cellulaire apoptose bevorderde. Integenstelling, vrije Ats had geen significant verschil op de expressie van apoptose-gerelateerde proteïnen en cytochroom C, wat suggereerde dat vrije Ats geen mitochondriële-gemedieerde celdood geactiveerd had en primair op oncose steunde om celdood te veroorzaken. BSA ND's versterkten de accumulatie van het geneesmiddel in de mitochondriën en activeerden mitochondriële-gemedieerde apoptotische effecten, wat leidde tot significante apoptose en het verhogen van de expressies van de primaire apoptose-relevante proteïnen, zoals getoond in onze western blot analyses.

Discussie

Oncose en apoptose vertegenwoordigen de twee verschillende manieren waarop cellen doodgaan. Apoptose is een actief proces van geprogrammeerde celdood dat voorkomt in meercellige organismen. Oncose, aan de andere kant, beschrijft een caspase-onafhankelijke celdood die gekenmerkt wordt door zwelling, verhoogde permeabiliteit, en membraanruptuur, wat vaak als necrose wordt aangeduid. Deze vorm van celdood wordt als toevallig en onbeheerst beschouwd. Gebaseerd op ons onderzoek vonden we dat Ats de groei van tumorkunsten remde en dat de remmingsratio afhankelijk was van de dosis Ats. Ats was primair afhankelijk van de graad van oncose en leidde tot celdood; het activeerde ook caspase-onafhankelijke celdood in de vorm van oncose. Integenstelling, en los van het optreden van duidelijke oncose-achtige dood, toen tumorkunsten behandeld werden met Ats-geladen BSA ND's, werden Ats-geladen BSA ND's geïternaliseerd in het cytoplasma en snel in de mitochondriën gelokaliseerd om Ats vrij te geven, bemiddeld door de ND's. Ats in de mitochondriën genereerde ROS en triggerde ER-stress; het activeerde verder de mitochondriële-gemedieerde caspase-afhankelijke celdood-apoptotische weg door het mitochondriale membraanpotentieel te verlagen, cytochroom C vrij te geven, en de proteïnexpressies van Bax, gekleefde caspase 3, en caspase 9 te bevorderen. Saamgenomen verhoogden Ats-geladen BSA ND's de mitochondriële levering van Ats en versterkten de graad van oncose en apoptose om celdood te induceren, wat de cytotoxiciteit van het geneesmiddel verhoogde en significante celdood induceerde.

Conclusies

Kortom, we hebben verduidelijkt dat vrije Ats in de tumorkunsten sterk afhankelijk was van de graad van oncose om de proliferatie van tumorkunsten te remmen in de vorm van een oncose-achtige dood; dus was de cytotoxiciteit van het geneesmiddel beperkt en ongunstig. Integenstelling, Ats-geladen BSA ND's activeerden de mitochondriële apoptotische weg en triggerden tegelijkertijd oncotische effecten; samen versterkten ze de synergistische antitumorale effectiviteit van Ats. De resultaten van deze studie benadrukten de betekenis van Ats-geladen BSA ND's in de verbetering van de cytotoxische en apoptotische effecten van Ats, en ze betekenen verder de rol van BSA ND's in het diversificeren van de paden van celdood geïnduceerd door Ats. In vergelijking met vrije Ats, induceerden Ats-geladen BSA ND's grotere cytotoxiciteit en significante celdood-apoptotische effecten in tumorkunsten.